Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

המטרה הכוללת של בדיקת לימפוציטים מבוססת תפרחת זו היא לזהות אימונומודולטורים חדשים של מולקולות קטנות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי מנגנון ההפעלה והעיכוב של לימפוציטים. היתרון העיקרי של פונקציה פנוטיפית ובדיקה זו, שניתן להתאים אותה לגילוי תרופות.

מי שידגים את ההליך יהיה אחמד פודה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. מתחת למכסה מנוע סטרילי, יש לחטא את הפרווה של נקבת עכבר Nurr77 GFP בת שישה עד שמונה שבועות עם 70% אתנול, ולהניח את החיה על צדה הימני. לאחר מכן, בצע חתך בעור ובשרירים של רבע הבטן השמאלית העליונה, ואתר והסר את הטחול, והניח את הרקמה למדיום טחול על קרח.

לאחר איסוף כל הטחול, העבירו את הרקמות לצלחת תרבית תאים בגודל 10 סנטימטרים רבועים המכילה חמישה מיליליטר של מדיום טחול שחומם מראש, והשתמשו בבוכנת מזרק סטרילית כדי לרסק את הרקמות עד שהתמיסה עכורה. לאחר ריסוק נרחב במדיום הטחול, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר כדי להסיר כל פסולת, וצנטריפוגה את תרחיף התא הבודד שנוצר. השעו מחדש את הגלולה בשניים עד שלושה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות, וספגו את התגובה עם חמישה מיליליטר RPMI, או מאגר מתאים אחר, לאחר 20 עד 30 שניות.

לאחר מכן אסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, והשהה מחדש את הגלולה ב-twp מיליליטר של מדיום טחול לספירת תאים. כדי לבודד את תאי ה-T, יש לצנטריפוגה שוב את התאים, ולהשעות מחדש את הגלולה במדיום RPMI חופשי בסרום בריכוז אחד כפול 10 לשבעה תאים למיליליטר. העבירו את התאים לשפופרת פוליסטירן של חמישה מיליליטר, והניחו בצד 100 מיקרוליטר של טחול שישמש מאוחר יותר להערכת טוהר.

לאחר מכן, הוסף לתאים 50 מיקרוליטר למיליליטר של סרום חולדה רגיל, ואחריו תוספת של 50 מיקרוליטר למיליליטר של קוקטייל נוגדנים לבידוד תאי T עם ערבוב עדין. לאחר 10 דקות, דגרו את התאים עם חרוזים מגנטיים מצומדים של סטרפטווידין למשך שתי דקות וחצי. לאחר מכן, הוסף מדיום נטול סרום לתאים לנפח סופי של שניים וחצי מיליליטר, והנח את הצינור במגנט בידוד תאים למשך שלוש דקות.

בסוף הדגירה, החזק את הצינור במגנט, שפכו את הסופרנטנט לתוך צינור פוליסטירן חדש בתנועה אחת. לאחר מכן ניתן לספור את תאי ה-T. זרעי תאי T לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות בריכוז של 2.5 כפול 10 עד חמישית תאים לבאר המכילה 200 מיקרוליטר של מדיום טחול טרי לבאר.

הוסף חרוזים מגנטיים רקומביננטיים אינטרלוקין 7 ו- CD3 / CD28 לבארות המתאימות, והנח את הצלחת בחממת תרבית תאים. 12 שעות לאחר מכן, יש לשלש בעדינות את תרחיף התאים בכל באר כדי לפרק את כל אגרגטים של תאי חרוזים. לאחר מכן העבירו את מתלי התאים מכל באר לצינורות פוליסטירן בודדים של חמישה מיליליטר.

לאחר שכל התאים נאספו, הניחו כל צינור של תאים לתוך מגנט ההפרדה למשך חמש דקות בכל פעם, ושפכו את הסופרנטנטים כאשר הצינור עדיין בתוך המגנט, לתוך צינורות פוליסטירן חדשים בסוף כל דגירה. לאחר מכן אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה, ומשעים מחדש את הכדורים במדיום טחול טרי בריכוז כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר. לבדיקת תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות, צלח 40 מיקרוליטר תאים לבאר בצלחת של 384 בארות, וטפל בבארות המתאימות עם התרופה או הרכב הנבחר לתקופת הטיפול הרצויה בחממת תרבית התאים.

30 דקות לפני ניתוח ה- GFP, יש לצבוע את התאים בריכוז המתאים של תמיסת Hoechst, ולהפיץ היטב את הכתם בפיפטינג עדין. כאשר כל הבארות נצבעו, צנטריפוגה את הצלחות כדי לאסוף את התאים בתחתית הבארות, ואפשרו לתאים לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הצלחת לפי הוראות היצרן.

לאחר מכן, הגדר את היעד ל-40X ומעלה. הגדר מצלמה מספר ארבע עבור מנורת ה-UV ולאחר מכן הגדר מצלמה מספר אחת עבור לייזר 488. טען את הצלחת למערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה.

לאחר מכן, הגדר את מערכת הסינון האוטומטית של תוכן גבוה קונפוקלי לקריאת שישה עד 10 שדות לבאר עם שתי קריאות עוקבות לכל שדה, ב-488 ננומטר ואור UV. תאי T חיוביים CD3 מייצגים כ-30% מטחול עכבר נתון, ומדגימים ביטוי GFP בסיסי של 10%. בעקבות גירוי חרוזי קולטן תאי T CD3/CD28, נצפתה עלייה של פי חמישה עד שישה באחוז ביטוי ה-GFP.

כמו כן, תאי B חיוביים ל-CD19 מייצגים 50 עד 55% מכלל הטחול עם ביטוי GFP בסיסי דומה לזה של תאי T לא פעילים. מעניין שגירוי קולטני תאי B באמצעות IgG, IgM ו-CD40L רקומביננטי נגד עכברים, מעורר רק עלייה טריוויאלית בביטוי GFP. לאחר בידוד חרוזים מגנטיים כפי שהודגם זה עתה, תאי ה-T החיוביים CD3 המבודדים עדיין מציגים ביטוי GFP בסיסי של 10%.

גירוי חרוזי CD3/CD28 לעומת זאת, גורם לוויסות משמעותי של תגובת ה-GFP. באופן דומה, לאחר בידוד חרוזים מגנטיים של תאי B, תאי B המופעלים המטוהרים מציגים ביטוי גבוה יותר של GFP בהשוואה לתאי B מופעלים בטחול. בניסוי מייצג זה, סינון ראשוני בתפוקה גבוהה של 4398 תרכובות חשף מספר מפעילים ומעכבים של הפעלת תאי T.

אבל ביטוי ה-GFP שנצפה של תאי ה-T המגורים, גבוה פי 20 מזה שנמדד עבור תאי ה-T הלא מגורים. מאפשר יצירת חלון של אזור פעולה שבו ניתן לזהות בקלות את התרכובות המעכבות של GFP. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 36 עד 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספור את התאים לאחר כל שלב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA או Western Blotting כדי לענות על כל שאלה נוספת אחרת. טכניקה זו תסלול את הדרך לאימונומודולציה של גילוי תרופות במכרסמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהפעיל תאי T או B שמקורם בלוחות העכבר Nurr77 GFP.