מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא להעריך עיצוב מחדש של המוח בתנאי היפרגליקמיה, ולעקוב אחר מולקולות מסומנות רדיואקטיבית בדגי zebrafish. היפרגליקמיה מאופיינת בריכוז מופרז של גלוקוז בדם. היפרגליקמיה כרונית עלולה לנבוע ממצבים דיאבטיים, וגורמת לתקלות וסקולריות שונות, אשר בתורן עשויות לעורר סיבוכים קליניים, כגון אוטם בשריר הלב, שבץ מוחי או כיבים בכף רגל סוכרתית.

בנוסף, היפרגליקמיה חריפה עקב סטרס עשויה לקדם סיבוכים המורגיים בשבץ איסכמי. דגי זברה מהווים מודל מעניין להבנת מחלות אנושיות והשפעתן על מערכת העצבים המרכזית. הדבר נכון במיוחד לאור העובדה שמוחם של דגים בוגרים מפגין יכולת נוירוגנית אינטנסיבית ויכולת יוצאת דופן למנגנוני תיקון מוחי בהשוואה ליונקים; לפיכך, דגי זברה מהווים מודל טוב לחקירת עיצוב מחדש של המוח בעקבות סטרס בתנאים חריפים והיפרגליקמיים.

הוא מאפשר גם לחקור את הפיזור הביולוגי של מולקולות מסומנות רדיואקטיבית, ושל חומרים טיפוליים פוטנציאליים. כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות הצרפתיות והאירופיות לשימוש בבעלי חיים במחקר, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים. תפסו דג בעדינות באמצעות רשת לדגים.

העבירו את הדג לנפח קטן של חומר הרדמה tricaine, המדולל לריכוז סופי של 0.02% במים. המתינו עד שהדג יפסיק לזוז. הוציאו את הדג באמצעות פיפטה חתוכה, והניחו אותו בעדינות על נייר סופג כדי להסיר את מירב המים.

שקלו את הדג כדי להכין מזרק של d-glucose להזרקה, בנפח של 50 µL ובמינון של 2.5 g לקילו ממשקל הגוף. לדוגמה, דג במשקל 0.6 g יקבל 50 µL של תמיסת PBS עם 3% d-glucose. הניחו את הדג על גבו והחזיקו אותו ביד אחת.

בעזרת היד השנייה, הכניסו את מחט המזרק לחלל התוך-פעטוני (intraperitoneal), והזריקו באיטיות את תמיסת ה-d-glucose PBS. הוציאו את המחט והחזירו את הדג למים. עקבו אחר הדג עד להחלמתו המלאה.

רמות הגלוקוז בדם שלהם נמדדות בדרך כלל לאחר שעה וחצי. כדי לדמות היפרגליקמיה כרונית, הכין מיכל של שני ליטר d-glucose, בריכוז סופי של 111 millimolar. לשם כך, שקול 40 גרם של d-glucose והכנס אותו למיכל ריק.

מלאו את המיכל בשני ליטרים של מי דגים, והכניסו אליו עד שבעה דגים. החליפו את תמיסת הגלוקוז מדי יומיים, על מנת למנוע צמיחה של חיידקים או מיקרואורגניזמים אחרים. היפרגליקמיה כרונית מושגת באמצעות טיפול של 14 ימים ב-d-glucose.

דגו דג באמצעות רשת דייגים, והנח אותו על קרח. כסה את הדג בקרח לצורך קטילת חסד (euthanasia) מהירה. קח את הדג ונגב אותו, כדי להסיר טיפות מים שעלולות לדלל את דגימות הדם.

הסר עין באמצעות פינצטה לדיסקציה, והמתן עד שחלל העין יתמלא בדם. הנח פס בדיקה על המד גלוקומטר, והכנס את הפס אל חלל העין. רשום את ערך ריכוז הגלוקוז בדם.

עבור היפרגליקמיה חריפה, הזרקה תוך-peritoneal של d-glucose גורמת לעלייה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם, כפי שמוצג, 1 1/2 שעות לאחר ההזרקה. עבור היפרגליקמיה כרונית, טבילת דגים בתמיסת d-glucose גורמת לעלייה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם, כפי שמוצג לאחר 14 ימי טיפול. בסיום הפרוצדורה, הפרידו את הגוף מהראש באמצעות מספרי ניתוח, והניחו את הראש ב-4% paraformaldehyde, המדולל ב-PBS, לצורך ניסויי אימונוהיסטוכימיה.

דגרו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לחלופין, ניתן להוציא את המוח באופן ישיר ולהקפיאו לצורך ניסויים אחרים, כגון מיצוי mRNA. למחרת, שטפו את הראשים המקובעים ב-PBS, והחזיקו אותם באמצעות מחט תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

את העין הנותרת מסירים, ואת חלקו העליון של הגולגולת פותחים בעדינות בעזרת פינצטה. לאחר מכן מוציאים את המוח בזהירות ומניחים אותו ב-1x PBS. מוחות מקובעים עוברים דהידרציה בשלבים, בסדרה של ריכוזי אתנול עולים, ולאחריהם שני רחצים של 30 דקות בטולואן.

לאחר מכן מניחים את המוחות בקסטת השבעה, וסוגרים את המכסה בזהירות. מכניסים את הקסטה לפראפין מותך, בטמפרטורה של 58 עד 60 °C. במהלך השבעת המוח בפראפין, יש להפעיל את פינצטת ההחדרה המחוממת.

הניחו את הקסטה לאמבט פאראפין נקי. בסיום שלבי אמבטי הפאראפין, הוציאו את הקסטה. מזגו מעט פאראפין נוזלי לתוך תבנית.

פתחו את הקסטה, והניחו את המוח בתוך פאראפין מומס בתוך התבנית. כוونو את מיקום המוח באמצעות פינצטת ההחדרה המחוממת. מלאו את התבנית בפאראפין מומס, והניחו לו להתקשות בחלק הקירור של מכונת ההטמעה.

מסיבות טכניות, יש למקם את המוח בהתאם לציר קדמי-אחורי (anterior-posterior). לאחר הוצאת בלוק הפרפין מהתבנית, יש לחתוך אותו ולקבע אותו על קסטה באמצעות פרפין מומס, בכיוון הנכון המאפשר חיתוך טרנסוורסלי (רוחבי). הכנס את בלוק הפרפין לזרוע של המיקרוטום, ובצע חיתכים בעובי של 50 micrometer, עד להגעה למפלס דגימת המוח.

לאחר מכן, גזמו את בלוק הפרפין כדי לקבל צורה של טרפז, וכוונו את עובי החיתוך לשבעה מיקרומטרים. אספו את סרטי הפרפין באמצעות מברשת צבע עדינה, והניחו אותם על נייר שחור. חתכו את סרטי הפרפין בכל שלושה עד ארבעה חתכים.

הניחו זכוכית נושאת על פלטת חימום וכסו אותה במים מזוקקים. מקמו בעדינות את החתכים על פני המים שעל הזכוכית, וחממו עד ל-40 °C. כאשר סרטי הפרפין פרוסים מספיק, הסירו את המים בעזרת נייר סופג.

את הטיפות האחרונות מסירים באופן מכני, כפי שמוצג. יש להניח לזכוכית לה התייבש במשך שעתיים לפחות לפני ביצוע הליך האימונוהיסטוכימיה המתואר בפרוטוקול. לאחר האימונוהיסטוכימיה, הזכוכיות נסרקות תחת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקאלי, כדי לבחון את השפעת ההיפרגליקמיה על השגחה של תאי המוח.

כימות תאי המוח מבוצע בלפחות שלושה חתכים עוקבים, או באזור עניין (region of interest). כאן, תאים בשלב התחלקות (proliferative cells) המקבילים לתאים חיוביים ל-PCNA מופיעים בירוק. כפי שניתן לראות, היפרגליקמיה כרונית גורמת לירידה במספר התאים בשלב התחלקות, המסומנים בירוק באמצעות נוגדן PCNA, בטלנצפאלון הוונטרלי (ventral telencephalon), בטלנצפאלון הדורסלי (dorsal telencephalon), ובהיפותלמוס הקודאלי (caudal hypothalamus), סביב הרסיס הלטרלי והפוסטריורי.

לחלופין, כדי לבחון את השפעות ההיפרגליקמיה על נוירוגנזה המושרית על ידי פגיעה, ניתן לבצע פגיעת דקירה (stab wound injury) בטלנצפאלון במהלך טיפול היפרגליקמי כרוני. לשם כך, הרד דג שעבר טיפול במשך שבעה ימים, והנח אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. דחף מזרק בקוטר 30 gauge בצורה אנכית דרך הגולגולת, אל מרכזו של חציו המוח השמאלי של הטלנצפאלון.

לאחר הליך זה, יש להחזיר את הדג לאקווריום למשך הזמן הנדרש. במקרה זה, הדג הושאר לשבעה ימים במים עם d-glucose לפני שהוקרב. פגיעת דקירה של ה-telencephalon מעלה באופן משמעותי את השגשוג (proliferation) בהמיספרה הפגועה, שבעה ימים לאחר הפגיעה.

הנתונים שלנו מראים כי היפרגליקמיה כרונית גורמת לירידה משמעותית בתהליכי ריפוי במוח, על ידי הפחתת שגשוג תאים לאחר פגיעת דקירה בטלואנצפאלון (המוח הקדמי). ניתן להשתמש בדגי zebrafish גם לחקר הפיזור הביולוגי של מולקולות מסומנות רדיואקטיבית. כאן, החלטנו לחקור את מטבוליזם הגלוקוז באורגניזם של zebrafish.

יש להרדימ את הדג תחילה, ולהניחו על רקמה הספוגה בחומרי הרדמה. לאחר מכן, מניחים את הדג מאחורי חלון הגנה מפני קרינה. מכינים מזרק המכיל 50 µL של fluorodeoxyglucose.

הדג מונח על גבו, ומוזרק תוך-peritoneally עם 50 µL של FDG בריכוז 20 MBq. לאחר מכן, הדג מונח על רקמה נוספת הספוגה בחומרי הרדמה. הוא נערך בעדינות ומוצב על זרוע של סורק PET.

הזרוע מוכנסת לסורק ה-PET, ופרוצדורת הדימות מבוצעת. כאן ניתן להבחין כי FDG מזוהה לא רק באתר ההזרקה, אלא גם בראש הדג, ובמיוחד במוח, ולאורך כל חוט השדרה. במחקר זה, אנו מציגים שתי שיטות שונות ליצירת היפרגליקמיה חריפה וכרונית בדגי זברה, ומראים כי היפרגליקמיה פוגעת בשגשוג תאי המוח בתנאים נורמליים ובתנאים המושרים על ידי פגיעה.

לסיכום, ניתן להשתמש בדגי zebrafish כמודל רלוונטי לחקר ההשפעות המזיקות של היפרגליקמיה במערכת העצבים המרכזית. המודל מאפשר גם להעריך את הפיזור הביולוגי של מולקולות מסומנות רדיואקטיבית באמצעות סריקת PET.