בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

ובתאי אנדותל (EPCs) מעורבים באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של EPCs אדם מדם היקפי, כמו גם זיהוי של פוטנציאל הנדידה שלהם נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב.

המטרה הכוללת של הליך בידוד תאים זה ופרוטוקול הנדידה היא להראות דרך אמינה לבודד תאי אב אנדותל ואת פוטנציאל הנדידה שלהם לעבר דגימות סרום של חולים כירורגיים לבביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתחדשות רירית האנדותל וכלי הדם, הדרושה לאחר ניתוח לב עקב איסכמיה ופציעות הקשורות לזלוף מחדש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדרך הפשוטה יחסית לבידוד תאי אב, כולל בידוד מקדים של תאים חיוביים CD-34.

בנוסף למקרי מוות, סיבוכים גדולים של ניתוח הלב נותרו שכיחים מדי. הדגשת הצורך לזהות את הסיכון לקשר ומנגנוני ההגנה במהלך ניתוח לב. תאי אב אנדותל מעורבים באופן מכריע בניאו-וסקולריזציה של רקמות איסכמיות וידועים כמספקים תכונות מגנות על הלב.

כדי להתחיל בניסוי, ערבבו דם, אחד לאחד, עם PBS ללא סידן וללא מגנזיום. הוסף 15 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות לצינור של 50 מיליליטר. ולאט לאט שכב את הדם המדולל על גבי תמיסת שיפוע הצפיפות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות. בעזרת פיפטת פלסטיק סטרילית, אספו בזהירות את שכבת מעיל האפי של כל צינור, והניחו אותה בצינור אחר תוך הימנעות מתמיסת שיפוע הצפיפות. יש לדלל את התא החד-גרעיני של הדם ההיקפי, או שבר PBMC, עם לפחות שלושה נפחים של PBS ולערבב את התמיסה על ידי פיפטינג.

צנטריפוגה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב-200 פעמים G.לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מדיום גידול תאי אנדותל, MV-2. לאחר השעיית התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן CD-34 אנושי לכל שכבת באפי משומשת וסובב את התאים. הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצופים דקסטרן לכל מעיל באפי משומש וסובב את התאים.

לאחר הדגירה, העבר את המתלה לצינורות פקס עם מקסימום שלושה מיליליטר לכל צינור. לאחר מכן, הכנס את צינורות הפקס למגנטים והמתן חמש דקות. השליכו את הסופר נטנט מבלי לשלוף את צינורות הפקס מהמגנט.

לאחר מכן, מחוץ למגנטים, השעו מחדש את התאים בכל שפופרת פקס עם שלושה מיליליטר של מדיום MV-2. העבירו את מתלה התאים לצלוחיות T-75 מצופות מראש. הוסף 17 מיליליטר בינוני MV-2 לכל בקבוק.

כדי להכין את מבחן הנדידה, השתמש בפיפטה כדי להסיר את המדיום מתאי האב האנדותל או מה-EPC, בבקבוק T-75. שטפו את התאים בחמישה מיליליטר מי מלח או PBS עם פוספט, ונערו בזהירות את הבקבוק. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף חמישה מיליליטר של פתרון ניתוק תאים מסחריים.

לאחר מכן, המתינו עד שהתאים ינותקו תחת מיקרוסקופ אור. האץ את הניתוק על ידי הקשה בזהירות על תחתית הבקבוק. כאשר התאים מנותקים, הוסיפו במהירות חמישה מיליליטר של מדיום שלם MV-2, והעבירו את תרחיף התא לצינור אחר.

צנטריפוגה של התאים ב -2, 000 x G למשך חמש דקות. לאחר גלולת התאים, השעו אותם מחדש בחמישה עד עשרה מיליליטר PBS. וצנטריפוגה אותם שוב.

השעו מחדש את התאים בחמישה עד עשרה מיליליטר של PBS והמשיכו בצנטריפוגה. השעו מחדש את כדור התא במדיום מורעב MV-2. לאחר מכן, יש לדלל את דגימת הסרום 1 עד 5 במדיום רעב MV-2.

הכן את צלחת הנדידה על ידי הוספת 235 מיקרוליטר מדגימת הסרום לתא התחתון. הוסף את התוספת זמן קצר לפני הוספת תמיסת התא. לאחר מכן, הוסף 75 מיקרוליטר מתמיסת התא לתא העליון.

אפשר ל-EPC לעבור. הסר את החדר העליון המכיל את כל התאים הלא נודדים. הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 3.6 אחוז כולל צבע הוכסט מדולל ב-1 עד 1,000.

צנטריפוגה את הצלחת תוך זמן קצר כדי להכניס את כל התאים לאותו מישור מוקד ב-2,000 x G למשך דקה עד שתיים. כדי להימנע מחפצי אוטו-פלואורסצנטיות בסרום, כמת את התאים הנודדים על ידי צילום חמש תמונות לבאר בהגדלה של פי 100 תחת מיקרוסקופ. לבסוף, ספרו את התאים שהועברו באמצעות התוכנה האוטומטית למחצה.

ניתוח פקס של ה-EPCs מאמת את ספיגת ה-acLDL, כמו גם את הביטוי של CD-31 על פני אוכלוסיית התאים המבודדים. בידוד הניתוח של acLDL ו-CD-31 מגלה התפלגות הומוגנית של כל סמן. אליסו לזהות את ההשפעה של ניתוח לב לאחר פגיעה בשריר הלב על ריכוזי רמות הסרום במחזור הדם של MIF, CXCL12, CXCL8 ו-VEGF.

דגימות סרום נלקחו לפני ותוך כדי הניתוח. רמות הסרום של MIF, CXCL12 ו-CXCL8 הראו עלייה משמעותית תוך ניתוחית בהשוואה לערכי הבסיס. לעומת זאת, ריכוזי ה-VEGF לא הראו שינויים משמעותיים.

בדיקת הגירה ex vivo, תוך שימוש בדגימות סרום שנלקחו לפני ובמהלך הניתוח בוצעה באמצעות EPCs שבודדו ממתנדבים בריאים, וחשפה שיעור נדידה מוגבר משמעותית לעבר הדגימות שנלקחו תוך ניתוח. בעקבות טכניקה זו, ניתן לבודד בקלות תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, על מנת לענות על שאלות דלקתיות נוספות.