ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכוון את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לעבר התוכנית ההמטופויאטית הפרימיטיבית או הסופית באמצעות גישת מניפולציה של אותות ספציפיים לשלב. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח רבות בתחום, כגון הבנת מווסתי האותות והשעתוק של המטופואיזיס סופי אנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במניפולציה ספציפית לשלב באופן מיידי.

המדגימה את ההליך הזה היא קאריסה דגה, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, השג קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שהוכנו בעבר או HPSCs הגדלים על סיבים עובריים של עכברים או MEFs למפגש של 70% עד 80% בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי CO2. שאפו את אמצעי ה-HPSC והוסיפו מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס 0.25% טריפסין EDTA לכל באר למשך דקה אחת.

לאחר דקה אחת, שאפו את הטריפסין והוסיפו מיליליטר אחד של מדיה לכל באר. בעזרת מגרד תאים מגרדים את התאים מהצלחת. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לכל באר.

בעזרת פיפטה סרולוגית של שני מיליליטר, יש לשלש את התאים שלוש עד חמש פעמים כדי לפרק גושים גדולים. ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את ה-HPSCs ב-330 x G למשך חמש דקות.

לאחר הסיבוב, הוסף מדיית HPSC והשהה מחדש את התאים. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של HPSCs תלויים מחדש לכל באר של כלי הפלסטיק המקודדים ב-MAT ודגר את התאים למשך הלילה. לאחר 24 שעות יש לשאוב את המדיה ולהחליף אותה ב-37 מעלות צלזיוס 0.05% טריפסין EDTA למשך דקה אחת.

שאפו את ה-Trypsin EDTA. הוסף מדיית מלאי מיליליטר אחת וגרד את התאים במרץ בעזרת מגרד תאים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של אמצעי כביסה.

בעזרת פיפטה סרולוגית של שני מיליליטר, יש לשלש את התאים שלוש פעמים ולהעביר אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב-220 x G למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את המדיה, הוסיפו 20 מיליליטר של חומר כביסה והשתמשו בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי להשעות מחדש בעדינות את התאים.

לאחר צנטריפוגה ושאיפה, השעו מחדש בזהירות את הגופים העובריים או ה-EBs במדיה Day Zero. הוצא שני מיליליטר של אמצעי התמיינות המכילים EBs לכל באר של צלחת תרבית תאים עם שש בארות עם היצמדות נמוכה באמצעות פיפטה סרולוגית של עשרה מיליליטר. מקם את ה-EBs בחממה מרובת גזים של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי CO2, חמישה אחוזי O2.

עשרים וארבע שעות לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מדיה ליום הראשון. דגרו את התאים למשך הלילה בחממה מרובת גזים. לאחר 18 שעות, קצרו בעדינות את ה-EBs עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר וסובבו אותם ב-100 x G למשך חמש דקות.

שטפו ושלבו את כל התרבות עם עשרה מיליליטר של מדיום Dulbecco Modified או IMDM של Iscove. לאחר סיבוב התרבית שוב ב -100 X G למשך חמש דקות להסרת פסולת, שאפו את המדיה. השעו מחדש בעדינות את ה-EBs עם Day Two Media באמצעות פיפטה P1000.

לאחר מכן הוציאו שני מיליליטר של ה-EBs לבאר לתוך צלחות תרבית תאים בעלות שש בארות עם היצמדות נמוכה. הוסף שלושה CHIR99021 מיקרומולריים או IWP2 כדי לציין אבות המטופואטיים סופיים או פרימיטיביים בהתאמה. דגרו את הצלחת בחממת מולטיגז של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות.

לאחר 30 שעות, בודדו את ה-EBs עם פיפטה סרולוגית של שני מיליליטר על ידי העברתם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומרבי אותם ב-330 x G למשך חמש דקות. השעו בעדינות את ה-EBs ושטפו אותם עם 10 מיליליטר IMDM. השעו מחדש את ה-EBs במדיה של היום השלישי והפיצו שני מיליליטר לכל באר של צלחות שש בארות בעלות היצמדות נמוכה.

דגרו את התאים בחממה מרובת גזים של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר 72 שעות דגירה, הוסף שני מיליליטר של Day Six Media לכל באר. לאחר מכן דגרו את ה-EBs בחממה מרובת גזים של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות נוספות.

בודדו את ה-EBs שטופלו ב-CHIR99021 ביום השמיני של ההתמיינות והמשיכו לסעיף הבא. צנטריפוגה את ה-EBs ב-330 x G למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ל-EBs. מערבלים את ה-EBs למשך חמש שניות ודוגרים על ה-Ebs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת עצירה וצנטריפוגה את ה- EBs.

ואז שאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש את ה-EBs בחמישה מיליליטר של קולגנאז II.מערבולת את הצינור למשך חמש שניות ולאחר מכן דגרו על ה-EBs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 60 דקות, מערבל את ה-EBs למשך חמש שניות והוסף חמישה מיליליטר של תמיסת עצירה.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר FACS. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון כדי להסיר גושי תאים לא מפורקים. המשך עם תיוג נוגדנים ובידוד FACS של אבות אנדותל המוגנים חיוביים ל-CD34.

לאחר בידוד FACS, השעו מחדש את התאים במדיית HE. מחלקים את התאים בכמות של 50 מיקרוליטר בצלחת תרבית עם 96 בארות עם היצמדות נמוכה ואז מדגרים את התאים למשך הלילה. למחרת בבוקר, האבות ההמטופויאטיים צריכים להצטבר לגושים של שישה עד עשרה תאים.

העבירו בעדינות את נפחי 50 המירוליטר של תאים שנצברו מחדש למרכז צלחת מקודדת MAT של 24 בארות. הנח בעדינות את הצלחת בחממת הרב-גז למשך ארבע עד שש שעות עד לחיבור התאים. לאחר ארבע עד שש שעות, כדי לאפשר לתאים להתחבר, הוסף לאט לאט מיליליטר אחד של מדיה HE טרייה שהוכנה לכל באר.

דגרו את התאים בחממה הרב-גזית עד שהתאים ההמטופואטיים נראים לעין. לאחר מכן, קצרו את האבות ההמטופואטיים הסופיים על ידי הסרה עדינה של אמצעי ה-HE מהתאים ומעבר דרך מסננת תאים של 40 מיקרון כדי לאסוף זרימה. עבור התאים הדבקים הנותרים, הוסף לתאים 0.5 מיליליטר 0.25% טריפסין EDTA ודגר אותם בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר טריפסיניזציה, הוסף 0.5 מיליליטר תמיסת עצירה לכל באר. העבירו את התאים דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרון כדי לאגד את כל התאים הדבקים והלא נדבקים יחד ולסובב את התאים. הוסף 2,000 עד 10,000 תאים מבודדים של FACS לבאר אחת של תאי OP9 DL4 במדיה OP9.

דגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. כדי להעביר את התאים כל ארבעה עד חמישה ימים, יש לשלש את התאים בעזרת פיפטה של מיליליטר. עוברים דרך פילטר 40 מיקרון להסרת גושים.

לאחר צנטריפוגה, שאפו את התקשורת. השעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיה טרייה של תאי T והניחו אותם על תאי OP9 DL4 טריים. לאחר לפחות 21 יום של תרבית קרה, יש לשלש את התאים במרץ ולעבור דרך מסנן של 40 מיקרון כדי להסיר פסולת תאים.

צנטריפוגה ב-330 x G למשך חמש דקות ושואבים את הסופרנטנט ואז ממשיכים עם ציטומטריית זרימה סטנדרטית. ציטומטריית זרימה מראה כי תרביות התמיינות שטופלו ב-IWP2, מניבות אוכלוסייה חיובית מובהקת ל-CD34, CD43 שלילית ו-CD34 חיובית ל-CD43 נמוכה. בעוד שלתרביות התמיינות שטופלו ב-CHIR יש פחות מ-1% תאים חיוביים ל-CD43 ביום השמיני של ההתמיינות.

אבות המטופויאטיים פרימיטיביים שמקורם בתנאי IWP2 שבודדו ביום התשיעי יובילו לאבות אריתרואידים ומיאלואידים פרימיטיביים בעיקר במבחני המתיל צלולוז. האוכלוסייה השלילית CD34 חיובית CD43 שמקורה בטיפול CHIR99021 היא אוכלוסייה הטרוגנית המכילה אבות אנדותל כמו גם CD34 חיובי, CD43 שלילי, CD73 שלילי, CD184 שלילי CD184, אשר כאשר מבודדים על ידי FACS יוצרים בתחילה שכבה חד-שכבתית של תאים דמויי אנדותל אשר לאחר מכן עוברת מעבר אנדותל להמטופויאטי וכתוצאה מכך עגול, שביר, תאים המטופויאטיים שאינם נצמדים. ניתן להעריך תאים המטופויאטיים אלה על ידי זרימה ציטומטרית לביטוי CD34 ו-CD45.

ניתן להשתמש באבות המטופויאטיים המבודדים ממבחני EHT במבחני מתיל צלולוז ולהוליד יחידות גדולות, דמויות פרץ, יוצרות מושבה אריתרואידית, יחידות יוצרות מושבה אריתרואידית קטנה ואבות מיאלואידים. ניתוחים ציטומטריים מייצגים אלה של פוטנציאל מבחני לימפוציטים מסוג T CHIR99021 מ-CD34 חיובי, CD43 שלילי, CD73 שלילי, CD184 שלילי CD184 ואבות המטופויאטיים שליליים שמקורם ב-IWP2, CD43 שלילי CD43 מראים נוכחות של אוכלוסייה חיובית CD45, CD56 שלילית, חיובית CD4, חיובית CD8 באבות שמקורם ב-CHIR המעידה על הפוטנציאל ההמטופויאטי בתוך אוכלוסיית הקלט החיובית CD34. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבדיל בין תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לכמות פרימיטיבית או סופית של אבות המטופויאטיים.