Name: מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות במבחנה הבשלת ביצית דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים בדג הזברה באמצעות הבשלת ביציות במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר תרומת האם לפיתוח העובר וייצור עוברים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי הצוות הניהולי מתקן מעבדה ודגים Pelegri, אשר סייעו להקל את הפרויקט הזה. תמיכה עבור פרויקט זה סופק על ידי NIH R56 GM065303 ו NIH 2 T32 GM007133 כדי ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 ו NIH 2 T32 GM007133 כדי CCE, ו- NIH RO1 GM065303 כדי FP

כל דג הזברה טופלה בהתאם קפדנים עם תרגול חיה טוב, כפי שהוגדרה על ידי הגופים רווחי בעלי החיים לאומיים ו / או מקומי הרלוונטיים, וכל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אונ&#39; A3368-01 מספר האבטחה ויסקונסין-מדיסון). בעלי החיים יוחזקו בתנאים סטנדרטיים ב 26.5 מעלות צלזיוס. 1. טרום בחירה של נקבות הערה: ביציות יכולות נשים בוגרות משתרעות בדרך כלל מגוון של שלבים התפתחותיים, משלב I עד V (איור 2). טיהור הנקבות של ביציות קודמות באמצעות הזדווגות טבעית מוצלחת מגדילה את הסנכרון של היערכות ביצית, כפי שזה עתה בפיתוח ביציות להופיע בתור עוקבה 3, 14. בתוך כ 8 ימים לאחר טיהור, רוב הביציות נמצאות IV בשלב מוקדם, שבו הוא אופטימלי עבור החניכה של הבשלה במבחנה. סנכרון כזה מגדיל את התשואה של ביציות that יכול לעבור את התהליך המלא של הבשלה במבחנה, הקלת מניפולציה ניסויית. ראה 13 תיאורים קודמים לפרטים על הקמת דגי הזדווגויות זיווג ועל הרכב מים ודגים (כאן, 14 גרם של מלח ים 150 גרם של NaHCO 3 ל -1,000 ליטר של מים אוסמוזה הפוכים, pH 6.5-8.5 (טווח מועדף: 6.8 -7.5) לבין מוליכות של 180-360 מיקרו-שניות). ראה ואח &#39;ברנד. 13 מתכונים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמונה עד עשרה ימים לפני המניפולציה תרבות חוץ גופית, השתמשו ברשת דגים להעביר זכר יחיד דג נקבה אחת של זן הרצוי טנק ההזדווגות. קבוצות מרובות זוג. השאירו אותם בן לילה טנק ההזדווגות. אפשר להם להזדווג במהלך הערב ושעות אחר הצהריים של יום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נטו דגים להפריד את הנקבות כי להניב ביצים במהלך ההזדווגות ולמקם אותם למיכל נפרד. Feed הנקבות האלה פעמיים ביום עם תערובת מזון containing כ כמות שווה של ארטמיה פתיתי מזון לדגים. כמות המזון צריכה להיות מספיק כדי לספק כ 20 דקות, אבל לא יותר, זמן האכלה. </li></ol> 2. הכנת התבגרות בינונית הערה: כן בינוני התבגרות ביום הניסוי הבשל חוץ גופייה, בתוך 1 h של הסרת הביציות מן הנקבה (ראה סעיף 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ עם-גלוטמין L, pH 7.0, צינור חרוטי 50 מ&quot;ל בתנאים סטריליים. תביאו אותו pH 9.0 עם 10 N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 מיליליטר של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, כדי 2 צינורות חרוטים נפרדים 50 מיליליטר. לייבל 1 צינור &quot;+ DHP&quot; והשני &quot;-DHP.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת הצינור + DHP, להוסיף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), 490 μL של DH 2 O, ו 500 μL של אלבומין 10% שור (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת הצינור -DHP, להוסיף 100 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin, 40081; L של DH 2 O, ו 500 μL של 10% BSA. </li></ol> 3. Dissection של ביציות וייזום של תרבות חוץ-גופית הערה: ניסוי התרבות במבחנה מתבצע עם נקבות שנבחרו מראש 8-10 ימים אחרי שהם משחררים ביצים באמצעות הזדווגות טבעית. השתמש בינוני בשל שנעשה באותו היום (ראה סעיף 2). ביציות בוגרות כראוי אם לנתיחה החלה סמוכות לסוף מחזור ימי הדגים (נקבע במעבדה על ידי תאורה מלאכותית שנקבע מראש במתקן הדגים) 13, ואולי מחקה תהליכים המתרחשים באמצעות הזדווגות טבעית. משמעות הדבר היא כי רוב השלבים פרוטוקול חייב להתבצע בשעות הערב אם הדגים הם שוכנו במתקן עם מחזור אור רגיל (למשל, מתחילה בצעד 3.2 בשעה 6 בערב במתקן עם תקופת האור 8 am כדי 10 בלילה), למרות עבודה בזמן תקופות אחרות אפשריות עם מחזור אור זמן שהוסט כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות 0.2% tricaine ב DH 2 O, שנאגר עד 7.0 pH עם 1 M טריס, pH 9.0, ולשמור את הפתרון הזה ב 4 ° C. זה יכול להיות מוכן מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את h הניסוי 0-4 לפני סוף מחזור האור היומי במתקן. בכוס 250 מ&quot;ל, להוסיף 20 מ&quot;ל של פתרון מניות 0.2% tricaine, pH 7.0, 80 מ&quot;ל של מים ודגים ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הנקבות שנבחר מראש פתרון tricaine ו להרדים אותם על ידי חשיפת יתר. השאר את הנקבות בפתרון tricaine עבור 15 דקות לאחר הפסקת תנועת זימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כף, לאסוף את הדגים מורדמים מפתרון tricaine ולשטוף אותם בקצרה במים דגים. מניחים את הדג על גבי מגבת נייר כדי לספוג את עודפי המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח נקי לערוף את הדגים מורדמים ברמה של סנפיר החזה. בעזרת מספריים לנתח, לעשות חתך אורכים בצד הגחון של הדג, הרחבת המסוף הקדמי לאזור האנאלי. </li><li&gt; מניח את הדג על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור האירוע. בעזרת זוג מלקחיים לנתח, להעביר חלקים השחלה אל צלחת תרבות 35 x 10 מ&quot;מ המכיל 4 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. הערה: השחלות, אשר מכילות ביציות מתפתחות, תופענה מבנים אטומים וגבשושיים בתוך חלל הגוף הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לנתח, לנתק את הביציות בעדינות מן המוני זקיקים. מיין ביציות מוקדם בשלב IV (איור 2B; לפני התמוטטות GV, בגודל כמעט מירבית מאופיין הציטופלסמה כהה, אטום ו GV ברורה ממבט הממוקם סימטרית בתוך הביצית). בטל ביציות בשלבים מוקדמים יותר (איור 2 א) וביצי V הבמה שקופות, בוגרת (דומות לאלה באיור 2C אך נוכח השחלות לפני טיפול DHP). הערה: ביציות נבחרות התבגרות ב IV בשלב מוקדם, בשלב המוקדם שתוצאתו oocyt הבוגרת, השלב החמישיes אחרי התנאים תרבות במבחנה (איור 2C ו- D) 3. בגלל ביציות בשלב IV מייצרים מוצרים באופן פעיל, מניפולציה בשלב זה מאפשרת ביטוי של מוצרי אקסוגניים באמצעות הזרקת RNA או להפחתת תפקוד הגן באמצעות MOS הציג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet כוס פסטר להעביר ביציות IV בשלב מוקדם כדי בצלחת תרבות הפלסטיק השני 35 x 10 מ&quot;מ המכיל 4 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. העבר כמויות מינימליות של המדיום -DHP אל צלחת ובה הפתרון + DHP. </li></ol> 4. microinjections ביצית הערה: מבודד בשלב IV ביציות עוברת בתהליך הבשלה במבחנה ניתן microinjected להציג ריאגנטים עבור מניפולציה תפקודית או ביטוי חלבון מתויג. את microinjection של ריאגנטים, כגון mRNA ו MOS (ראה סעיף 4), הוא בדרך כלל מתבצע כאשר הביציות עוברות במבחנת matuיחס במדיום + DHP, לפני defolliculation. אם תרצה, כדי לאפשר יותר זמן לנהל מניפולציות לפני הבשלת ביצית, הזריקות יכולות להתבצע גם במדיום -DHP, לפני ההבשלה, עבור h 2 לפחות. הם יועברו לאחר מכן עד בינוני + DHP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תעתיק באמצעות ערכת ביטוי סטנדרטית. להשאיר אותן -80 ° C כמו מניה 100-500 pg / μL להזרקה בריכוז סופי של 50-500 pg / μL (200 pg / μL מומלץ) במים רנ&quot;א-כיתה. כן MOS בריכוז של 4 ng / μL במים לפי הוראות היצרן. להזריק אותם בריכוזים סופיים של 2 ng / μL (או כפי שנקבע באופן אמפירי). הערה: זריקות בדרך כלל מבוצעים במדיום + DHP לפני defolliculation (ראה הערה בסעיף 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מזריקים mRNA, מיד לפני ההזרקה, לדלל את ה- mRNA באמצעות מים כיתה RNA אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת MOS, מיד לפני ההזרקה, לדלל את MOS לריכוז הרצוי באמצעות מים אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להחזיק ביציות עם מלקחיים בסדר להזריק כ 1 NL לתוך ביציות בשלב IV מסוג פרא באמצעות מחט עשתה עם טפטף נימי משך-זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המחטים זכוכית על ידי משיכת צינורות זכוכית נימי מחומם, טעינת הפתרון להיות מוזרק, וגם לשבור את קצה המחט עם מלקחיים, כפי שתואר לעיל פרוטוקולים עבור זריקה רגילה לעוברי מוקדם דג הזברה 15. הערה: זה מועיל אם המחט יש להתחדד הדרגתי ולא פתאומי אחד; זה מאפשר יותר גמישות מבחינת המיקום של הפסקה קצה מחט וגם עוזר למנוע נזק לעובר מוזרק. שימוש באותה המחט פתרון באשר הזריקות העוברות, להתאים את עוצמת הקול מוזרק על ידי מראש בקביעההגדרות לחץ microinjector המייצרים את העוצמה הרצויה. ניתן לקבוע הגדרות אלה על ידי מדומה-הזרקת טיפת שמן מינרלי בשקופית כיול הבמה מיקרוסקופ (0.01 מ&quot;מ) והתאמת הגדרות microinjector להשיג בקוטר הרצוי בולוס של פתרון מוזרק, כפי שתואר לעיל 15. </li></ol></li></ol> 5. הבשלת הביצית ו Defolliculation הערה: במהלך הבשלת ביצית, הביציות תהפוכנה שקופות בהדרגה, אשר מאפשרת ההערכה של תנאי תרבות מוצלחים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדוגרים בשלה (ובמידת צורך, מוזרקות) ביציות במדיום + DHP ב 26.5 מעלות צלזיוס, מעת לעת הבדיקה (כל 30 דקות) כדי להבטיח כי הביציות להישאר שלמות עוברות התבגרות נאותה על ידי הפיכתו שקופה בהדרגה (ראה איור 2 ג) . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביציות lysing עם פיפטה פסטר וזורקים אותםבכוס פסולת מעבדה כדי לשמור על האיכות של המדיום. חילופי בינוני התרבות עם כ-נפח מחצית בינונית טרי + DHP לשמור פתרון ברור, בהתאם לכמות לתמס ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר בשל במבחנה להמשיך עד ברוב של הביציות להיות שקופים ויש לי GV כי הוא כבר לא נראה לעין (כ 2 h בטיפול DHP, ראו האיור 2C לעומת D). הצג אותם תחת מיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה אור מועבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום הזקיקים החיצוני ביותר מכל ביצית התבגרה. שימוש במלקחיים חוץ-בסדר לעשות קרע בקרום הזקיקים באזור עם שטח מוגבר בין הביצית לבין הממברנה. לקלף חלק הממברנה לגלגל את הביצית מחוץ קרום תוך החזקת חלק מקולף. הערה: קרום כוריוני הבסיסי יהיה בדרך כלל להישאר בשיתוף הדוק עם הביצה במהלך תהליך זה; אחרי ביצת מעשהivation, היא מתרחבת כדי ליצור שכבת מגן על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות defolliculated בנפח מינימלי של המדיום (בדרך כלל, להעביר כ 5-10 ביציות בוגרות תוך פחות מ 20 μL) כדי בצלחת פטרי עם כמה טיפות של תרבות (+ DHP) בינוני ולהמשיך הפריה. </li></ol> 6. הפריה של ביציות בתרבית חוץ-גופית הערה: הפתרון הזרע על הקרח, הכין מתחת, תשמור העוצמה שלה במשך כ 2 h. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון זרע לקראת סוף שלב הבשלת ביצית ולפני defolliculation אשכים באמצעות מחמש זכרים ב 500 μL של הפתרון הנקס, כפי שתואר לעיל 16, 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10-50 μL של פתרון הזרע אל ביציות defolliculated במדיום תרבות + DHP. חכו 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להוסיף כמה טיפות של עובריים (E3) בינוני ביציות. חכו 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את plאכלו עם מדיום E3. הערה: הרכב בינוני E3 היא כדלקמן: 5 מ&quot;מ NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4, ו 1-5% מתילן בלו 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.3, 6.2, ו 6.3 להשיג מספר גדול יותר של עוברים מופרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים מופרית לפתח. שימוש במיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה האור המועבר לצפות להתקדמות בשלבים מחשוף כדי להבטיח הפריה מוצלחת, כפי שתואר לעיל עבור הפריה 17, וביום 18. </li></ol>

<ol><li>Lindeman, R., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+maternal-effect+genes%3A+insights+into+fertilization%2C+early+cleavage+divisions%2C+and+germ+cell+determinant+localization+from+studies+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Rep+Dev%22%5BJournal%5D)">Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish.</a> Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).</li>
<li>Abrams, E. W., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+development%3A+it%27s+in+the+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish development: it's in the maternal genes.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1402690607/abstract">Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).</li>
<li>Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/004484869390127K">Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement.</a> Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).</li>
<li>Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. <a target="_blank" href="https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00899767/document">Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho.</a> Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).</li>
<li>Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+external+pH+on+hormonally+regulated+ovarian+follicle+maturation+and+ovulation+in+Atlantic+croaker%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker.</a> Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).</li>
<li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1052180209/abstract">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine%2Fparacrine+control+of+zebrafish+ovarian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development.</a> Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).</li>
<li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+midblastula+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li>
<li>Kanagaraj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Souffle%2FSpastizin+controls+secretory+vesicle+maturation+during+zebrafish+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004449(2014).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Keeping+and+raising+zebrafish%2CZebrafish+-+A+Practical+Approach%22">Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+oocyte+growth+and+vitellogenin+gene+expression+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li>
<li>Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old%2C+in+with+the+new%3A+reassessing+morpholino+knockdowns+in+light+of+genome+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology.</a> Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).</li>
<li>Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).</li>
<li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank%27s+saline+containing+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Mar+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).</li>
<li>Pelegri, F., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 135, (2016).</li>
<li>Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+products+of+futile+cycle%2Flrmp+promote+centrosome-nucleus+attachment+in+the+zebrafish+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote.</a> Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).</li>
<li>Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosomal+passenger+protein+Birc5b+organizes+microfilaments+and+germ+plasm+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo.</a> PLoS Genetics. 9 (4), e1003448(2013).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול הנ&quot;ל הוא המניפולציה של מוצרי גן לפני ההפריה, ובכך מאפשר לחקר מוצרי גן אימהיים בעובר דג הזברה מוקדם. מחקרים קודמים הצליחו להבשיל ביציות במבחנה 4; פרוטוקול זה עבר שינוי כדי לאפשר ההפריה הבאה של במבחנה התבגרה 8 ביציות. זה בתורו מאפשר הזרקה של חומרים כימיים עבור מניפולציה פונקציונלי להדמיה של מוצרים בירושה אימהי בעובר המוקדם 3. עובר נובע שיטה זו יכולה להיות בת קיימא ויכול לשרוד להיות מבוגרים פוריים. בניסויים ראשוניים, כמחצית עוברי המופרות נגזרים בהליך זה הייתה קיימא ביום 5 של פיתוח, כפי שהוערך על ידי אינפלציה בשלפוחית ​​שחייה בשלב זה, כמחצית שהפך בריאות, מבוגרים פורים (תצפיות לא פורסמו). ישנם מספרשלבים קריטיים של לשקול בפרוטוקול. ביציות בשלב המתאים ליזום התבגרות (IV בשלב מוקדם) ניתן מועשרות אם הנקבה כבר הזדווגו לאחרונה, אך לא לפני 8 DPP. באמצעות דגים שלא הזדווגו לאחרונה עלול לגרום מתנוונת ביצים 14, אשר לא עוברים התבגרות. נקבות שהזדווגו בתוך פחות מ 8 ימים תהיינה רוב של ביצים בשלב III או פחות, ובכך, את הביצים לא תבשלנה כהלכה במבחנה. שחלות אצל נשים שהזדווגו לפני 8 ימים תהיינה חלק אופטימלי של ביציות ב IV בשלב מוקדם. אלה יכולים להיות מוכרים על ידי האטימות שלהם ואת הנוכחות של GV בעמדה אקסצנטרית (האיור 2B). נחישות ביצית בשלב יכולה להיות גם בעזרת מדידת גודל, עם הביציות להציב לשקופית מיקרומטר בוגר תחת מיקרוסקופ לעומת הנחיות היערכות סטנדרטיות (לוח 1). עם זאת, ביציות IV בשלב מוקדם יש גודל כמעט מקסימאלי לעומת להתבגרביציות (מוכרות על ידי שקיפות והחוסר היחסי של GV; איור 2C) ומוכרים בקלות, כפי שתוארו לעיל, אשר בדרך כלל אינו המצריך של מדידת גודל ביצית ישירה. בשינה הבשלה במבחנה חייב להתחיל בתוך מספר שעות של סוף מחזור האור שאליו תורם ביצית האישה הם יתרגלו. ביציות לא יבשילו כהלכה, משתקף בשיעורי הפריה עניים, אם תורבתו בתקופת הבוקר של מחזור אור. סיבת תלות היממה של שיטת הבשלת הביצית במבחנה אינה מובנת אך סביר משקפת הטיות יממה בסיסיות התבגרות ביצת in vivo מעורבת ביטוי גני אופניים במהלך oogenesis 21. סיבה נפוצה עבור ביציות שלא עוברים מוצלח הבשל במבחנה למרות היערכות ביצית הראויה היא כי DHP פג. הורמון DHP יפוג בדרך כלל אחרי שנה, וכדי להבטיח את האפקטהתבגרות אייב, האצווה העבודה צריכה להיות מוחלפת בתוך 9 חודשים של שימוש. ההזרקה של ביציות היא עוד צעד קריטי כאשר מטרת השיטה היא המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים. יש הליך זה דרישות שונות מאלה עבור זריקות רגילות הביצית המופרית ב 0-30 MPF. אחד ממרכיבי המפתח של הזרקת הביצית הוא הצורך לבצע את זריקות בתנאים שאינם להוביל הפעלת ביצה מוקדמת, כגון במדיום L-15 של ליבוביץ 22, 23. מכיוון שהם מוטמעים השחלות, ביציות התבגרות גם להוות אתגר מסוים כדי הזרקה. הפרוטוקול הנ&quot;ל מרמז מתנער ביציות ראשונות מן ההשחלות ואז אוחזים זה ניתק ביצית בנפרד עם מלקחיים בזמן ההזרקה. טכניקה זו עובדת היטב ומאפשרת ביציות טרום מיון בשלב המתאים עם טיפול מינימאלי. יכולות לשמש גם שיטות חלופיות, כגוןכמו: i) ביציות צבת לתוך זריקה רגילה שקתות agarose 15, שבו הקירות האנכיים של תמיכת שוקת הביצית במהלך ההזרקה (ב שיטה חלופית זו, הביציות צריכות להיות מועברות צלחות הזרקה תוך שמר במדיום בשל חוץ גופייה) ו- II יכול להיות מוחזקת) המאפשר הביציות להישאר למסת השחלות מצורפות, אשר עם מלקחיים במהלך ההזרקה כדי למנוע מגע עם הביצית המוזרקת (בגישה זו, הביציות צריכות להיות מנותקות לאחר הזרקה היא להקל חשיפת DHP ולאפשר defolliculation שלהם חיוני, כשלעצמו עבור IVF). למרות האתגר הספציפי הזה, ביציות בשלב IV ניתן חדרו בקלות עם מחט הזריקה, סביר כי קרום כוריוני בשלב זה אינו מפותח 9 במלואו. מגבלה אחת של פרוטוקול ההתבגרות הנוכחי היא כי בתנאים בשלים במבחנה מקדמת פיתוח ביצית נאהיכול לא ייווצר כאשר הביצית הבשלה הוא יזם בשלבים מוקדמים יותר בשלב IV. הביציות להיות מוכשרות כדי להגיב DHP ידי עובר התבגרות כאשר הם מגיעים בקוטר של 520 מיקרומטר, אשר מתרחש במהלך השלב III (vitellogenesis, מתאים למגוון 340-ל-690-מיקרומטר) 9. עם זאת, בתרבות תוצאות ביציות בשלב III ביציות שאינן מוסמכים להפריה 3. רק ביציות אשר במבחנה תרבות היא יזמה ב IV הבמה (איור 2B) יכול להתפתח ביציות בוגרות, שלב V (איור 2C ו- D). זה עשוי להיות קשור לעובדה שלב III הוא חיוני לצמיחה vitellogenesis ואת הביצית 9. לפיכך, ההליך הבשלת הביצית במבחנה המוצגת במאמר זה אמור לשמש רק עם אוכלוסייה החל שלב IV ביציות (B), ולא עם ביציות בשלבים מוקדמים (שלבים I - III; e Figur <strאונג&gt; 2A). מאותה הסיבה, הליך זה מוגבל גנים באים לידי ביטוי בשלב IV או במאוחר. המניפולציה התפקודית של גנים שמוצריה הביעו מוקדם יותר עשויה במקום יש להסתמך על שיטות גנטיות (ראה להלן). שיפורים שיטות ההתבגרות תרבות במבחנה עשוי בעתיד לאפשר התחלת culturing הביצית בשלבים מוקדמים יותר, ובכך להרחיב את הכוח של הגישה הבשלה חוץ גופית. מגבלה נוספת של השיטה המוצגת היא defolliculation, אשר חיונית בשלבים הבאים המעורבים הפריה, וכיום היא צעד שער הגבלה בהליך. קרום פוליקולרית הוא שכבה שקופה סביב הביצית מתפתחת, וההסרה יכולה להיות מייגעת. אם הקרום הזה לא יוסר לחלוטין, הביצה לא תהפוך תופעל באופן מלא מופרה. זה שהובהר ע&quot;י הכישלון הסיסי להרחיב את הפיתוח של להציב סדיר, תלם דמוי structures (pseudocleavages), מאפיין של עוברים מופרים 11. שיטות defolliculation אנזימתי כגון collagenase, כפי שמוצג ב Xenopus, נוסו. עם זאת, בידיים שלנו, הטכניקה הזו לא הצליחה, ולכן אנו מסתמכים על defolliculation ידנית. מכיוון defolliculation הידנית היא עתיר עבודה זמן רב, קשה לקבל קבוצות גדולות של ביצים מופרות לאחר הבשלת ביצית חוץ גופייה. בשל ההגבלה הזמנית שהוטלה על ידי defolliculation הידנית, אנחנו כרגע לדשן כמה ביצי defolliculated, בוגרת בכל פעם, בקבוצות קטנות של 5-10 ביצים. השילוב של defolliculation אנזימטי עם הליך זה היה משמעותי צפוי להגדיל את התשואה שלה וקלות הכוללת שימוש. למרות העוברים הנוצרים לאחר הפריית מבחנה ביציות -matured יכול להיות מבוגרים קיימא, נציין כי לאחר הפריה חוץ גופית, לחלק מעוברי לעשות<html> לא מחלקים בדרך כלל או מבעוד מועד. בימים אלו אנו בחירה לקווים אשר ההתפשטות כולל סיבובים של הבשלת ביצית חוץ גופייה, אשר עלול לגרום דפוסים חזקים יותר של התפתחות עוברית נגזר באמצעות שיטה זו. ההליך אפשר עבור ההצלה הברורה או להדמיה של לוקליזציה חלבון במשך מספר המוטציות 24, 25. עם זאת, עבור גנים מסוימים, הרגולציה של ביטוי המוצר עשויה להיות מכרעת, כך המוצרים הביעו ידי מוזרק mRNA עשויים להוביל לתוצאות משתנות 26. כמו כן, חשוב להיות מודעים כל הפקדים (למשל, עוברים מוזרק עם ריאגנטים בעלי תכונות דומות לאלו ששימשו בניסוי עדיין הם חזו לא לייצר השפעה, כגון MOS שליטה או RNAs קידוד עבור חלבונים אינרטי בלבד, כגון כמו GFP), כפי השתנות בסיסית עשויה להוביל למסקנות לא תקינות. NT &quot;&gt; גישה המעורבת מניפולציה במבחנה ואחריו הפריה שימושי במיוחד במקרה של מוצרים שהופקדו אימהי, שבו הגישה הסטנדרטית של הזרקת RNA, MOS, או חלבון לתוך הביצית המופרית לא יכול להפחית מוצרים ביעילות שנצברה כבר בתוך הביצה. שיטות אחרות שפותחו לאחרונה, כגון דור קריספר-מוטציה, הם גם יעילות ביצירת תנאי מוטציה בגנים הביעו אימהי 26. עם זאת, שיטה זו דורשת את הצמיחה של כמה דורות של דגים. טכניקת הבשלת ביצית במבחנה מאפשרת מניפולציה תפקודית מהירה ללמוד את הפונקציה של גנים הביעו אימהי, כולל ההצלה phenocopy של מוטציות אימהית-השפעה, כמו גם הביטוי של רנ&quot;א וחלבונים בעובר המוקדם.

במהלך הפיתוח של בעלי חיים, מוצרי גן פיקדונות אמא (למשל, RNAs, חלבונים, ביומולקולות אחרות) לתוך הביצה; מוצרים אלה הם חשובים עבור תהליכים תאיים מוקדם מיד לאחר הפריה 1, 2. המניפולציה של הביטוי והתפקוד של מוצרים אימהיים היא בדרך כלל לא יעילה כשמשתמש בגישה סטנדרטית ההזרקה של חומרים כימיים לביצים מופרות 3. זאת משום שרוב RNAs וחלבונים מיוצרים על ידי הביצית במהלך oogenesis, כך שמוצרים אימהיים טעון מראש כבר נמצאים בתוך הביצית בשלה. מוצרים קודמים כאלה הם אטומים מציאה פונקציונלית עם סוכני מיקוד גן, כגון oligos antisense Morpholino (MOS), כי MOS למקד את ה- mRNA, לא החלבון הקודם שכבר קיים הביצה על הפריה. בנוסף, תהליכים עובריים מוקדמים רבים קורים מהר מדי לאחר ההפריה להיות influenCED ידי מוצרי חלבון נגזרים RNA מוזרק לתוך הביצית המופרית, כמו רנ&quot;א לא יכול להיות מיוצר מהר מספיק כדי להשפיע על האירועים הראשונים של עובר. מאותה הסיבה, מתויג תערובות חלבון הביעו באמצעות הזרקת mRNA לתוך הביצית המופרית לא יכול להיות מיוצר בזמן להדמיה במהלך התפקיד הפעיל שלהם בעובר המוקדם. ההזרקה לתוך ביציות בוגרות נמתחות לפני הפעלת ביצה אפשרית אך קשורה בנושאים טכניים דומים: ביציות בשלות כזו כבר טעונות מראש עם חלבון אימהי, והם לא יהיו פעילים translationally (כלומר, לייצר חלבון מן התמלילים אקסוגניים) עד אחרי הביצה הַפעָלָה. מסיבות אלה, המניפולציה של מוצרי גן אימהיים הפועל העובר מוקדם בדרך כלל צריכה להתבצע במהלך oogenesis ב הביצית הבשלה. כפי גישה אחת התגברות על קשיים אלה, בשיטות הבשלה חוץ גופית, המאפשרות להבשלה של OOCytes מ IV הבמה כדי היווצרות הביצה, הוקמו דג הזברה. שיטות מוקדם מותרות הבשלה במבחנה, אך הביצים בוגרות וכתוצאה היו לא מוכשרות להפריה 4. לאחר מכן, המניפולציה של תנאי התרבות מן ניטראלי 9.0 pH, מחקה את pH הבסיסי של נוזל ההשחלות נמצא מיני דגים 5, 6, מותר להפריה אמינה במבחנה (IVF) לאחר במבחנת התבגרות 7, 8. ואכן, במבחנה ביציות -matured יכול להניב עוברים קיימא כי לבגרות וכי הם פוריים 3, 8. שיטה משופרת הותאמה נוספת לכלול המניפולציה התפקודית של גנים של האם, את הביטוי של חלבונים מתויגים במהלך oogenesis דג הזברה באמצעות ביטוי חיצוני, בתיווך MO פונקציונלי להפיל ב מחצלתuring שלב IV ביציות 3 (איור 1). Oogenesis הזברה מציג מספר שלבים אופייניים המובילים להיווצרות של ביציות בוגרות 9 (ראה טבלה 1 עבור מדריך מהיר בשלבים השונים oogenesis). בקצרה, פיתוח הביצית היא ביוזמת הבמה ואני ביציות והיא נעצרה בשלב diplotene של לי prophase של המיוזה. ביציות אלו עוברים צמיחה באמצעות שעתוק פעיל (יזם בשלבים IA ו- IB), היווצרות של alveoli קליפת המוח (הידוע גם בשם גרגרי קליפת המוח, יזם בשלב II), ו vitellogenesis (יזם בשלב III). צמיחת ביצית תושלם במהלך השלב הרביעי, כאשר המיוזה לי קורות חיים, וכתוצאה מכך את פירוק גרעין הביצית, המכונה השלפוחית ​​הנבטיה (GV). לאחר מכן, המיוזה הוא נעצר שוב metaphase השנייה. השלמת צמיחה הביצית ומעצר meiotic בשלב IV מוביל למשל V לשלב בוגרז 9. הסרת קרום הזקיקים מתרחשת במהלך שחרור הביצית לתוך לומן של השחלה 10 והוא חיוני הפריה והפעלה ביצה ראויה. לאחר הביצים נמתחות מאמם במהלך הזדווגות טבעית, הם הופכים הופעלו. דג הזברה, חשיפה למים מספיקה להפעלת ביצה מלאה, ללא קשר לנוכחות של זרע 11. בתנאים במבחנה מאפשר כרגע להבשלה של ביציות משלב מוקדם IV-אשר ניתן לזהות לפי הגודל (690-730 מיקרומטר), בנוכחות GV גדול בעמדה האסימטרית, ואת מראה אטום לחלוטין עקב הצטברות של חלבוני חלמון (איור 2B) A הביצה הבמה V הבוגרת, מאופיינת GV מפורק לחלוטין וחדר מראה שקוף בשל חלמון עיבוד חלבון 12 (איור 2 ג). בגישה זו, כולה שחלות המשךביציות aining בשלבים שונים של פיתוח יוסרו נקבות. ביציות רשאים לפתח 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), א-גרימת ההתבגרות יעיל הורמון 8. במהלך תקופה זו, ביציות התבגרות ניתן להשפיע באמצעות הזרקה של ביטוי (למשל, הכתיר, במבחנה -transcribed תעתיקי) או לעשות פעולות של גנטיקה סוכנים (למשל, MOS). שכבת הזקיקים לא לשפוך ספונטנית לקראת סוף תקופת ההתבגרות, אז זה חייב להיות מוסר באופן ידני. לאחר defolliculation, הפריה חוץ גופיית מושגת על ידי מפעילת הפעלת ביצה באמצעות חשיפת הביצים למים (נוכח עוברי (E3 בינוני)) 13 ו פתרון זרע. Zygotes וכתוצאה לעבור התפתחות עוברית ולאפשר בהערכת היכולת של טיפולים כדי לתפעל תפקוד גן אימהי והן עבור להדמיה והניתוח של מוצרים אימהיים מתויגים ( <strong&gt; איור 3).

<table><tbody><tr><td>קופסאות הזדווגות דג זברה</td><td>Aqua</td><td>Schwarz SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO2</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>מאושר על ידי ה-FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>להכנת 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>להכנת 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>רשת דגים (רשת עדינה) (4 - 5 אינץ')</td> <td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td> <td>זמין ב- ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>כף</td><td></td><td></td> פלסטיק <td>זמינה ברוב החנויות הסטנדרטיות</td></tr><tr><td>ניתוחי מספריים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>זמין מ- Fine Science Tools</td></tr><tr><td>ניתוח סטריאוסקופ (עם מקור אור משודר)</td> <td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מקור אור רפלקטיבי (זרועות LED)</td> <td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>לוחות פטרי קוטר</td><td></td><td></td> 10 ס"מ <td>כל יצרן</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>דלי</td><td></td><td></td> <td>קרחכל יצרן</td></tr><tr><td>מרית צרה</td><td>פישר</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>צלחת זכוכית דיכאון</td><td>קורנינג בע"מ</td><td>722085 (חתול פישר. לא 13-748B)</td> <td>זמין אצל מגבות</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> נייר של פישר סיינטיפיק <td>כל יצרן</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>זמין אצל Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer Stop Watch</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>בקבוק כביסה</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>זמין מכוסות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>, 250 מ"ל (2)</td> <td>Corning Inc. </td><td>1000250</td><td>להשיג אצל Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Leibovitz'z L-15 medium</td><td>Thermofisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>221465 סיגמא</td><td></td><td>ל-pH'ing</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td> <td>Sigma</td><td>P6285</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר הזרקה</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>צינורות נימיים למחטי הזרקה</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>או שווה ערך, Borosil 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ קוטר פנימי עם סיבים, 100 מ"מ</td></tr><tr><td>חולץ מחט</td><td>Sutter Instruments</td><td>דגם P-87</td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>Micropipetor (1 - 20 & micro; טווח L) עם טיפים</td><td></td><td></td><td>לכל יצרן</td></tr><tr><td>Micropipetor (20 - 200 ומיקרו; טווח L) עם טיפים</td><td></td><td></td><td>לכל יצרן</td></tr><tr><td>Micropipetor (100 - 1000 ומיקרו; טווח L) עם טיפים</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>פיפטה פלסטיק 10 מ"ל עם נורה</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>פיפטה פלסטיק 20 מ"ל עם נורה</td><td></td><td></td><td>כל יצרן</td></tr><tr><td>שלב מיקרוסקופ כיול שקופית 0.01 מ"מ</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td>או </td></tr><tr><td>ריאגנטים שווי ערך למי דגים:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מלח אוקיינוס מיידי</td><td>ד"ר פוסטר & סמית</td><td>&nbsp; CD-116528</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (נבדק בתרבית תאים)</td> <td>סיגמא</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים למדיום E3:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4, heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>מזון דגים:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שרימפס מלח קפוא</td><td>שרימפס מלח ישיר</td><td>FBSFKG50</td><td></td></tr><tr><td>פתיתי טטרמין</td><td>ד"ר פוסטר & סמית</td>' <td>16623</td><td></td></tr></tbody></table>

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

אירועים הסלולר המתרחשים בשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית חיה מונעים על ידי מוצרי גן נגזר אימהי שהופקדו לתוך הביצית מתפתחת. בגלל האירועים הללו מסתמכים על מוצרים אימהיים אשר בדרך כלל לפעול בקרוב מאוד לאחר ההפריה-כי preexist בתוך הביצה, הגישות סטנדרטיות ביטוי וצמצום פונקציונלי מעורבות ההזרקה של חומרים כימיים לתוך הביצית המופרית הן בדרך כלל לא יעילות. במקום זאת, מניפולציות כאלה חייבות להתבצע במהלך oogenesis, לפני או במהלך ההצטברות של מוצרים אימהיים. מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול להבשלה במבחנה של ביציות דג הזברה בשלה הפריה חוץ גופית הבאים שלהם, מניב עוברים קיימא כי לבגרות. שיטה זו מאפשרת המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים במהלך oogenesis, כגון הביטוי של מוצרים עבור הצלת פנוטיפי ו להדמית מבנה מתויג, כמו גםזה הפחתה של תפקוד הגן באמצעות סוכנים-גנטיקה הפוכה.

כדי לקבוע אם ההליך המתואר לעיל מצליח, העוברים ניתן להבחין בשלבים המחשופים כדי לאשר את המראה של דפוס המחשוף הסטריאוטיפי מוקדם העוברי 18, כמו גם 24 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי לאשר את ההתפתחות התקינה תכנית הגוף הבסיסית. הליך זה מאפשר המניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים באמצעות ההזרקה של חומרים כימיים, כגון תעתיק ו MOS, במהלך פיתוח ביצית. מניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים: קידוד mRNA עבור wild-type ומוצרים מוטציה ניתן להזריק לתוך מבחנה ביציות התבגרות כדי לבדוק את ההשפעה של המניפולציה של תפקוד הגן האימהי במהלך המיוזה ואת בשלבים עובריים מוקדמים. לדוגמא, עובר wild-type ניתן להזריק עם אינטרנטmRNA LD-הסוג כדי לבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר של מוצר, או עם RNA המוטציה לבדוק דומיננטיות פוטנציאל (למשל, לזכות של פונקציה ו antimorphic) תופעות בתהליכים אלה. ביציות בתרבות במבחנה מסוגלות לייצר חלבון מ- mRNA אקסוגניים ברחבי פיתוח ביצית, כפי שמוצג על ידי הביטוי של GFP מ- mRNA המוזרק, אם כי רק ביציות כי ליזום תנאי תרבות בשלב IV של oogenesis יכולה להתפתח ביציות V לשלב בוגר (איור 2B -2D, ראה גם יאיר ואח. 3). הביטוי של מוצר מסוג פרא דרך mRNA מוזרק גם אינסטרומנטלי למען הצלתה של מוטציות אימהי-אפקט לאשר זהות הגן במהלך שיבוט מיקומית 3, 24. במקרה זה, ה- mRNA מסוג פרא מוזרק לתוך ביציות מנשים מוטציה הומוזיגוטים לבדוק אם מוצרים מסוג פרא יכול להציל את פנוטיפ מוטנטי. זו הצלה גנטית מתוארת &lt;strong&gt; איור 3A-3C, שבו מוזרק mRNA AurB מוצג להציל את ההשפעות פנוטיפי של מוטציה בגן המקביל שלה, האי הסלולר (CEI) (איור 3A-3C). העוברים מקבוצה מלאה מותר גם לפתח להראות את פנוטיפ מוטנטי המקביל 3. RNA Mutant ניתן להזריק גם לתוך ביציות מוטציה כדי לבדוק אם המוצר מוטציה שומרת פונקציה חלקית על ידי השוואת מידת הצלה לנזקים שנגרמו עקב המוצר wild-type. ביטוי חלבון מן mRNA מוזרק לתוך ביציות מתפתחות נראה להתרחש עם עיכוב מעט או ללא. ביטוי GFP החזק הוא ציין בתוך 2 h של ההזרקה של ה- mRNA המתאים, ללא קשר לשלב ההתפתחותי של ביצית 3 (איור 2B-2D; ראה גם תאיר ואח 3.). מוצרים כגון mCherry:Sas6 ו Birc5b (Motley): GFP ניתן להבחין מיד לאחר ההפריה ובמהלך מחזור התא העוברי הראשון 3, 25. ההזרקה של ה- mRNA במהלך oogenesis גם מובילה את הייצור של חלבון זה, ללא קשר המחצית המתויגת התמזגה, הוא פונקציונלי מייד לאחר הפריה, כפי שמוצגים במקרה של מוצרים אימהיים עבור אי הסלולר / 3 aurB, מחזור עקר / lrmp 24, ו מוטלים / bir5b 25. תרגום-חסימת גם MOS השפעה מיד לאחר ההפריה, כפי שמוצג על מחזור עקר / Lrmp 3 ו בשלבים מאוחרים יותר של העובר, כמו במקרה של משימה בלתי אפשרית / dhx16 3. אחוי-חסימת MOS, כאשר מוזרקים ביציות התבגרות, אולי לא יהיה השפעה על תפקוד אימהי, ככל הנראה עקב שכבר כיום תעתיק אימהי בוגר ביציות בשלב IV &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 3. דור של morphants: בעת שימוש MO המתאים גן עם מוטציה כבר-מזוהה, פנוטיפ morphant צפוי לחקות את פנוטיפ מוטנטי. Morphants מושווה עובר uninjected ולאלה מוזרקים עם סטנדרט, לשלוט MO. הזרקה של morpholino חסימת התרגום מצליח phenocopy את פנוטיפ מוטנטי ידוע 3, כפי שמוצג על ידי הזרקה של Lrmp MO לתוך ביציות, אשר מחקה את פנוטיפ מוטנטי של המוטציה המקביל, מחזור סרק (איור 3D-F). הספציפי של MOS ניתן לקבוע באמצעות אותו הגישות בשימוש בעת הזרקת MOS לעוברים (שנבחן בעבר) 19, 20. ביטוי של חלבוני היתוך שכותרתו fluorescently: mRNA קידוד למוצרי הגן של עניין התמזגו חלבוני ניאון (למשל, ה- GFP ו mCherry) יכול גם להיות מוזרק לתוך או wild-type או ביציות מוטציה לדמיין את המוצרים המתאימים בתוך העובר מוקדם (כלומר, המשקף דפוס לוקליזציה subcellular; איור 3G ו 3H). תעתיקי קידוד עבור תערובות דומות אך מעורבי האלל המוטנטי יכולים לבוא לידי ביטוי באופן דומה כדי לבדוק אם המוטציה משפיעה בשום localizations התת-תאי פוטנציאל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> איור 1: In Vitro הביצית הבשלה. תרשים סכמטי המציג את השלבים השונים הכרוכים הבשלת הביצית במבחנה. נקבות בוגרות הם שנבחרו מראש על-נחת ביצה 8 ימים לפני ההליך, כדי לטהר אותם ביצים שכבר התבגרו וכדי פרוMote פיתוח ביצית חדש. השחלות, המכילה ביציות מתפתחות, יוסרו נקבות והועברו מדיום המכיל את DHP ההורמון לגרום הבשלת ביצית במבחנה. לאחר ההסרה מן הנקבות ומייד לפני או במהלך הבשלת ביצית, ביציות ניתן להזריק עם מוצרי RNA ריאגנטים אחרים עבור המניפולציה התפקודית של גורמים אימהיים. ביציות בוגרות הם defolliculated ידני מופרים במבחנה עם פתרון זרע להניב עוברים מופרים, קיימא. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> איור 2: In Vitro ביצית בשל ביטוי של מוצרי מ- mRNA המוזרק. (א) ביציות בשלבי I-III, שנצפו שחלותנקבות 4 ימים שלאחר טיהור (DPP). (ב) ביציות בשלב IV, שנצפו שחלות מהנקבות.&quot; 8 DPP. השלפוחית ​​הנבטיה (GV, ראש החץ) נראית בבירור ואת תופסת תפקיד אקסצנטרי. השלב השלישי ביציות ב (א) גם להפגין GV ברורה ממבט ראשון, אבל הוא נמצא מרוכז בתוך הביצית. ביציות שלב IV ב (ב) יש גודל כי הוא קרוב מירבית בהשוואה לזו של ביציות בוגרות ב (ג). (C ו- D) ביציות בשלב V (להבשיל ביציות) לאחר 2 h בתנאים הבשלה במבחנה יזם בשלב IV, כמו (B), והזריקו במהלך ההתבגרות עם קידוד GFP, במבחנה עיבד ה- mRNA (C, האור הנראה רק; D, כיסוי של האור הנראה הקרינה GFP). GV היא כבר לא נראית לעין ביציות בשלב V, אשר גם פחות אטום מאשר ביציות בשלב IV. ביציות מוזרקות לבטא חלבון ה- GFP (D). Defolliculation של ביציות בשלב IV בוגרות היא described בסעיף בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> איור 3: שיבושים ו ויזואליזציה של מוצרים אימהיים דרך במבחנת ביצית בשלה. (A - C) החילוץ של פנוטיפ אימהי-השפעה הנגרמת על ידי מוטציה B סלולר האי / אורורה באמצעות הזרקה של mRNA מסוג פרא aurB לתוך ביציות בשלב IV CEI / aurB. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 65 blastodiscs MPF הקבוע, דמיין עם נוגדנים אנטי-האס-קטנין להדגיש ממברנות (ירוק), נוגדנים אנטי-α-טובולין כדי לציין מיקרוטובולים (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (א) הצטברות β-קטנין בעוברים מהסוג פרא, מעידה על התבגרות תלם נורמלית. (ב) העובר CEI / aurB מן הביצית בשלב IV uninjected CEI / aurB מציגה התלמים חלקית, בסיסי אשר אינם צוברים β-קטנין. (ג) הצילה CEI / עובר aurB מן ביצית CEI / aurB הוזרקה mRNA מהסוג פרא aurB מראה הצטברות β-קטנין חזקה בבית התלמים. (D - F) Phenocopy של אפקט אימהי הנגרמת על ידי מוטציה מחזור עקר / lrmp מן הזרקה של Lrmp morpholino לתוך הבמה IV ביציות. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 70 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין כדי לציין centrosomes (אדום) ו DAPI לייעד DNA (כחול). (ד) עובר מסוג פרא, כל מקורביו גרעין עם טובולין γ, סמן חומר centrosomal. (E) ב מוטנטים FUE אימהי-השפעה, פיוז&#39;ן pronuclear נכשל, וכתוצאה מכך בשתיים עד שלוש מדבקות תוויות DNA התואמות-גרעינים פרו הורית unfused וגוף הקוטב עבור המיוזה השנייה. (ו) morphants Lrmp, שבו הפונקציה Lrmp אימהי מעוכבת, גרעינים להיכשל באופן דומה לחלק ובנוסף, אינם מקשרים עם טובולין γ. (G ו- H) ויזואליזציה של המוצר אימהי המיוצר בעובר המוקדם. Sass6-mCherry חלבון מ- mRNA אקסוגניים מוזרק לתוך הבמה IV ביציות מבצע לוקליזציה של צנטריול. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 40 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין להדגיש centrosomes (ירוק), קרינת mCherry כדי לציין Sass6 (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (G) הביע Sass6-mCherry חלבון מבצע לוקליזציה של מוקדים שכותרתו ידי הסמן centrosome γ טובולין באתרי איגוף הגרעין (חיצים). (H </stתמונה זהה רונג&gt;), מראה רק Sass6-mCherry ו DAPI לבהירות. את העוברים (G ו- H) הם קבועים, אבל הקרינה של מוצרים הביעו, כגון תערובות mCherry, יכולה להיות גם ציינה עובר לחיות (לא מוצג). בר סולם = 100 מיקרומטר AF ו 10 מיקרומטר G ו- H. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלבי oogenesis </td><td> ביצית קוטר (מיקרומטר) </td><td> ציון דרך מפתח (ים) </td></tr><tr><td> 1A - Prefollicle </td><td> 7 עד 20 </td><td> ייזום של שעתוק פעיל, הצטברות של nucleoli </td></tr><tr><td> 1B - זקיק </strong&gt; </td><td> 20 כדי 140 </td><td> Decondensation של הכרומוזומים </td></tr><tr><td> שני - נֹאדִית קורטיקלי </td><td> 140 כדי 340 </td><td> ייצור alveoli קורטיקלי </td></tr><tr><td> III - Vitellogenesis </td><td> 340 כדי 690 </td><td> החשכת ooplasm ידי הצטברות של חלבון ושומנים חלמון מבשר </td></tr><tr><td> IV מוקדם - הבשלת הביצית </td><td> 690 כדי 730 (טווח תחתון) </td><td> לוקליזציה אסימטרית של שלפוחית ​​נבטיה </td></tr><tr><td> IV מוקדם - הבשלת הביצית </td><td> 690 כדי 730 (טווח עליון) </td><td> שלפוחית ​​רמינל נעלמת, מעצר בבית metaphase II </td></tr><tr><td> V - ביצית למבוגרת </td><td> ~ 750 </td><td> Ooplasm / חלמון הופך שקוף </td></tr></tbody></table> טבלה 1: ציוני דרך של התפתחות הביצית זברהדג.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבצע הבשלה in vitro של ציטות של דגי זברה, ובמידת הצורך, לבצע מניפולציה פונקציונלית של תוצרי גנים אימהיים לפני ההפריה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, הנוגעות לחשיבות התרומה האימהית לעובר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא גידול ציטות in-vitro, ולאחריו הפריה והפקת עוברים חיוניים.ובמידה ורצויה, מאפשרת מניפולציה תפקודית של תוצרי גנים אימהיים הפועלים בעובר המוקדם מיד לאחר ההפריה. כדי להתחיל, שמונה עד 10 ימים לפני המניפולציה בתרבית חוץ גוף (in vitro), השתמשו ברשת דגים כדי להעביר מספר זוגות של זכר אחד ונקבה אחת מדג של הזן הרצוי למכלון הרבעה. השאירו אותם במכלון ההרבעה למשך הלילה.לאחר שמאפשרים לדגים להתרבית עד למחרת אחר הצהריים, השתמשו ברשת לדגים כדי להפריד את הנקבות שהטילו ביצים במהלך ההתרבית והעבירו אותן למכל נפרד. האכילו נקבות אלו פעמיים ביום בתערובת מזון המכילה כמות שווה בקירוב של ארטמיה (brine shrimp) ופתיתי מזון לדגים. תחת תנאים סטריליים, הוסיפו 20 milliliters של Leibovitz's L-15 Medium עם l-glutamine, PH 7.0, לשפופרת קונית של 50 milliliter.לאחר מכן, השתמש בנתרן הידרוקסיד 10 Normal כדי להביא את ה-PH ל-9.0. הוסף 9 milliliters של L-15 Medium לשני מבחנות קוניות נפרדות של 50 milliliter. לאחר מכן, סמן מבחנה אחת כ-DHP והשנייה כ-DHP.למבחנה ה-DHP, הוסיפו 10 µL של DHP, 490 µL של DH2O ו-500 µL של 10%BSA. למבחנה ה-DHP, הוסיפו 100 µL של gentamicin בריכוז 10 mg/mL, 400 µL של DH2O ו-500 µL של 10%BSA. לצורך ביצוע דיסקציה של תאי ביצה (oocytes), התחילו בהכנת תמיסת סטוק של 0.2%tricaine ב-DH2O, עם באפר ל-pH 7.0 באמצעות tris 1 M ב-pH 9.0.שמרו תמיסה זו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בין ארבע שעות לאפס שעות לפני סיום מחזור התאורה היומי במתקן, הוסיפו לכלי ביקר בנפח 250 מיליליטר 20 מיליליטר של תמיסת מלאי 0.2% tricaine, pH 7.0, ל-80 מיליליטר של מי דגים וערבבו. קריטי להתחיל את הפרוצדורה תוך ארבע שעות מסיום מחזור התאורה היומי אליו רגילים הדגים.אחרת, האוציטים לא יבשילו כראוי. בעזרת כף, אסוף את הדגים שהורגו מהתמיסה של tricaine, ושטוף אותם קצרות במי דגים. לאחר מכן, הנח את הדגים על נייר סופג כדי לספוג עודפי מים.השתמשו בלהב תער נקי כדי לערוף את ראשו של הדג שהורדם ברמת סנפיר החזה. לאחר מכן, בעזרת מספרי ניתוח, בצעו חתך לאורכי בצדו הגבתי (ventral) של הדג, מהקצה הקדמי ועד לאזור פיגוס (anal area). הניחו את הדג בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח עם תאורה עליונה.לאחר מכן, באמצעות זוג פינצטות לדיסקציה, בודדים חלקים מהשחלה ומעבירים את הרקמה לצלוחית תרבית של 35 על 10 מילימטר, המכילה ארבעה מיליליטר של Leibovitz's L-15 Meidum, DHP. כעת, בעזרת פינצטות לדיסקציה, מפרידים בעדינות את התאי ביצית (oocytes) ממסת הזקיקים. ממינים ארבעה תאי ביצית בשלב מוקדם, הנמצאים בגודל כמעט מקסימלי, ומאופיינים בציטופלזמה כהה ואטומה, ובשלפוחית גרמינלית (germinal vesicle), או GV, הנראית בבירור וממוקמת באופן אסימטרי בתוך התא ביצית.השליכו ציטות (oocytes) בשלבים מוקדמים יותר, וביצים בשלות ושקופות בשלב 5. השתמשו בפיפטת פסטור מזכוכית כדי להעביר את ארבע הציטות בשלב מוקדם לצלוחית תרבית פלסטיק שנייה בגודל 35 על 10 מילימטר, המכילה 4 ml של מצע Leibovitz's L-15, בתוספת DHP. העבירו כמויות מינימליות של מצע ללא DHP אל הצלוחית המכילה את התמיסה עם DHP.במקרה של הזרקת mRNA, מיד לפני ההזרקה, השתמשו במים שעברו אוסמוזה הפוכה בדרגת RNA ובקלייד פוטשיום 0.2 מולרי כדי לדלל את ה-MRNA לתמיסה סופית של KCl 0.1 מולרי. במידה ומזריקים מורפולינוס (Morpholinos), או MOs, מיד לפני ההזרקה, דללו את ה-MOs לריכוז הרצוי באמצעות מים שעברו אוסמוזה הפוכה בדרגת RNA וקלייד פוטשיום 0.2 מולרי, כדי להגיע לריכוז סופי של KCl 0.1 מולרי. לאחר מכן, לביצוע ההזרקה, החזיקו ידנית את התאים הביציתיים (oocytes) באמצעות פינצטה עדינה, והזריקו כ-1 ננוליטר לתוך תאים ביציתיים של זן הפרא בשלב 4, באמצעות מחט העשויה מפיפטת קפילרית של זכוכית שנמשכה.המשיכו לדגור את הביציות הבלתי בשלות והמוזרקות במצע DHP בטמפרטורה של 26.5 degrees Celsius. בדקו בערך כל 30 דקות כדי לוודא שהביציות נשארות שלמות ועוברות הבשלה תקינה, כשהן הופכות לשקופות יותר ויותר. השתמשו בפיפט פסטור כדי להסיר ביציות שעוברות ליזיס.והשליכו אותם לכלי פסולת מעבדתי, כדי לשמור על איכות המצע. החליפו את מצע התרבית בכמות של כחצי מהנפח של מצע DHP טרי כדי לשמור על תמיסה צלולה, בהתאם לכמות הליזיס של התאי ביצית. כאשר רוב התאי ביצית הופכים לשקופים, וה-GV אינו ניכר יותר, השתמשו בפינצטה עדינה במיוחד כדי ליצור קרע בממברנה הפולקולרית, באזור שבו המרווח בין התא ביצית לממברנה מוגדל.קלפו חלק מהממברנה, ובזמן שאתם מחזיקים את החלק שקולף, גלגלו את התבצית (oocyte) החוצה מהממברנה. שלב קריטי נוסף הוא הסרת הממברנה הפוליקולרית. אם שכבה זו לא תוסר במלואה, ההפריה והתרחבות הכוריון יעוכבו.העבירו את התאים הביציתים שעברו דה-פוליקולציה בנפח מינימלי של מדיום, לצלחת פטרי עם מספר טיפות של מדיום תרבית DHP, והמשיכו להפריה. לקראת סוף שלב הבשלת התאים הביציתיים, ולפני הדה-פוליקולציה, הכינו תמיסת זרע באמצעות אשכים מחמישה זכרים ב-500 µL של Hank's Solution. הוסיפו 10 עד 50 µL של תמיסת זרע לתאים הביציתיים שעברו דה-פוליקולציה במדיום תרבית DHP.לאחר מכן, המתן 10 שניות. באמצעות פיפטה, הוסף מספר טיפות של מצע E3 אל האוציטים. המתן דקה אחת, ולאחר מכן השתמש במצע E3 כדי להמלא את הצלחת.לאחר מתן זמן להתפתחות העוברים המופרות, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה עם אופטיקה של אור תומר כדי לעקוב אחר ההתקדמות דרך שלבי הפילול (cleavage), כדי לוודא הפרייה מוצלחת, כפי שתואר בעבר עבור ההפרייה וקביעת השלב ההתפתחותי. כפי שנראה מהבעת GFP, אוקיציטים מתרביות במעבדה (in vitro) מסוגלים לייצר חלבון מ-mRNA אקסוגני לאורך התפתחות האוקיציט בתוך פרק זמן קצר של שעתיים. עם זאת, רק אוקיציטים אשר התחילו את תנאי התרבית בשלב ארבע של האוקיגנזה יכולים להתפתח לאוקיציטים בשלים בשלב חמישה.בניסוי זה, הזרקת mRNA של aurora B מסוג פרא (wild-type) מצילה את ההשפעות הפנוטיפיות של מוטציה בגן המקביל לו, cellular island. עוברי קבוצת ביקורת מורשים להתפתח כדי להראות את הפנוטיפ המוטנטי המקביל. הזרקת Morpholino חוסם תרגום יכולה להוות פנוקופי (phenocopy) מוצלח של הפנוטיפ המוטנטי המוכר, כפי שמוצג על ידי הזרקת lrmp-MO לתבويضות, המדמה את הפנוטיפ המוטנטי של המוטציה המקבילה futile cycle.ניתן להזריק קידוד mRNA למבצעות (oocytes) מסוג בר (wild-type) או מוטנטיות כדי להמחיש את המוצרים התואמים בתוך העובר המוקדם. לדוגמה, כפי שנראה כאן, חלבון Sass6-mCherry ממוקם במוקדים המסומנים על ידי סמן הסנטרוזום Gamma tubulin. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בערך ב-5 עד 6 שעות, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלא להאיץ את התהליך, ולאפשר הבשלה נאותה של התאים הביצתיים לפני הסרת העטיפה (defolliculation) וההפריה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קיבוע של עוברים, במטרה לענות על שאלות נוספות; למשל, בידוד של הגן המבוקש, או מיקום של RNA או חלבון.לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום embryogenesis מוקדם לבחון את תרומתו של תוצרי גנים אימהיים בדגי zebrafish. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע מניפולציה פונקציונלית של תוצרי גנים אימהיים באמצעות הבשלה in vitro של oocytes של zebrafish.

functional-manipulation-maternal-gene-products-using-vitro-oocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למד מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים בדג הזברה באמצעות הבשלת ביציות במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר תרומת האם לפיתוח העובר וייצור עוברים חיים.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות

גלה סרטונים נוספים