Name: שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למד שיטת דגימה ספוגית מבוססת מקרופום לזיהוי norovirus על משטחים קשים. פרוטוקול זה משפר את שיעורי הזיהוי ומסייע בחקירת התפרצויות וניטור סביבתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

1. הדגימה ספוגית בתחום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבש זוג נקי של כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את גודל שטח הדגימה בלי לגעת פני השטח באמצעות קלטת או שליט מדידה. נסו להעריך את האזור בצורה מדויקת ככל האפשר ולמלא טופס דיווח (לוח משלימה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הערכה הספוגית עבור דליפות אפשריות ושקיות תחבורת תווית מדגם וערכות ספוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הספוגית על פני שטח הדגימה כדלקמן: במכה אחת בכיוון אופקי, במכה אחת בכיוון אנכי, ושבץ אחד בכיוון אלכסוני. אל ספוגית שטח פנים גדול יותר מ -700 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל ספוגית לתוך צינור ו להדק את המכסה מאובטח. </li></ol> אחסון 2. ותחבורה של מטליות אל המעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מטליות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות. אם אחסון לפרקי זמן ארוכים יותר נדרש, לאחסן את המטליות ב -20 ° C (או -70 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות ב C 0-4 מעלות (כלומר. , להשתמש חבילות קרות) במכל מבודד במהלך הובלה למעבדת הספינה בתוך 24-48 שעות של אוסף. </li></ol> 3. ריכוז וירוס, הפקת רנ&quot;א נגיפי וטיהור הערה: כל הצעדים צנטריפוגה להשתמש בצנטריפוגה בראש הטבלה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. מומלץ לשים לב ולהיזהר כשעובדים עם חילוץ חומצה האוניברסלי גרעין (יונקס) החיץ. תלבש משקפי מגן או מגן פנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל אחד 15 מ&quot;ל צינור ואחד טור RNA Midi עבור כל דגימה. כלול שליטת חילוץ שלילית בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הפתרון תמוגה עבור 10 מטליות, לערבב 25 מ&quot;ל של חיץ יונקס עם 25 מ&quot;ל של PBST (PBS pH 7.2 המכיל 0.02% Tween-80). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של ההשעיה coliphage MS2 (10 6 PFU / μl) 50 מ&quot;ל של תמיסת תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ספוגית בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל ולהוסיף 5 מ&quot;ל פתרון תמוגה. מערבבים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 5 מ&quot;ל 100% אתנול לצינור כל מערבולת עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הספוגית מ -15 צינור המ&quot;ל (הוא מכיל מאגר יונקס) לחיצה קלה כנגד הצד של הצינור כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן למחוק את הספוגית. הכרכים הנותרים צריכים להיות בין 9-10 מ&quot;ל. </li></ol> 4. טור Midi ויראלי גרעין הפקת חומצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר 4.5 מ&quot;ל יונקס / אתנול תערובת משלב 3.6 על בצנטריפוגה midi טור, וזורקים את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 4.5 אחר מיליליטר מאותה התערובת על הטור, צנטריפוגות אותו, וזורק את התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 3.5 מ&quot;ל של אתנול 70% על הטור Midi, צנטריפוגות וזורקים את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להוסיף 3.5 מ&quot;ל של אתנול 70% על הטור Midi. צנטריפוגה וזורק את התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ספין יבש, צנטריפוגות עמודות מידי כדי להסיר כל עקבות של אתנול (אשר יכול להשפיע התאוששות רנ&quot;א נגיפי שלך באופן שלילי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מניחים את הטור Midi בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ&quot;ל חדש. הוסף 250 μl חיץ elution על הטור Midi; לחכות 1 דקות לפני צנטריפוגה להשיג התאוששות רנ&quot;א נגיפי הגבוהה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את חומצות גרעין שחולצו ב -70 ° C או להמשיך מיד לשלב 5. </li></ol> ריכוז 5. ויראלי חומצות גרעין שימוש RNA נקי ערכות מרוכזות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של RNA חיץ מחייב 250 μL של RNA eluted בשלב 4.7 לעיל ו מערבולת למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 750 μL 100% אתנול ו מערבולת למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל טור ספין עבור כל דגימה. טענתי מדגם 750 μL על טור ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודות ספין XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 750 μL הנותרים על עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קדם שטיפה, להוסיף 400 חיץ הכנה μL RNA כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 800 μL RNA הצפת לשטוף כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להוסיף 400 μL RNA לשטוף הצפת לטוות עמודה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ספין יבש, צנטריפוגות טור ספין כדי להסיר כל עקבות של חיץ לשטוף ב XG 12,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות ספין עמודה צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ elution 25 μL על הטור ספין דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. זה יגביר את ההתאוששות של רנ&quot;א נגיפי מהעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הרנ&quot;א על ​​ידי צנטריפוגה העמודה ספין על XG 10,000 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או להמשיך ישירות RT-qPCR (שלב 6) או RNA החנות ב -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR איתור של Genogroup לי, ו- II noroviruses, ו Coliphage MS 2 (לוח משלימה 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטחי עבודה נקיים, pipettes, צנטריפוגות עם פתרון טיהור RNase כדי להפחית את זיהום אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ריאגנטים RT-qPCR על הקרח. RNA להפשיר על הקרח (באזור / חדר נפרד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר תגובות ולהוסיף לפחות 10% יותר מהם (למשל, אם 10 תגובות נדרשות, לעשות תערובת אב 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים וורטקס תערובת אמן יחיד, למעט 25x האנזים RT-qPCR עבור 5 ים. בזהירות ומערבבים האנזים על ידי מצליף את הצינור עם האצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מאסטר צנטריפוגות רכיבים לערבב במשך 5 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת מאסטר לאיתור בזמן אמת RT-PCR של GI norovirus ו GII בהתאם להוראות ערכת ולהוסיף פריימרים oligonucleotide ספציפי norovirus ו בדיקות צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge (לוח משלים 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת מאסטר ידי pipetting 5-10 פעמים למעלה ולמטה (vortexing אינה מומלצת). Aliquot 22 μL של מיקס מאסטר היטב בכל צלחת 96-היטב בזמן אמת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA המדגם וורטקסבמשך 5 שניות, ולאסוף על ידי צנטריפוגה קצר (5 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 μL של המדגם RNA ו- GI ו שולטת חיובית GII לצלחת RT-qPCR (אחרי תבנית מתוך טבלה 2). להוסיף 3 μL של nuclease-Freewater בבארות ללא תבנית שליטה (NTC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת בזמן אמת עם סרט דבק אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות בצנטריפוגה הצלחת בזמן האמת ב -1,300 XG דקות 1 כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזלות שעשויה להיות נוכח הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכשיר בזמן אמת PCR ועל הגדרת התנאים thermocycling הבאים: 1) שלב RT במשך 10 דקות. ב 45 ° C (2) הפעלת פולימראז תקי, 10 דק &#39;. ב 95 מעלות צלזיוס ו (3) 45 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו -60 של ב 60 ° C. </li></ol> 7. כימות norovirus בדגימות ספוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התוצאות של בקרות חיוביות ושליליות כדי לאמת תוצאות RT-qPCR (לוח משלים 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם כל עקומת סטנדרט עונה עלערכים מקובלים מתפרסמים בלוח משלים 2 ולחשב את סטיית ההתקן כוללת על העקומה הרגילה באמצעות משוואת 1. (משוואת 1)% יעילים = 100 x 10 (CT ממוצע ערכים-יירוט) / סלופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוכנת Cycler תרמית PCR לא לחשב את השיפוע עבור כל עקומת סטנדרט, לקבוע מדרון R 2 ערכים על ידי רגרסיה באמצעות תוכנה נתונה (למשל Excel, SPSS, או SAS). בנוסף, לחשב את יעילות% עבור עקומות סטנדרטיות הבא אני המשוואה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר עותק RNA מחושב על ידי תוכנת Cycler תרמית עבור כל דגימות הבדיקה מבוססות על עקומות סטנדרטיות העונות על הקריטריונים מפורטים בטבלה משלימה 4. שידור חוזר כל דגימות עם כובע לא עקום סטנדרטי אינו עומד בקריטריונים או יש בקרות חיוביות שגויות. בדוק ערכי ה- CT של coliphage MS2, שהתווסף בקרה פנימית לפקח עיכוב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר הכולל של p עותקי RNAמדגם ER ידי הכפלת מספר עותק RNA המחושב בשלב 7.2 ידי היחס בין נפח (25 עד 50 μL) של eluent RNA סך לזה של רנ&quot;א (3 עד 5 μL) המשמש התגובה RT-qPCR. לחלופין, לחשב את צפיפות RNA על ידי חלוקת מספר עותק RNA הכולל ידי שטח הפנים אובייקט (2 ס&quot;מ) ניתחו. </li></ol> 8. Genotyping של דוגמאות בזמן אמת RT-PCR חיובי על ידי חמי מקונן PCR קונבנציונאלי הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את הסיבוב הראשון של תערובת אמן עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2, ו -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של RNA חיובי norovirus עד 20 μL של תמהיל מאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את RT-PCR בתנאים הבאים: (1) שלב RT למשך 30 דקות ב 42 ° C (2) הפעיל פולימראז תקי, 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו- (3) 40 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 s, ב 50 מעלות צלזיוס, ו -60 שניות על 72 מעלות צלזיוס. אחרי 40 מחזורים, דגירה 10 דקות נוספות ב 72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מכינים את הסיבוב השני של תמהיל מאטר עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2 ו -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 23 μL תמהיל מאסטר ולהוסיף 2 μL של מוצרים בסיבוב הראשון RT-PCR (מ בסיבוב הראשון) על צינור אחד (רצוי המוצר בסיבוב הראשון צריך להיות מדולל 1/10 במים RNase ללא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose 2% ב 100 מ&quot;ל 1x טריס-אצטט EDTA (40 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, ב- pH 8.3). לאחר המסת agarose על ידי חימום תערובת במיקרוגל, להוסיף 10 μL של כתם חומצות גרעין לכל 100 מ&quot;ל של ג&#39;ל מוכן לאחר קירור התערובת ל- C 60-70 מעלות, יוצקים את הג&#39;ל והכנס את מסרקים. תנו ג&#39;ל להסתפק לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 μl של כל מוצר RT-PCR עם 3 μL של צבע טעינת 6x. טען 15 μL של כל דגימה electrophorese הג&#39;ל agarose ב -100 V עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד ובלו שבר RT-PCR בגודל מתאים (330 נ&quot;ב עבור GI ו -341 נ&quot;ב עבור GII) מן ג&#39;לd לטהר RNA באמצעות ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית. מוצר PCR מטוהר כעת ניתן להשתמש עבור רצף סנגר. </li></ol>

<ol><li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+transmission+on+cruise+ship%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li>
<li>Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22440972">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat%2C+Grand+Canyon%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3880795/">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li>
<li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate%2C+Bacteriophage+MS2%2C+during+Simulated+Vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277(2015).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+50%25+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li>
<li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5651a2.htm">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li>
<li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li>
<li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li>
<li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li>
<li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12560-008-9007-0">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li>
<li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li>
<li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaliciNet%3A+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li>
<li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internally+controlled%2C+one-step%2C+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li>
<li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li>
<li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus%3A+how+infectious+is+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li>
<li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate%2FEDTA-pretreated+chromatography+paper+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li>
<li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27154208">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=55382">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).</li>
<li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+to+defining+%22high-touch%22+surfaces+in+hospitals%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility%3A+the+role+of+environmental+surface+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li>
<li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li>
<li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li>
<li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li>
<li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li>
</ol>

לסופרים אין אינטרסים מנוגדים. הממצאים והמסקנות בדו"ח זה הם של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את העמדה הרשמית של המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן.

יש noroviruses מנת זיהומיות אדם 50% בין 18 ו -10 חלקיקי 3 וירוס 20. לכן, גם זיהום ברמה נמוכה של משטחים עלול להוות סיכון לבריאות הציבור. כמה היבטים של פרוטוקול הדגימה הספוגית הוערכו כולל: 1) חומרי ספוגית שונה, 2) מטליות תנאי אחסון במהלך הובלה, 3) ריכוז הנגיפי RNA, ו -4) coliphage MS2 כשליטת חילוץ פנימי. עד לאחרונה, רק את הביצועים של מטליות עשויות כותנה, פוליאסטר, ניילון אנטי-סטטי...

<html> Noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס החריפה ספורדית 1 בעולם, 2, 3. הווירוס הוא מאוד מדבק עוברים מאדם לאדם באמצעות אדם ישיר אינטראקצית אדם או בעקיפין באמצעות מגע עם מזון מזוהם, מים או משטחים סביבתיים. Noroviruses ניתן לשפוך לפארקים וממושכת הישרדות של הנגיף על משטחים סביבתיים תועדה 1, 2, 3. במהלך שפיכת שיא, מיליארדים של חלקיקי נגיף משתחררים לגרם של צואה, וקיא מכיל גם מספר מספיק של חלקיקים נגיפיים כדי לגרום לזיהום 4, 5, 6, 7, 8,EF &quot;&gt; 9, 10. בנוסף, העברת הנגיף בין משטחים דוממים עור אנושי יכולה להתרחש 2 בקלות, 11, 12. לפיכך, ניטור של זיהום סביבתי עשוי לסייע בחקירה פרוצה ו בהערכת היעילות של למעלה נקי נהלי חיטוי. מספר פרוטוקולי דגימה סביבתיים תוארו לצורך זיהוי של רוטה-וירוס, coliphage MS2, calicivirus חתולים (FCV), ואת בקטריופאג P22 13, 14, 15, 16. עם זאת, תנאי האימות תארו במחקרים אלה, לרבות התייבשות מהירה (&lt;1 שעה) ואת שטח פנים קטן (25 x 100 סנטימטרים 2), לא יכולים לייצג הגדרות שדות כראוי. בנוסף, צפוי זיהום ברמות נמוכות של סביבתימשטחי nmental דורשים פרוטוקולים מסוגלים לזהות חלקיקי נגיף מעט מאוד. פתחנו שיטת דגימת משטח מבוסס macrofoam לאיתור וההקלדה של norovirus. שיטה זו תאומת במהלך פרצתי מספר פעמים norovirus. הפרוטוקול כולל 1) איך לאסוף דגימות ספוגית ממשטחים הסביבה (2) מהי הדרך הטובה ביותר כדי לשמור על שלמות של דגימות במהלך איסוף ומשלוח למעבדה, ו -3) בדיקות מעבדה והקלדה של norovirus.

<table><tbody><tr><td>שם גנרי לערכות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam </td><td>Premoistened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>פוריטן</td><td>2588060PFUW</td></tr><<tr><td>חזק>RNA מאגר ליזה&nbsp; </חזק></td><td>CDC מאגר UNEX</td><td>מיקרוביולוגיות</td><td>חתול מס' MR0501</td></tr><tr><td><חזק>עמודת מיצוי RNA</עמוד חזק></td><td>מידי</td><td>אומגה ביוטק</td><td>חתול מס' R6664-02</td></tr><tr><td><חזק>עמודת סיבוב לטיהור RNA</חזק></td><td>ערכת RNA נקי ורכז&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>ערכת RT-PCR בזמן אמת</td><td>AgPath ערכת RT-PCR חד שלבי Life</td><td>Technologies</td><td>Cat No</td></tr> <tr><td>4387391ערכת RT-PCR קונבנציונלית</חזק></td><td>Qiagen ערכת RT-PCR שלב אחד</td><td>ערכת Qiagen ערכת</td> מיצוי <td>ג'ל Cat No</td></tr> <tr><td>210212Gel Extract</td><td>Qiagen QIAquick gel extraction</td><td>kit ערכת Qiagen Cat</td><td> לא 28704 או 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>תמלילי</td><td></td><td></td>ריצה של RNA</tr><tr><td>פלטפורמת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>דגם ABI 7500</td>צלחת תגובה אופטית 96 בארות Thermo Scientific Cat No 4316813<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& productID=4306311&&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd6 0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp סרט דבק שקוף&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס ספורדי ברחבי העולם. מכיוון שרוב הזיהומים או מופצים ישירות דרך המסלול של אדם אל אדם או בעקיפין באמצעות משטחים סביבתיים או מזון, fomites מזוהם ומשטחים דוממים הם כלים חשובים עבור התפשטות הנגיף במהלך התפרצויות norovirus. פיתחנו ומוערכת פרוטוקול באמצעות מטליות macrofoam לאיתור והקלדה של noroviruses האדם מן משטחים קשים. בהשוואה מטליות שקצהו סיבים או מגבונים אנטי-סטטי, מטליות macrofoam לאפשר התאוששות וירוס (טווח 1.2-33.6%) ממשטחים מושב האסלה של עד 700 ס&quot;מ 2. הפרוטוקול כולל שלבים עבור החילוץ של הנגיף מן המטליות וריכוז נוסף של רנ&quot;א הנגיפי באמצעות עמודות ספין. בסך הכל, 127 (58.5%) של 217 דגימות ספוגיות שנאספו ממשטחים באוניות שיוט ומתקני סיעודים שבו גסטרואנטריטיס norovirus היהדיווח נדבקה norovirus GII ידי RT-qPCR. 29 אלה (22.8%) ניתן genotyped בהצלחה. לסיכום, איתור של norovirus על משטחים סביבתיים באמצעות הפרוטוקול שפתחנו עשויה לסייע בקביעת רמת הזיהום סביבתי במהלך התפרצויות, כמו גם זיהוי של וירוס כאשר דגימות קליניות אינן זמינות; היא עשויה גם להקל על ניטור של יעילות של אסטרטגיות משיקום.

איור 1 מציג תרשים זרימה של פרוטוקול הדגימה הספוגית. פרוטוקול זה מכיל ארבעה שלבים עיקריים; 1) אוסף מדגם, 2) מדגם אחסנה והובלה 3) טיהור רנ&quot;א נגיפי וריכוז ו -4) RT-qPCR assay ו גנוטיפ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול הסופי עבור דגימת משטח סביבתית של no...

מתודולוגיית דגימה מבוססת קצף מאקרו פותחה והוערכה לאיתור וכימות של נורו-וירוס על משטחים קשים סביבתיים.

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

המטרה הכללית של שיטת דגימת השטחים המבוססת על מקרו-קצף (macrofoam) היא זיהוי האטיולוגיה של ההתפרצות, הערכה כוללת של דינמיקת הזיהום הסביבתי של הנגיף, ובחינת היעילות של אסטרטגיות סנפיר (remediation) עבור נורו-וירוס. פרוטוקול זה מפרט כיצד לאסוף דגימות במטשון משטחים סביבתיים, כיצד יש לאחסן ולהוביל מטשונים אלו, ואילו פרוטוקולים מעבדתיים מומלצים לזיהוי ואבחנה (typing) של נורו-וירוס מדגימות אלו. השיפורים המובהקים בפרוטוקול דגימת המטשון הסביבתי עבור נורו-וירוסים הם קביעת סוג חומר המטשון האידיאלי, כמות הנורו-וירוס שניתן להפיק ממשטחים קשיחים, והעובדה שהפרוטוקול יכול לשמש ביעילות לדגימה של שטחי פנים גדולים יותר.בסרטון זה, שני מדעני הצוות שלי, Geun Woo Park ו-Preeti Chhabra, ידגימו את פרוטוקול הדגימה במטוש לזיהוי והקלדה של נורו-וירוסים. כדי להתחיל בדגימה, גשו לאזור הדגימה והעבירו את המטוש על פני השטח בבלימה אחת בכיוון האופקי, בלימה אחת בכיוון האנכי ובלימה אחת בכיוון האלגון. הכניסו כל מטוש לשפופרת נפרדת והדקו את המכסה היטב.דגמו משטחים של פלדה אל-חלודה, משטח של מושב אסלה וידית של דלת. לאחר מכן, סמנו מבחנה אחת בנפח 15-milliliter ועמודה אחת מסוג RNA Midi עבור כל דגימה. כלולו בקר השלילה לחילוץ בכל ניסוי.הכינו בקבוק ריק לאיסוף של שאריות תמיסת UNEX (universal nucleic acid extraction). כדי להכין את תמיסת הליזיס עבור 10 מטשיות, ערבבו 25 מיליליטר של תמיסת UNEX עם 25 מיליליטר של PBST. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסיית coliphage MS2 ל-50 מיליליטר של תמיסת ליזיס.הניחו מקריע (swab) במבחנה של 15 מיליליטר, והוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת ליזיס. ערבבו את המקריע בתמיסה, והדגירו את התערובת בטמפרטורת החדר. הוסיפו חמישה מיליליטר של 100% ethanol לכל מבחנה, וערבבו את המבחנות בוורטקס למשך 10 שניות.הוצא בזהירות את המטוש מהמבחנה בנפח 15 מיליליטר, תוך לחיצה עדינה על דופן המבחנה להסרת נוזל עודף, ולאחר מכן השלף את המטוש לפסולת. העבר בזהירות 4.5 מיליליטר של תמיסת האתנול UNEX לעמודת Midi, וסבב את העמודה בצנטריפוגה. לאחר הסבב בצנטריפוגה, השלף את התסננת לפסולת.העמיסו 4.5 מיליליטר נוספים מאותה תערובת על אותו עמודה, ולאחר מכן סובבו את העמודה בצנטריפוגה. השליכו את התסנין. לשטיפה הראשונה, הוסיפו 3.5 מיליליטר של 70% ethanol לעמודת ה-Midi, וסובבו את העמודה בצנטריפוגה.לאחר הסבוב, השליכו את התסנן. עבור השטיפה השנייה, הוסיפו 3.5 milliliters נוספים של 70% ethanol לעמודת ה-Midi. סובבו בצנטריפוגה והשליכו את התסנן.לביצוע סבב ייבוש, סבב את עמודי ה-Midi בצנטריפוגה כדי להסיר את כל שאריות האתנול. העבר את עמוד ה-Midi לפקת צנטריפוגה חדשה בנפח 15 מיליליטר. הוסף 250 microliters של באפר אלוציה (elution buffer) על עמוד ה-Midi, והמתן דקה אחת לפני הסבב בצנטריפוגה כדי להשיג את מקסימום השחזור של ה-viral RNA.הוסיפו 500 µL של RNA binding buffer ל-250 µL של RNA, וערבבו את התערובת במערבל Vortex למשך 10 שניות. הוסיפו 750 µL של 100% ethanol, וערבבו ב-Vortex למשך 10 שניות. לאחר מכן, סמנו עמודת ספינ (spin column) עבור כל דגימה.העבירו את דגימת ה-750 µL לעמודת ספין (spin column), וסבבו את עמודי הספין בצנטריפוגה. השליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flow-through). העבירו את 750 ה-µL הנותרים לעמודת ספין, וסבבו את העמודות בצנטריפוגה.עבור השטיפה המקדימה, הוסף 400 µL של RNA prep buffer לכל עמודת ספין (spin column), וסובב את העמודה בצנטריפוגה. השלך את הנוזל שעבר סינון. עבור השטיפה הראשונה, הוסף 800 µL של RNA wash buffer לכל עמודת ספין, וסובב את העמודות בצנטריפוגה.שפכו את הנוזל שעבר דרך העמודה. לשטיפה השנייה, הוסיפו 400 µL של תמיסות שטיפה ל-RNA לכל עמודת ספין, וסובבו אותן בצנטריפוגה. שפכו את הנוזל שעבר דרך העמודה.עבור סבב הסנטריפוגה היבש, סובב את עמודת הספין בצנטריפוגה כדי להסיר את כל שאריות תמיסת השטיפה. העבר בזהירות את עמודת הספין לשפרוֹר מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5-milliliter. הוסף 25 µL של תמיסת אלוציה על עמודת הספין, והדגר את העמודה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להגביר את התשואה של ה-viral RNA מהעמודה.אספו את ה-RNA על ידי צנטריפוגציה של עמודת הספין (spin column) ב-10,000 ×g למשך דקה אחת. המשיכו ישירות ל-PCR בזמן אמת. לפני המשך עם multiplex real-time RTPCR, נקו את משטחי העבודה, הפ pipette-ים והצנטריפוגות באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNase.הפסיקו את הקפאת ריאגנטי ה-real-time PCR על קרח. הפסיקו את הקפאת ה-RNA של הדגימות על קרח באזור נפרד. קבעו את מספר התגובות, והכינו לפחות 10% ריאגנט נוסף עבור תערובת המאסטר (master mix) כדי לפצות על אובדן במהלך הפיפטינג.בשלב הבא, ערבבו באמצעות וורטקס (vortex) את מרכיבי התערובת הראשית (master mix) בנפרד למשך חמישה שניות. ערבבו בעדינות את האנזים על ידי נקישה קלה על השפופרת. סובבו את מרכיבי התערובת הראשית בצנטריפוגה למשך חמישה שניות.לאחר מכן, הכין את תערובת המאסטר (master mix) לזיהוי RTPCR של נורו-וירוס G1 ו-G2 בהתאם להוראות הערכה, והוסף פריימרים וגששים (probes) אוליגונוקלאוטידיים ספציפיים לנורו-וירוס לתוך מבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן, ערבב את תערובת המאסטר באמצעות פיפוט שבע פעמים למעלה ולמטה. חלק 22 µL מתערובת המאסטר לכל באר בלוח ה-real-time PCR.ערבב את ה-RNA של הדגימה במערבל (Vortex) למשך חמישה שניות, ואסוף את התכולה באמצעות סנטריפוגציה למשך חמישה שניות. הוסף שלוש מיקרוליטרים של בקרות חיוביות של RNA של הדגימה ודילולות סדרתיות של פי 10 של תמלילי RNA של G1 ו-G2 ללוח ה-real-time PCR. הוסף שלוש מיקרוליטרים של מים נקיים מנוקליאז (nuclease-free water) לבארות של בקרת תבנית ריקה, או NTC.אטמו את הפלטה באמצעות סרט דביק אופטי. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה בזהירות במהירות של 1,300 ×g למשך דקה אחת כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזל שעלולות להיות בבארות. לאחר מכן, הגדירו את ה-real-time PCR והזינו את תנאי המעגליות התרמית (thermocycling).קבעו את עקומות הכיול עבור תמלילי ה-G1 וה-G2. המירו את ערכי ה-Ct למספר עותקי RNA באמצעות עקומת הכיול המתאימה. חשבו את היחס בין נפח תמיסת השטיפה (eluent) של ה-RNA הכולל לבין כמות ה-RNA הכוללת ששימשה לבדיקת ה-real-time, כדי לחשב את המספר הכולל של עותקי RNA לדגימה.כדי לבצע גנוטיפיקציה של הדגימות החיוביות לנוירווירוס באמצעות RTPCR קונבנציונלי חצי-מקנן (hemi-nested), הכין תחילה תערובת מאסטר (master mix) לסבב ה-RTPCR הראשון, וחלק מנות של 20 µL למבחנות PCR מסומנות מראש. הוסף 5 µL של RNA לכל מבחנה. לאחר השלמת סבב ה-RTPCR הראשון, הכן תערובת מאסטר לסבב ה-PCR השני, החצי-מקנן, על ידי חלוקת מנות של 23 µL למבחנות חדשות.לבסוף, הוסיפו שני מיקרוליטרים של תוצר ה-PCR מהסבב הראשון לכל מבחנה. שיטת דגימת המטבון מבוססת המקרו-ספוג נבחנה בשטח על דגימות שנאספו מאוניית תסבור שדווחו בה מקרים של חשד לגסטרואנטריטיס על ידי נורו-וירוס. ארבע מתוך 17 דגימות המטבון שהיו חיוביות לנורו-וירוס היו ניתנות לטיפוס גנטי, ובכל הדגימות נמצאו רצפי G2 זהים.קביעת העומס הוויראלי אפשרה את הערכתם של משטחים שהיו מזוהמים קשות, כגון מושבי אסלה. הקשר בין ערכי סף המחזור, או ערכי Ct, נקבע באמצעות RTPCR בזמן אמת ביכולת לרצף דגימות אלו. בסך הכל, 127 מתוך 217 דגימות מטשח נמצאו חיוביות לנורו-וירוס G2.דגימות מצחון עם ערכי Ct בין 24 ל-27 ובין 28 ל-31 עברו טיפוס גנטי בשיעורים של 100% ו-72.2% בהתאמה. לעומת זאת, רק 22% ו-1.6% מדגימות מצחון עם ערכי Ct בין 32 ל-36 ובין 37 ל-40 רצפו בהצלחה. כפי שהדגמנו, פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את רמת הזיהום הסביבתי במהלך התפרצויות של נורו-וירוס, לזהות את הגורם האפשרי להתפרצות כאשר דגימות קליניות אינן זמינות, וכן לקבוע את יעילותם של נהלי הניקיון.לקבלת התוצאה המדויקת ביותר, חשוב מאוד לפעול לפי פרוטוקול זה בדיוק כדי למזער את השונות בתוצאות בין הדגימות השונות.

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

צעד אחד RT-PCR assay לגילוי וזיהוי genogroup של מבודד norovirus מ כיסאות ילדים, אשר מנצל primers ו בדיקות TaqMan ספציפיים מסגרת קריאה פתוחה 1 (ORF1)-ORF2 באזור צומת, האזור משומר רוב הגנום norovirus הוא תיאר. לא מסחרי, חסכונית שיטת מיצוי RNA הוא מפורט.

איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי (VLPs) הנקשרים לחיידקי מעיים אנושיים. התרחיפים החיידקיים מעורבבים עם ה-VLPs ומודגרים כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של חיידקי VLP. לאחר מכן מסומנים הקומפלקסים בנוגדנים ספציפיים ל-VLP המתויגים כפלואורופורים, ולאחר מכן הדמיה וכימות מבוססי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את אחוז החיידקים הקשורים ל-VLP.

בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

תרגיל מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. ישנן מגבלות מדידה שונים, בעיקר בנוגע לכמות הזמן הדרוש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני האבחון. הפגינו הוא הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים.

אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים

למד שיטת דגימה ספוגית מבוססת מקרופום לזיהוי norovirus על משטחים קשים. פרוטוקול זה משפר את שיעורי הזיהוי ומסייע בחקירת התפרצויות וניטור סביבתי.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

גלה סרטונים נוספים