Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

המטרה הכללית של בדיקת לימפוציטים מבוססת פלואורסצנציה זו היא לזהות מודולטורים אימונולוגיים חדשים של מולקולות קטנות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה בנוגע למנגנון של הפעלה ועכבה של לימפוציטים. היתרון המרכזי של בדיקת התפקוד הפנוטיפית הזו הוא שניתן להתאימה לתהליכי גילוי תרופות.

את הפרוצדורה ידגים אחמד פודה, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו. תחת מנדף עבודה סטרילי, חטא את הפרווה של עכברה נקבה מסוג Nurr77 GFP בת שבועיים עד שמונה שבועות בעזרת 70% ethanol, והנח את בעל החיים על צדו הימני. לאחר מכן, בצע חתך בעור ובשרירים של הרבוע הבטני השמאלי העליון, איתר והוצא את הטחול, והעבר את הרקמה לתוך תווך splenocyte על קרח.

לאחר איסוף כל הטחונים, העבירו את הרקמות לצלחית תרבית תאים של 10 סנטימטרים רבועים המכילה חמישה מיליליטר של מצע לספלנוציטים שחומם מראש, והשתמשו בבוכנה של מזרק סטרילי כדי למעוך את הרקמות עד שהתמיסה תהיה עכורה. לאחר מעיכה נרחבת במצע לספלנוציטים, סננו את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 70 מיקרון לתוך מבחנה של 50 מיליליטר כדי להסיר שאריות, וסבבו במרכזפוגה את תרחיף התאים הבודדים שהתקבל. השעיקו מחדש את המשקע בשני עד שלושה מיליליטר של בופר לליזיס של תאי דם אדומים, ועצרו את התגובה באמצעות חמישה מיליליטר של RPMI, או בופר מתאים אחר, לאחר 20 עד 30 שניות.

לאחר מכן, אספו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה נוסף, והשעיקו מחדש את המשקע בשני מיליליטר של תווך לספלינוציטים לצורך ספירת תאים. כדי לבודד את תאי ה-T, סבבו את התאים שוב בצנטריפוגה, והשעיקו מחדש את המשקע בתווך RPMI ללא סרום בריכוז של 1×10⁷ תאים למילליטר. העבירו את התאים לשפופרת פוליסטירן של חמישה מילליטר, והפרישו מנה של 100 µL של ספלינוציטים לשימוש מאוחר יותר לצורך הערכת טוהר.

בשלב הבא, יש להוסיף לתאים 50 µL למילליטר של סרום חולדה נורמלי, ולאחר מכן להוסיף 50 µL למילליטר של תערובת נוגדנים לבידוד תאי T תוך ערבוב עדין. לאחר 10 דקות, יש לדגור את התאים עם חרוזי מגנט מצומדים לסטראפטוואידין למשך שתי דקות וחצי. לאחר מכן, יש להוסיף לתאים מצע ללא סרום לנפח סופי של 2.5 mL, ולהניח את המבחנה במגנט לבידוד תאים למשך שלוש דקות.

בסיום הדגירה, תוך החזקת המבחנה במגנט, שפכו את העלייה (supernatant) למבחנה חדשה מפוליסטירן בתנועה אחת. לאחר מכן ניתן לספור את תאי ה-T. זרעו את תאי ה-T לפלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה בריכוז של 2.5 times 10 to the fifth תאים לבער, כאשר כל בארה מכילה 200 µL של מצע ספלנוציטים (splenocyte medium) טרי.

הוסיפו אינטרלוקין 7 רקומביננטי וחרוזי מגנט CD3/CD28 לבארים המתאימות, והכניסו את הפלטה לאינקובטור לתרביות תאים. לאחר 12 שעות, בצעו טריטורציה עדינה של תרחיף התאים בכל באר כדי לפרק צבירי חרוזים-תאים. לאחר מכן, העבירו את תרחיפי התאים מכל באר לשפופרות פוליסטירן נפרדות בנפח של 5 מיליליטר.

לאחר איסוף כל התאים, הכניסו כל מבחנה של תאים למגנט ההפרדה למשך חמש דקות בכל פעם, ושפכו את העל-נוזל (supernatants), בעוד המבחנה עדיין בתוך המגנט, למבחנות פוליסטירן חדשות בסיום כל דגירה. לאחר מכן, אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, והשעיו את המשקעים (pellets) במצע ספלנוציטים טרי בריכוז של 2×10⁶ תאים ל-milliliter. עבור סריקה בייחסי תפוקה גבוהים (high-throughput screening) של מולקולות קטנות, פזרו 40 µL של תאים לכל באר בלוח של 384 בארות, וטפלו בבארים המתאימות בתרופה או בנשא (vehicle) הנבחר למשך תקופת הטיפול הרצויה באינקובטור לתרביות תאים.

30 דקות לפני ניתוח ה-GFP, צבעו את התאים בריכוז המתאים של תמיסת Hoechst, תוך פיזור יסודי של הצבע באמצעות פיפוט עדין. כאשר כל הבארות נצבעו, סובבו את הפלטות בצנטריפוגה כדי לרכז את התאים בתחתית הבארות, והמתינו 15 דקות בטמפרטורת החדר. טענו את הפלטה בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן, כוון את העדשה לאובייקטיב של 40X או גבוה יותר. הגדר את מצלמה מספר ארבע עבור מנורת ה-UV, ואת מצלמה מספר אחת עבור לייזר 488. טען את הפלטה למערכת הסריקה בעלת התוכן הגבוה (high content screening system).

בשלב הבא, הגדירו את מערכת הסריקה האוטומטית בעלת התוכן הגבוה (high content screening) במיקרוסקופ קונפוקלי לקריאת שש עד 10 שדות לכל באר, עם שתי קריאות עוקבות לכל שדה, באור UV וב-488 ננומטר. תאי T חיוביים ל-CD3 מהווים כ-30% מטחול עכבר נתון, ומראים ביטוי GFP בסיסי של 10%. בעקבות גירוי של קולטני תאי T באמצעות חרוזי CD3/CD28, נצפתה עלייה של פי חמישה עד שישה באחוז ביטוי ה-GFP.

באופן דומה, תאי B חיוביים ל-CD19 מהווים 50 עד 55% מכלל הספלנוציטים, כאשר ביטוי GFP הבסיסי דומה לזה של תאי T שאינם מופעלים. באופן מעניין, גירוי של קולטן תאי B באמצעות anti-mouse IgG, IgM ו-CD40L רקומביננטי, גורם רק לעלייה זניחה בביטוי GFP. לאחר בידוד באמצעות חרוזי מגנט כפי שהודגם הרגע, תאי T חיוביים ל-CD3 המבודדים עדיין מראים ביטוי GFP בסיסי של 10%.

עם זאת, גרייה באמצעות חרוזי CD3/CD28 גורמת לעלייה משמעותית בתגובת ה-GFP. באופן דומה, לאחר בידוד מגנטי של תאי B, תאי B מופעלים ומזוקקים מראים ביטוי גבוה יותר של GFP בהשוואה לתאי B מופעלים בספלנוציטים. בניסוי מייצג זה, סריקה ראשונית ברסולוציה גבוהה (high-throughput) של 4398 תרכובות חשפה מספר מפעילים ומעכבים של הפעלת תאי T.

אולם ביטוי ה-GFP שנצפה בתאי T המעוררים היה גבוה פי 20 מזה שנמדד בתאי T שאינם מעוררים. דבר זה מאפשר יצירה של "חלון פעולה" שבו ניתן יהיה לזהות בקלות תרכובות מעכבות GFP. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 36 עד 48 שעות, במידה והיא מבוצעת כהלכה.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לספור את התאים לאחר כל שלב. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ELISA או western blotting כדי להשיב על שאלות נוספות. טכניקה זו תסלול את הדרך לגילוי תרופות למודולציה חיסונית במכרסמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של הדרך לבידוד והפעלה של תאי T או B המופקים מלוחיות עכברים של Nurr77 GFP.