Name: פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי Acufection ויישומו מחקר עור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למד שיטת Acufection להעברת DNA פלסמידי לעור עכברים בחסכון עלות. חקור תפקוד גנים הקשורים למערכת החיסון בדלקת עורית ופסוריאזיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). אנו מודים בני זוג. בטי וו-צ&#39;יי Chien-קואו לי בבית NTU, ליי זרבוני באוניברסיטת סטנפורד וד&quot;ר פיטר הופמן באוניברסיטת הוואי לקריאת כתב היד, יון Chien ב NTU לקבלת סיוע טכני, וד&quot;ר וון-צ&#39;י וויי ב ביוטכנולוגיה החקלאות מרכז המחקר בבית Academia Sinica לקבלת ייעוץ טכני.

<ol><li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+toxicology+%3A+JAT%22%5BJournal%5D)">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li>
<li>Liu, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+HIV+DNA+vaccine+with+cytokine-expression+plasmids+induces+strong+antigen-specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses.</a> Vaccine. 20, 42-48 (2001).</li>
<li>Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+viral+vectors+for+epidermal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer.</a> J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).</li>
<li>Partidos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+vaccines+into+the+skin+without+needles+and+syringes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Delivering vaccines into the skin without needles and syringes.</a> Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).</li>
<li>Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+DNA+through+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunization with DNA through the skin.</a> Methods. 31, 232-242 (2003).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356, 152-154 (1992).</li>
<li>Haynes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-mediated+DNA+vaccine+delivery+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).</li>
<li>Tuomela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+general+safety+of+a+naked+DNA+plasmid%2C+GTU-MultiHIV%2C+in+a+rat%2C+using+a+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method.</a> Vaccine. 23, 890-896 (2005).</li>
<li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+skin+and+wound+by+microseeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding.</a> J Surg Res. 78, 85-91 (1998).</li>
<li>Lee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternatively+spliced+IL-15+isoform+modulates+abrasion-induced+keratinocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation.</a> J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).</li>
<li>Rudy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod+%28Aldara%29%3A+modifying+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Imiquimod (Aldara): modifying the immune response.</a> Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).</li>
<li>van der Fits, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod-induced+psoriasis-like+skin+inflammation+in+mice+is+mediated+via+the+IL-23%2FIL-17+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis.</a> J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CXCR2+and+BLT1+facilitates+neutrophil+infiltration+and+resultant+keratinocyte+activation+in+a+murine+model+of+imiquimod-induced+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis.</a> J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).</li>
<li>Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+untranslated+region%2C+signal+peptide%2C+and+the+coding+sequence+of+the+carboxyl+terminus+of+IL-15+participate+in+its+multifaceted+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control.</a> J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77, 61-68 (1989).</li>
<li>Tan, X., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+IL-15+isoforms+generated+by+alternative+splicing+are+expressed+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium.</a> Genes Immun. 7, 407-416 (2006).</li>
<li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes%3A+evidence+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li>
<li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li>
<li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes%27+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li>
</ol>

אין המחברים אינטרסים פיננסיים לחשוף.

השלב הקריטי ביותר להבטיח את הביטוי של פלסמיד דנ&quot;א acufected הוא להתנדנד באופן שווה לשחרר את שכבת חרמן העור. בעוד דוחף מחטים בעדינות בלי לחתוך את העור, הכוח צריך להיות מספיק חזק כדי לדכא את השטח. כדי להקל על קליטת ה- DNA בתמיסה 10 μL על פני שטח 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ, מחטים צריך להתנדנד מעלה ומטה במשך כ 100 פעמים ב 30 s. אפשר לקבוע את הכוח שצריך לדקור את העור ועל ידי ציון מספר פעמים כי יש צורך להניב את רמת הביטוי הטוב ביותר של הגן acufected. <p class="jove_content" style=...

העור הוא קו ההגנה הראשון המארח. קרטינוציטים (KCS) הם סוג התאים העיקרי בעור של בני אדם ועכברים. בתגובה לגירויים סביבתיים (למשל השמש, חמצן, כימיקלים הפלישה פתוגניים), KCS מופעלים לייצר מגוון רחב של ציטוקינים מעודדי דלקת וכמוקינים כגון IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α ו- GM-CSF 1. יחד הם מפעילים את הגיוס של תאי מערכת החיסון של העור. דלקת עורית מחמירות קשורה לעיתים קרובות עם מחלות אנושיות רבות כולל דלקת עור ממגע אקטופי חריפה ודלקת בתיווך התא T כרונית (דלקת עור אלרגית ממגע למשל ופסוריאזיס) 2. ויסות תגובות מעודדות דלקת בעור על ידי עיכוב הפעלת KC היא גישה סבירה לטיפול בדלקת עורית. פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לבטא את גן ציטוקינים זמני האפידרמיס על מנת ללמוד מיל חיסוניponse תוצאתי כדי טיפול כזה בעור. האפידרמיס מלחין השכבה השטחית ביותר של העור. הוא משמש כמחסום פיזי שמירת חומרים חיצוניים כגון חומצות גרעין ופתוגנים מלהיכנס לשכבות העמוקות של העור. כמה טכניקות מחט ללא הוקמו DNA אפידרמיס העברת 3, 4. דנ&quot;א בתמיסה או הקשורים ליפוזומים קטיוני או וקטורים אדנווירוס יושם ישירות האפידרמיס שונה עם טכניקות כגון הסרת השכבה הקרנית או הטיפול עם depilating מגיב. הסרת האפיתל cornified מקל DNA חציית מחסום האפידרמיס ואינטראקציה עם קרטינוציטים ותאי לנגרהנס לגרום תגובה חיסונית 5. בעוד שטח פנים גדול זמין עבור העברת דנ&quot;א גישה זו אינה כרוכה מחטים, ישנם חסרונות לרבות הדרישהעבור הכמויות הגדולות של DNA (10 - 100 מיקרוגרם), יחס קשה על העור על ידי הפשטה, ואת התוצאות לא העקביות בזירוז תגובה חיסונית של חיות המחוסנות בלי מאיץ משלוח DNA 6. Microparticle בתיווך משלוח תאי של DNA ערום אל העור הוכח להיות יעיל מאוד לשחזור גרימת תגובה חיסונית 7, 8. אקדח גני כף יד נעשה שימוש כדי להפציץ את אתר יעד עור עם חלקיקי זהב מצופה פלסמיד דנ&quot;א 2 מיקרומטר בקוטר בגודל באמצעות זרימת אוויר הליום בלחץ 9. ה- DNA פלסמיד כנראה הוא נלקח על ידי תאים דנדריטים KCsand (DCS) בעור ואת החלבון מתבטא באופן מקומי או מועברים ניקוז בלוטות הלימפה ידי DCs 10. למרות שמערכת אקדח גנים היא פשוטה ודורשת ניסיון טכני מוגבל, העלות להכנה ושולח את &quot;bul DNAתן &quot;(כלומר אבקות זהב, גז הליום) ועבור אקדח הגן עצמו הגביל היישום הכללי שלה. בנוסף, הדרישה עבור מערכת הולכת גז הליום מגביל את הקלות של תחבורה אקדח גנים כאשר הניסויים נערכים במקומות שונים. Microseeding הודגם להשיג יעילות גבוהה יותר של העברת גנים מ זריקה אחת חלקיקי הפגזה 11. Microseeding משתמשת אקדח קעקוע להעביר דנ&quot;א לעור ללא שימוש חרוזי חלקיקים 11. מתנודד microneedles על העור באמצעות גישה זו עשוי ישירות לגרד את קרום התא ובכך להעביר DNA לתאים מרובים בו זמנית. עם זאת, הכאב הקשור למספר רב של זריקות עם מחטים 0.254 מ&quot;מ בקוטר הוא חיסרון. כאן אנו מספקים גישה חלופית למסירת DNA in vivo. את &quot;acufection&quot; </strאונג&gt; פרוטוקול שתיארנו כאן מספק דרך חסכונית ויעילה כדי לספק פלסמיד דנ&quot;א בעור העכבר. בקצרה, עשר מחטי הדיקור (0.2 מ&quot;מ קוטר x 13 מ&quot;מ אורך) היו כבולים צרור ידי דבק. נפח של 10 μL של PBS עם 10 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד המכיל את הגן של העניין הושם על עור אגף המגולח, מקריח שטופל בקרם. באמצעות חבילה מחט דיקור להתנדנד המשטח (1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ) של העור, keratins על שכבת חרמן התרופפו ואת פלסמיד דנ&quot;א מיושם על פני השטח נטמע האפידרמיס. ניזק לעור היה פיקוח ונמצא מינימאלי. ביטוי של גן טרנספקציה בעור acufected אושר על ידי שני כמוני בזמן האמת PCR (qRT-PCR) ו- ELISA. השפעות modulatory החיסוניות של-נמסר acufection IL-15ΔE7 על דלקת עורית הודגמו באמצעות מודל עכבר מטופל-IMQ 12. בעוד acufection מוכיח להיות Dema קל ופחותnding שיטה למסירה DNA in vivo, את הכמות האופטימלית של DNA עבור גנים שונים בזמנים לדקור את העור צריך להיות מותאם בקפידה כדי להשיג תוצאות לשחזור.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>מכשיר רפואי</td></tr><tr><td>NairTM כנסיית קרם</td><td>& Dwight</td><td>N/A</td><td>שימוש להסרת שיער</td></tr><tr><td>תחליף Shandon Xyline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinization</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>ממס להמסת אברטין</td></tr><tr><td>DifcoTM מרק LB, מילר</td><td>BD</td><td>244620</td><td>ריבוי ותחזוקה של E. coli לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>עכבר IL-15/IL-15R קומפלקס ELISA Ready-SET-Go</td><td>ערכת eBioscience</td><td>88-7215</td><td>מדידת חלבון IL-15</td></tr><tr><td>אנטי-עכבר Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>נוגדן המשמש לכתמים אימונוהיסטוכימיים</td></tr><tr><td>נגד עכבר Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>נוגדן המשמש ל כתם אימונוהיסטוכימי</td></tr><tr><td>עכבר כתם פשוט MAXPO (עכברוש)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>מגיב לחסימת אות רקע בכתם עכבר על עכבר</td></tr><tr><td>ערכת מצע DAB Peroxidase (HRP) Vector</td><td>Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>מצע פרוקסידse לכתם אימונוהיסטוכימי</td></tr><tr><td>בלוק Ultra V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>הפחתת כתמי רקע לא ספציפיים</td></tr><tr><td>מתיל ירוק</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>צביעה גרעינית</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>שימור לצמיתות של כתמים היסטוכימיים</td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>מעכב את פעילות הפרוטאז בליזאט התאים</td></tr><tr><td>קרם אלדרה</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% קרם אימיקימוד</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>להשתמש כדי לרסק רקמת עור</td></tr><tr><td>ABI7900HT Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>בדיקת PCR כמותית בזמן אמת</td></tr><tr><td>מצלמת וידאו</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>תיעוד תמונה</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופיה בשדה בהיר</td></tr></tbody></table>

פיתוח של מערכת מסירת dna החסכוני ידי &quot;acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

חוסר ויסות תגובה חיסונית עור קשור מחלות עור אדם רבות. העברה ישירה של גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמת עור היא גישה מרתקת לחקור אפנון חיסון של דלקת עורית בעכברי מודל של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול חסכוני כי נמסר DNA עירומה עור עכבר ומוביל ביטוי transgene. השיטה שטבע &quot;acufection&quot;, המציין fection טרנס בתיווך לנקב ACU DNA. כדי לבצע acufection, עכבר עור היה חדור ראשון עם ה- DNA פוספט שנאגר מלוח (PBS) ולאחר מכן דקר בקלילות עם חבילה של מחטי דיקור כדי להקל על קליטת ה- DNA ואת transfection לתוך תאים. ה- DNA פלסמיד כנראה נלקח על ידי keratinocyte ותאים דנדריטיים (DCS) בעור והביע לתוך חלבון. שמוק מכני עם מחטים כשלעצמה לא לגרום נזק לעור או לגרום ההפעלה keratinocyte. הביטוישל גנים טרנספקציה אותרה בעור ברמות תעתיק ו translational הן הבאות acufection עבור 2 ימים ומתוחזק עד 7 ימים. המטרה העיקרית לפיתוח שיטה acufection זה היה כדי לחקור איזופורם מוגדר בעבר של IL-15. באמצעות שיטה זו, איזופורם שחבור חלופי IL-15 עם 7 אקסון נמחק חלקית (IL-15ΔE7) הובעה בעור ובהמשך מטופלים עם קולטן אגרה דמוי 7 (TLR7) אגוניסט, imiquimod (IMQ), כדי לגרום לדלקת. Acufection-נמסר IL-15ΔE7 בעור מודחקים התפשטות keratinocyte, עובי אפידרמיס גיוס נויטרופילים דלקת עורית הנגרמת IMQ. עם הגדלת ריבית בזיהוי מנגנוני הוויסות של דלקת עורית, הפרוטוקול המתואר כאן מספק אלטרנטיבה יעילה תכליתית עלות למערכת אקדח הגנים או microseeding למסירת DNA in vivo. זה עלול פוטנציאלי לאפשר גילוי הפונקציה של רומןהגן בעור או לחקירת הטיפול החדש למחלות עורית.

בעוד כמה אדמומיות בלטה במהלך השעה הראשונה לאחר לדקור עם מחטי דיקור, העור מנוקה ביום 2 ואין תגובה של עור לוואי עד יום 7 נצפתה לאחר לדקור (איור 2 א). דוקר מחט המושרה ברמה נמוכה מאוד של orthokeratosis אפידרמיס הסתננות עורי מינימלית על ידי ניתוח H &amp; E לעומת העור מטופל (איור 2B). עובי אפידרמיס (איור 2 ג) ואת מספר תאי Ki67 + (איור...

פרוטוקול זה מהווה חלופה חסכונית להיבעת פלסמיד דנ&quot;א עירומה עור עכבר. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לספק גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמות עור כדי להתוות את התפקיד הפונקציונלי של גן ספציפי דלקת עורית.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להחדיר גנים הקשורים למערכת החיסון לרקמת עור, כדי לאפיין את התפקיד התפקודי של גן ספציפי בדלקת עורית. שיטה זו יכולה לסייע בגילוי התפקיד של גן חדש בעור, לצורך פיתוח טיפולים חדשים למחלות עוריות כגון פסוריאזיס.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך חסכונית לביטוי DNA פלסמי בעור עכבר. להכנת ה-DNA הפלסמי, יש להחדיר מושבה בקטריאלית שנבחרה והועברה בעבר לתוך 3 mL של מצע LB בתוספת אנטיביוטיקה. יש להדגיר את התרבית למשך לילה במכשיר ניעור בטמפרטורה של 37 °C.לאחר דגירה של לילה, דללו את תרבית החיידקים ב-250 milliliters של מצע LB, בתוספת אנטיביוטיקה, להגדלת תרבית החיידקים. דגרו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך써 ניעור. השתמשו בערכה איכותית להכנת פלסמיד נקייה מאנדוטוקסינים להפקת כמות גדולה של DNA.דללו את ה-DNA הפלסמי שהתקבל ב-PBS סטרילי עד לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. לאחר הרדמת העכבר, מרחו משחה פתולוגית וטרינרית על עיניו כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, גלחו את העור בגב החיה.יש להניח קרם להסרת שיער כדי להמיס חלבוני קרטין במומחי השערות שנותרו. לאחר הסרת השיער, יש להסיר את הקרם בעזרת פן ספוג במים. בעזרת מקלוני צמר גפן סטריליים ספוגים ב-70% ethanol, חטא את פני העור וסמן את אזור העור המיועד בעזרת השבלונה שהוכנה מראש. יש להחיל 10 µL של תמיסת DNA המכילה 10 µg של plasmid DNA על אזור העור הרצוי.כדי לבצע דיקור בעכבר, החזיקו את מכשיר הדיקור בניצב לעור ודקרו שוב ושוב את הפני השטח הייעודיים. יש לדקור 100 פעמים במשך 30 שניות או עד לספיגת התמיסה שנמרחה על העור. כדי להשיג ביטוי מוצלח של DNA פלסמיד ברקמת העור, חשוב להימנע מדיקור עמוק מדי בעור ולוודא שהתמיסה של ה-DNA נספגה היטב.לאחר השלמת הפרוצדורה, הניחו את העכבר המטופל על פד חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו עד להתאוששות מההרדמה. כאשר העכבר מחזיר לעצמו הכרה מספקת, החזירו אותו לכלובו וספקו לו מים ומזון. עקבו מקרוב אחר העכבר כדי לזהות סימנים של אי-נוחות, כולל שינויים התנהגותיים או מראה חריג, במהלך 48 השעות הראשונות לאחר הפרוצדורה.סמנו את עור השוק המכסה את האזור בגודל שני סנטימטרים על שני סנטימטרים שהושפע בעבר מ-IL-15deltaE7. לאחר מכן, בעזרת מקלוני צמר גפן, מרחו קרם Imiquimod באופן מקומי על שטח הפנים המסומן. כדי לנטר שינויים יומיים בעור הגב המטופל ב-Imiquimod, חוקר אחד יתעד בעוד שהשני יחזיק את העכבר בצורה מאובטחת ויחשוף את האזור המטופל למבט של מצלמת הווידאו ברזולוציה גבוהה.חפשו שינויים כגון קשקשת כסופה, פלאק או אריתמה על העור המטופל. לאחר הקטלת העכבר כפי שתואר, בצעו חתך אופקי בבסיס הזנב באמצעות מספריים סרולוגיים והרחיבו את החתך דו-צדית לכיוון בסיסו של כל רגל אחורית. לאחר מכן, המשיכו בחתכים אנכיים המיושרים עם צדי הגוף ומגיעים לבסיסן של ארבע הגפיים.קלפו בזהירות את העור מהרקמה שמתחתיו, החל מהזנב לכיוון ראש בעל החיים. בעזרת מספריים, הסִירו את העור הגבי יותר והעבירו את הדגימה שהתקבלה לצלחת פטרי סטרילית. בעזרת סכין מנתחים, הסִירו דגימה מתאימה מהעור המיועד.לאחר מכן, הקפיאו אותו מיד בחנקן נוזלי. כדי לטחון את רקמת העור, הניחו את הדגימה הקפואה במרכזו של טחון רקמות בעל שני תאים שקורר מראש, המצויד בידיות ובפסטל, והשתמשו בפטיש עופרת על המכתש. העבירו מיד את הרקמה הטחונה למבחנות חדשות המכילות את הריאגנטים המתאימים לכל ניתוח המשכי.התחילו את הליך הצביעה על ידי חימום השקופיות של חיתוכי העור המקובעים בפורמלין והמוטמעים בפרפין, שהוכנו כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, בטמפרטורה של 65 degrees celsius למשך 15 דקות. טבלו את השקופיות פעמיים ב-xylene למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו רהידרטציה לשקופיות באמצעות מדרג של ethanol.לבסוף, שטפו את השקופיות במי ברז למשך שלוש דקות לפני הצביעה. עבור צביעה אימונוהיסטוכימית, תחילה סמנו עיגול מסביב לרקמה בעזרת עט עמיד למים, ולאחר מכן דגרו את החיתוך עם תמיסת חסימה כדי למנוע צביעת רקע לא ספציפית. לאחר החסימה, שטפו את השקופית ב-PBS.בשלב הבא, העבירו בעזרת פפטה את הנוגדן הראשוני המדולל אל החתך והדגירו אותו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-TBST למשך חמש דקות. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת של הפולימר המסומן על החתך והדגירו את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.לאחר מכן, שטפו את הפסחית שלוש פעמים ב-TBST למשך חמש דקות, תוך החלפת התמיסה בין השטיפות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת DAB על גבי חתיכות הרקמה והמתינו לתגובה בטמפרטורת החדר, עד להופעת תוצר חום תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן, שטפו את השקופיות במים כדי לעצור את פעילות הפרוקסידאז. בצעו צביעה נגדית של החיתוך בתמיסת Methyl Green, הנקשרת באופן ספציפי ל-DNA, למשך חמש שניות. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם.הנח על החלק הצבוע שמונה מיקרוליטרים של חומר הרכבה קבוע וכסה אותו בזכוכית כיסוי. לבסוף, דגם תמונות מהשקופיות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מוצגים כאן עכבר בקרה ועכבר שעבר acufected למשך שעה אחת, יומיים, חמישה ימים או שבעה ימים לפני שלב הצילום.כפי שמוצג כאן, הליך ה-acufection לא גרם לנזק בולט לעור. יתרה מכך, ה-acufection לא השפיע על עובי העור או על מספר התאים החיוביים ל-Ki67. ממצאים אלה מאשרים עוד כי ההליך אינו גורם להרס רקמות או לשגשוג של תאי האפידרמיס.הביטוי של CXCL-1 ו-IL-6 שנמדד באמצעות qRT-PCR. תוצאות אלו מאשרות הפעלה מינימלית של קרטינוציטים שנצפתה תחת acufection. מנגד, qRT-PCR ו-ELISA הדגימו ביטוי מודגש של IL-15 בעור של עכברים שעברו acufection של הגן IL-15.בסופו של דבר, הובלה של הגן IL-15deltaE7 לרקמת העור באמצעות acufection מונעת התפתחות של קשקשת בעור וחדירת נויטרופילים בעכברים שטופלו ב-Imiquimod. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בתוך 12 דקות אם הוא מבוצע כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין חבילה חדשה של מחטים עבור כל acufection ומנה של DNA פלסמיד באיכות גבוהה.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון הדבקה בנגיף, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון תפקידו של גן חדש בוויסות התגובה החיסונית האנטי-ויראלית. לאחר פיתוחה, תסלול שיטה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקר התגובה החיסונית בעור. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד להשרות ביטוי של DNA פלסמידי בעור עכבר באופן חסכוני.

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול וידאו זה מתאר טכניקה מבוססת קלטות בתרבית חוץ גופית ליצירת עור אורגנוטיפי אנושי באמצעות קרטינוציטים אפידרמיס ודרמיס אנושי סוטה. הם מחקים את התפקוד והפיזיולוגיה של עמיתיהם ברקמת in vivo.

תרבות עור תלת-ממדית אורגנוטיפית: טכניקה מבוססת קלטות בתרבית חוץ גופית לחידוש האפידרמיס האנושי על דרמיס אצלולרי

הסרטון מדגים שיטה להעברה ישירה של DNA פלסמיד מקודד אינטרלוקין-15 לרקמת העור של מודל עכבר חסר אינטרלוקין-15 באמצעות דיקור באמצעות מיקרו-מחטים. מיקרו-מחטים אלה מייצרות מיקרו-נקבים בשכבת העור החיצונית ביותר, מה שמקל על ספיגה והעברה של DNA פלסמיד לתאי האפידרמיס, כולל קרטינוציטים, בתוך רקמת העור.

העברה בתיווך אקופקציה של גנים הקשורים למערכת החיסון לרקמות העור של עכברים

קעקוע עור הוא דרך חזקה ובטוחה לאספקת חיסון DNA intradermally. כאן, EGFP קידוד DNA פלסמיד מועבר בקעקוע על העור של עכבר מעבדה, והביטוי של EGFP בתאי העור ואז ייבדק על ידי מיקרוסקופיה confocal.

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

מחקר זה מדגים את התכנות מחדש של תאים סומטיים לקראת פלוריפוטנטיות in vivo ללא יצירת טרטומות. השתמשנו בהזרקת וריד זנב הידרודינמית של DNA פלסמיד המקודד את גורמי Yamanka כדי לגרום לתכנות מחדש in vivo של הפטוציטים בוגרים לתאים בעלי פלוריפוטנטיות מוגברת.

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

במאמר זה נדגים איך מתבצעת טכניקת microbiopsy סופג ו איך המדגם יכולים לשמש לחילוץ RNA לדיגום סימולטני ופשוט של עור ודם בצורה פולשנית.

. Microbiopsy ספיגה דגימה והפקת RNA דם פולשנית ובו-זמניים וניתוח בעור

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

במאמר זה אנו מתארים שיטות לייצור מיקרו-ייצור של ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית (VACNFs), העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים לצורך העברת ביומולקולות וצבעים.

שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית על מצעים קשיחים או גמישים להעברת ביומולקולות וצבעים לצמחים

למד שיטת Acufection להעברת DNA פלסמידי לעור עכברים בחסכון עלות. חקור תפקוד גנים הקשורים למערכת החיסון בדלקת עורית ופסוריאזיס.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי "Acufection" ויישומו מחקר עור

גלה סרטונים נוספים