מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות במבחנה הבשלת ביצית דג הזברה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע התבגרות חוץ גופית של ביציות דגי זברה, ובמידת הצורך, לבצע מניפולציה תפקודית של תוצרי הגנים האימהיים, לפני ההפריה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, הנוגעות לחשיבות התרומה האימהית לעובר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תרבית ביציות במבחנה, ואחריה הפריה וייצור של עוברים ברי קיימא.

ואם תרצה, מאפשר מניפולציה פונקציונלית של תוצרי גנים אימהיים הפועלים בעובר המוקדם מיד לאחר ההפריה. כדי להתחיל, שמונה עד 10 ימים לפני המניפולציה של תרבית במבחנה, השתמש ברשת דייגים כדי להעביר מספר קבוצות של זכר בודד ונקבה אחת של דג מהזן הרצוי למיכל הזדווגות. השאירו אותם במיכל ההזדווגות למשך הלילה.

לאחר שאפשרתם לדגים להזדווג עד אחר הצהריים שלמחרת, השתמשו ברשת דייגים כדי להפריד את הנקבות המניבות ביצים במהלך ההזדווגות והניחו אותן במיכל נפרד. האכילו את הנקבות הללו פעמיים ביום בתערובת מזון המכילה כמות שווה בערך של שרימפס מלח ופתיתי מזון דגים. בתנאים סטריליים, הוסף 20 מיליליטר של L-15 Medium של לייבוביץ עם L-גלוטמין, PH 7.0, לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, השתמש ב-10 נתרן הידרוקסיד רגיל כדי להביא אותו ל-PH 9.0. הוסף 9 מיליליטר של ה-L-15 Medium לשני צינורות חרוטיים נפרדים של 50 מיליליטר. לאחר מכן, סמן צינור אחד DHP והשני DHP.

בצינור DHP מוסיפים 10 מיקרוליטר DHP, 490 מיקרוליטר DH2O ו-500 מיקרוליטר של 10% BSA. בצינור ה-DHP מוסיפים 100 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר גנטמיצין, 400 מיקרוליטר DH2O ו-500 מיקרוליטר של 10% BSA. כדי לבצע דיסקציה של ביציות, התחל בהכנת תמיסת מלאי טריקאין של 0.2% ב-DH2O, עם חוצץ ל-PH 7.0 עם טריס טוחנת אחת PH 9.0.

שמור על תמיסה זו על 4 מעלות צלזיוס. אפס עד ארבע שעות לפני סיום מחזור האור היומי במתקן, בכוס של 250 מיליליטר, מוסיפים 20 מיליליטר של תמיסת מלאי טריקאין של 0.2%, PH 7.0, ל-80 מיליליטר מי דגים ומערבבים. חשוב להתחיל את ההליך תוך ארבע שעות מסוף מחזור האור שאליו רגילים הדגים.

אחרת, הביציות לא יתבגרו כראוי. בעזרת כף אוספים את הדגים המורדמים מתמיסת הטריקאין, ושוטפים אותם לזמן קצר במי דגים. לאחר מכן, הניחו את הדג על מגבת נייר לספיגת עודפי מים.

השתמש בסכין גילוח נקי כדי לערוף את ראשו של הדג שהומת בגובה סנפיר החזה. לאחר מכן, בעזרת מספריים מנתחים, בצע חתך אורכי בצד הגחון של הדג, המשתרע מהקצה הקדמי לאזור פי הטבעת. הניחו את הדג על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ מנתח עם אור מקרי.

לאחר מכן, בעזרת זוג מלקחיים לניתוח, בודדו חלקי שחלה והעבירו את הרקמה לתבנית תרבית בגודל 35 על 10 מילימטר, המכילה ארבעה מיליליטר של L-15 Meidum, DHP. כעת, בעזרת מלקחיים מנתחים יש לנתק בעדינות את הביציות מהמסה הזקיקית. מיין את ארבע הביציות בשלב המוקדם, שגודלן כמעט מקסימלי, ומאופיינות בציטופלזמה אטומה כהה, ושלפוחית נבט הנראית בקלות, או GV, הממוקמת באופן א-סימטרי בתוך הביצית.

השליכו ביציות בשלבים מוקדמים יותר, וביציות בוגרות שקופות בשלב 5. השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר את ארבע הביציות בשלב המוקדם לצלחת תרבית פלסטית שנייה בגודל 35 על 10 מילימטר, המכילה ארבעה מיליליטר של L-15 Medium של לייבוביץ, בתוספת DHP. העבירו כמויות מינימליות של מינוס מדיום DHP למנה, המכילה את תמיסת הפלוס DHP.

אם מזריקים mRNA, מיד לפני ההזרקה, השתמשו במי אוסמוזה הפוכה בדרגת RNA וב-0.2 אשלגן כלורי מולארי כדי לדלל את ה-MRNA לתמיסה סופית של 0.1 אשלגן כלורי מולרי. אם מזריקים מורפולינו, או MOs, מיד לפני ההזרקה, יש לדלל את ה-MOs לריכוז הרצוי באמצעות מי אוסמוזה הפוכה בדרגת RNA, ו-0.2 אשלגן כלורי מולארי, כדי להשיג ריכוז סופי של 0.1 אשלגן כלורי מולרי. לאחר מכן, כדי לבצע הזרקה, החזיקו ידנית ביציות עם מלקחיים עדינים, ובאמצעות מחט העשויה מפיפטה נימית זכוכית משוכה, הזריקו כ-1 ננו-ליטר לביציות שלב 4 מסוג בר.

המשך לדגור את הביציות הלא בשלות והמוזרקות במדיום DHP בטמפרטורה של 26.5 מעלות צלזיוס. בדיקה כל 30 דקות בערך כדי לוודא שהביציות נשארות שלמות, ועוברות התבגרות תקינה, על ידי הפיכתן לשקופות בהדרגה. השתמש בפיפטת מרעה כדי להסיר ביציות ליזינג.

והשליכו אותם לכוס פסולת מעבדה, כדי לשמור על איכות המדיום. עם כמחצית מנפח מדיום ה-DHP הטרי, החלף את מדיום התרבות כדי לשמור על תמיסה ברורה, בהתאם לכמות ליזיס הביציות. כאשר רוב הביציות הפכו שקופות, ויש להן GV שכבר אינו נראה לעין, השתמש במלקחיים עדינים במיוחד כדי ליצור קרע בקרום הזקיקי, באזור עם מרווח גדול יותר בין הביצית לממברנה.

מקלפים חלק מהקרום, ותוך כדי החזקת החלק הקלוף, מגלגלים את הביצית מהקרום. שלב קריטי נוסף הוא הסרת קרום הזקיקים. אם שכבה זו לא תוסר במלואה, ההפריה והתרחבות הכוריון ייפגעו.

העבירו את הביציות המפוזרות בנפח מינימלי של מדיום, לצלחת פטרי עם כמה טיפות של מדיום תרבית DHP, והמשיכו להפריה. לקראת סוף שלב הבשלת הביציות, ולפני הפירוק, הכינו תמיסת זרע באמצעות אשכים מחמישה זכרים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת האנק. הוסף 10 עד 50 מיקרוליטר של תמיסת זרע לביציות המנוקות במדיום תרבית DHP.

לאחר מכן, המתינו 10 שניות. בעזרת פיפטה מוסיפים כמה טיפות של מדיום E3 לביציות. המתן דקה אחת ואז השתמש במדיום E3 כדי להציף את הצלחת.

לאחר שאפשרתם לעוברים המופריים להתפתח, השתמשו במיקרוסקופ מנתח עם אופטיקה של אור מועבר כדי לצפות בהתקדמות דרך שלבי המחשוף כדי להבטיח הפריה מוצלחת, כפי שתואר קודם לכן להפריה ולבישול. כפי שניתן לראות על ידי הביטוי של GFP, ביציות מתרבית חוץ גופית מסוגלות לייצר חלבון מ-mRNA אקסוגני לאורך התפתחות הביציות תוך שעתיים בלבד. עם זאת, רק ביציות היוזמות תנאי תרבית בשלב הרביעי של הביציות יכולות להתפתח לביציות בוגרות בשלב חמש.

בניסוי זה, mRNA של זוהר הקוטב מסוג בר מוזרק מציל את ההשפעות הפנוטיפיות של מוטציה בגן המקביל לו, האי התאי. העוברים מקבוצת ביקורת מורשים גם להתפתח כדי להראות את הפנוטיפ המוטנטי המתאים. הזרקת מורפולינו חוסם תרגום יכולה להצליח להעתיק את הפנוטיפ המוטנטי הידוע, כפי שמוצג על ידי הזרקת lrmp-MO לביציות, המחקה את הפנוטיפ המוטנטי של מחזור חסר התוחלת של המוטציה המתאימה.

ניתן להזריק קידוד mRNA גם לביציות מסוג בר או מוטנטיות כדי לדמיין את התוצרים המתאימים בתוך העובר המוקדם. לדוגמה, כפי שניתן לראות כאן, חלבון Sass6-mCherry מתמקם במוקדים המסומנים על ידי סמן הצנטרוזום Gamma tubulin. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ -5 עד 6 שעות, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא למהר בהליך, ולאפשר התבגרות נכונה של הביציות לפני דפוליקולציה והפריה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קיבוע עוברים, על מנת לענות על שאלות נוספות. כגון הצלת הגן המעניין שלך, או לוקליזציה של RNA או חלבון.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום היווצרות העוברים המוקדמים לחקור את תרומתם של תוצרי הגנים האימהיים בדג הזברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתפעל פונקציונלית את תוצרי הגנים האימהיים באמצעות התבגרות חוץ גופית של ביציות דגי זברה.