מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להעריך את שיפוץ המוח בתנאים היפרגליקמיים, ולעקוב אחר מולקולות עם תוויות רדיו בדג הזברה. היפרגליקמיה מאופיינת בריכוז מוגזם של גלוקוז בדם. היפרגליקמיה כרונית עשויה לנבוע ממצבי סוכרת, וגורמת להפרעות בתפקוד כלי הדם השונות, שעלולות בתורן לעורר סיבוכים קליניים, כגון אוטם שריר הלב, שבץ מוחי או כיבים בכף הרגל הסוכרתית.

כמו כן, היפרגליקמיה חריפה עקב מתח עלולה לקדם סיבוכים דימומיים בשבץ איסכמי. דג הזברה הוא מודל מעניין להבנת מחלות אנושיות, והשפעתן על מערכת העצבים המרכזית. זה נכון במיוחד, בהתחשב בכך שמוחם של דגים בוגרים מפגין יכולת נוירוגנית אינטנסיבית, ויכולת יוצאת דופן למנגנוני תיקון מוח, בהשוואה ליונקים, לכן, דג הזברה מייצג מודל טוב לחקר עיצוב מחדש של המוח, בעקבות מתח בתנאים חריפים והיפרגליקמיים.

זה גם מאפשר לחקור את ההפצה הביולוגית של מולקולות עם תווית רדיו, וחומרים טיפוליים פוטנציאליים. כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות הקהילה הצרפתית והאירופית לשימוש בבעלי חיים במחקר, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים. תפוס דג בעדינות עם רשת דייגים.

הכניסו את הדג לנפח קטן של חומר הרדמה טריקאין, מדולל בריכוז סופי של 0.02% במים. המתן עד שהדג יפסיק לנוע. הסר את הדג, בעזרת פיפטה חתוכה, והניח אותו בעדינות על נייר טישו סופג כדי להסיר מקסימום מים.

שקלו את הדג על מנת להכין מזרק d-גלוקוז להזרקה, של 50 מיקרוליטר של 2.5 גרם לקילו משקל גוף. לדוגמה, דג במשקל 0.6 גרם יקבל 50 מיקרוליטר של תמיסת PBS של 3% d-גלוקוז. הניחו את הדג על גבו, ושמרו עליו ביד אחת.

ביד השנייה, הכנס את מחט המזרק לחלל התוך צפק, והזריק לאט את תמיסת ה-d-גלוקוז PBS. הסר את המחט והחזיר את הדג למי הדגים. בודקים את הדג עד שהוא מתאושש לחלוטין.

רמות הגלוקוז בדם שלהם נמדדות בדרך כלל לאחר שעה וחצי. על מנת לחקות היפרגליקמיה כרונית, הכינו מיכל של שני ליטר d-גלוקוז, בריכוז סופי של 111 מילימולר. לשם כך, שקלו 40 גרם גלוקוז d, והכניסו אותו למיכל ריק.

מלאו את המיכל בשני ליטר מי דגים, והניחו בו עד שבעה דגים. החלף את תמיסת הגלוקוז כל יומיים, על מנת למנוע צמיחה של חיידקים, או מיקרואורגניזמים אחרים. היפרגליקמיה כרונית מתקבלת על ידי טיפול של 14 יום ב-d-גלוקוז.

תפוס דג עם רשת דייגים, והניח אותו על קרח. מכסים את הדג בקרח להמתת חסד מהירה. קחו את הדג ונגבו אותו, על מנת להסיר טיפות מים שעלולות לדלל דגימות דם.

הסר עין בעזרת מלקחיים מנתחים, והמתן עד שחלל העין יתמלא בדם. הנח רצועת בדיקה על הגלוקומטר והכנס את הרצועה לחלל העין. שימו לב לערך ריכוז הגלוקוז בדם.

עבור היפרגליקמיה חריפה, הזרקה תוך-צפקית של d-גלוקוז גורמת לעלייה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם, כפי שמוצג, שעה וחצי לאחר ההזרקה. עבור היפרגליקמיה כרונית, טבילת דגים בתמיסת D-גלוקוז מביאה לעלייה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם, כפי שמוצג לאחר 14 יום של טיפול. בתום ההליך, הפרד את הגוף מהראש בעזרת מספריים מנתחות, והכניס את הראש ל-4% של פרפורמלדהיד, מדולל ב-PBS לניסויים אימונוהיסטוכימיים.

דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לחלופין, ניתן לחלץ את המוח ישירות ולהקפיא אותו לניסויים אחרים, כגון מיצוי mRNA. למחרת, ראשים קבועים נשטפים ב-PBS, ומתוחזקים באמצעות מחט תחת מיקרוסקופ מנתח.

העין הנותרת מוסרת, והחלק העליון של הגולגולת נפתח בעדינות בעזרת מלקחיים. לאחר מכן המוח נשאב בזהירות, ומונח ב-1x PBS. מוחות קבועים מיובשים בשלבים, בסדרה של ריכוזי אתנול הולכים וגדלים, ואחריהם שתי אמבטיות טולואן של 30 דקות.

לאחר מכן מניחים מוחות בקלטת הטבעה, והמכסה נסגר בזהירות. הכניסו את הקסטה לפרפין מומס, בחום של 58 עד 60 מעלות צלזיוס. במהלך הטמעת פרפין במוח, הפעל את מלקחיים ההכללה המחממים.

הכניסו את הקסטה לאמבט פרפין נקי. בסוף אמבטיות הפרפין, הוציאו את הקסטה. שופכים מעט פרפין נוזלי לתבנית.

פתחו את הקסטה והניחו את המוח בתוך פרפין מומס בתבנית. כוון את המוח עם מלקחיים להכללה מחממים. ממלאים את התבנית בפרפין מומס, ונותנים לה להתקשות בחלק הקירור של מכונת ההטבעה.

מסיבות טכניות, יש למקם את המוח על פי ציר קדמי-אחורי. לאחר פירוק גוש הפרפין, חתוך אותו וקבע אותו על קלטת עם פרפין מומס, בכיוון הנכון כדי לאפשר חתך רוחבי. הכניסו את גוש הפרפין לזרוע של מיקרוטום, וחתכו חלקים של 50 מיקרומטר, עד שתגיעו לרמת דגימת המוח.

לאחר מכן, חתוך את גוש הפרפין לקבלת טרפז, והתאם את עובי החיתוך לשבעה מיקרומטרים. אוספים את סרטי הפרפין בעזרת מברשת צבע עדינה, ומניחים אותה על נייר שחור. חותכים את סרטי הפרפין כל שלושה עד ארבעה חלקים.

הניחו שקופית על צלחת מחממת, וכסו אותה במים מזוקקים. מקם בעדינות את החלקים על המים במגלשה, ומחמם עד 40 מעלות צלזיוס. כאשר סרטי פרפין מפוזרים מספיק, הסר את המים עם רקמה סופגת.

הטיפות האחרונות מוסרות מכנית, כפי שמוצג. הניחו לשקופית להתייבש לפחות שעתיים לפני ביצוע ההליך האימונוהיסטוכימי המתואר בפרוטוקול. לאחר אימונוהיסטוכימיה, השקופיות מנותחות תחת אפיפלואורסצנטי, או מיקרוסקופ קונפוקלי, לחקר ההשפעה של היפרגליקמיה על התפשטות תאי המוח.

כימות תאי המוח נעשה לפחות בשלושה חלקים עוקבים, או אזור עניין. כאן, תאים מתרבים המתאימים לתאים חיוביים ל-PCNA מופיעים בירוק. כפי שאתה יכול לראות, היפרגליקמיה כרונית גורמת לירידה במספר התאים המתרבים, המסומנים בירוק עם נוגדן PCNA, בטלנצפלון הגחוני, בטלנצפלון הגבי ובהיפותלמוס הזנבי, סביב השקע הצדדי והאחורי.

לחלופין, לחקר ההשפעות של היפרגליקמיה על נוירוגנזה הנגרמת על ידי פציעה, ניתן לבצע פגיעה בפצע דקירה של הטלנצפלון במהלך טיפול היפרגליקמי כרוני. לשם כך יש להרדים דג שטופל בשבעה ימים, ולהכניס אותו למיקרוסקופ מנתח. דחוף מזרק בגודל 30 אנכית דרך הגולגולת, למרכז חצי הכדור הטלנצפלי הימני.

לאחר הליך זה, יש להחזיר את הדג למיכל שלו למשך הזמן הנדרש. כאן, הדג הורשה לשרוד שבעה ימים במי D-גלוקוז, לפני שהוקרב. פצע דקירה של הטלנצפלון מווסת מאוד את ההתפשטות בחצי הכדור הפגוע, שבעה ימים לאחר הנגע.

הנתונים שלנו מראים כי היפרגליקמיה כרונית גורמת לירידה משמעותית בתהליכי ריפוי המוח, על ידי הפחתת התפשטות התאים לאחר פגיעה בפצע דקירה של הטלנצפלון. דג הזברה יכול לשמש גם לחקר ההפצה הביולוגית של מולקולות עם תוויות רדיו. כאן, החלטנו לחקור את חילוף החומרים של גלוקוז באורגניזם דג הזברה.

יש להרדים תחילה את הדג, ולהניח אותו על טישו ספוג בחומרי הרדמה. לאחר מכן הדג מונח מאחורי חלון הגנת רדיו. מכינים את המזרק המכיל 50 מיקרוליטר פלואורודיאוקסיגלוקוז.

הדג ממוקם על גבו, ומוזרק תוך צפקית עם 50 מיקרוליטר FDG ב-20 מגה-בקרל. לאחר מכן מניחים את הדג על רקמה אחרת ספוגה בחומרי הרדמה. הוא עטוף בעדינות, וממוקם על הזרוע של מצלמת סריקת PET.

הזרוע מוחדרת לסריקת ה-PET, והליך ההדמיה מתבצע. כאן, אתם יכולים לציין ש-FDG מזוהה לא רק במקום ההזרקה, אלא גם בראש הדג, במיוחד במוח, ולאורך חוט השדרה. במחקר זה, אנו מספקים שתי שיטות שונות לביסוס היפרגליקמיה חריפה וכרונית בדגי הזברה, ואנו מראים כי היפרגליקמיה פוגעת בשגשוג תאי המוח בתנאים רגילים ופציעה.

לסיכום, דג הזברה יכול לשמש כמודל רלוונטי לחקירת ההשפעות המזיקות של היפרגליקמיה במערכת העצבים המרכזית. זה גם מאפשר להעריך את ההפצה הביולוגית של מולקולות עם תווית רדיו על ידי סריקת PET.