ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו באתרו Assay קשירת הסמיכות

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשוות את היתרונות והחסרונות של קו-אימונו-משקעים, או co-ip, ובדיקת קשירת קרבה, או PLA, בהדמיית אינטראקציות חלבון בתאים תאיים שונים. ההשוואה המוצגת כאן בין שתי שיטות שונות יכולה לעזור למדענים להחליט איזו מהן מתאימה יותר למטרה הספציפית שלהם כאשר חוקרים את דפוסי ההתפלגות של אינטראקציות חלבון בגרעין ובציטופלזמה של תא. היתרון העיקרי של co-ip הוא זיהוי אינטראקציות חלבון אותנטיות.

לעומת זאת, היתרון של PLA הוא ניתוח אינטראקציות חלבון המכון בצורה מהירה ברמת התא הבודד. לאחר גידול וקצירת תאי hex293 על פי פרוטוקול הטקסט, ל -3 כפול 10 לתאים 6, הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי ציטופלזמית קרה, ומערבל את התאים במהירות הגבוהה ביותר למשך 15 שניות. דגרו את התמצית על קרח למשך 30 דקות, וכל 10 דקות במהלך הדגירה, מערבלו את הדגימה למשך חמש שניות.

לאחר מכן הוסיפו 16.5 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי ציטופלזמית קרה, מערבולת למשך חמש שניות, ודגרו את הדגימה על קרח למשך חמש דקות. מערבל את התמצית למשך חמש שניות וצנטריפוגה את הדגימה ב-16, 000 x g ו-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור מקורר חדש ושמרו אותו על קרח עד לשימוש, ולאחר מכן השתמשו במיליליטר אחד של PBS קר כדי לשטוף את הכדורים הבלתי מסיסים שלוש פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה והסרת ה-PBS לאחר כל שטיפה.

לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי גרעינית קרה, מערבולת למשך 15 שניות ודגרו על קרח למשך שעה. כל 10 דקות במהלך הדגירה, מערבל את הדגימה למשך 15 שניות, והשתמש בקצה של 200 מיקרוליטר כדי לזרוק את התמיסה 10 פעמים. מערבל את הצינור למשך 15 שניות, וצנטריפוגה של הדגימה ב-16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז העביר את הסופרנטנט המכיל את התמצית הגרעינית לתוך צינור מקורר חדש ושמור אותו על קרח עד לשימוש.

הסר 10% מכל נפח של תמציות גרעיניות וציטופלזמיות כקלט, ולאחר מכן הוסף PBS קר לתמציות הנותרות לנפח סופי של מיליליטר אחד. יש לשמור על קרח עד לשימוש. לאחר ניקוי מוקדם של החרוזים המגנטיים המצומדים של החלבון g במידת הצורך, שלב 40 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים של חלבון g עם ארבעה מיקרוגרם של נוגדן אנטי-RBM3 רב-שבטי מהיר, או IGG מהיר כבקרה שלילית ב-200 מיקרוליטר של PBST.

דגירה עד לטמפרטורת החדר על סיבוב למשך 40 דקות. הנח את הצינורות על מתלה מגנטי, ולאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטן. ואז עם 200 מיקרוליטר PBST, שטפו את החרוזים פעם אחת.

הוסף מיליליטר אחד של ליזאט מדולל לחרוזים, ודגירה על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הנח את הצינורות על המתלה המגנטי ושאף את הסופרנטנט. הוסף לחרוזים 0.5 מיליליטר PBST, ושטוף אותם שלוש פעמים על מסובב בארבע מעלות צלזיוס, במהירות קבועה של 20 סל"ד למשך 10 דקות.

הסר את החלבון מהחרוזים על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של מאגר דגימה, ולאחר מכן חמם את הדגימה בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר סיבוב החרוזים, העבירו את הנוזל לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. כדי לבצע כימיה אימונוציטית, זרעו תאי HEK293 ב-1.5 כפול 10 לארבעת התאים בכל תא בשקופית מצופה פולידליזין בת שמונה חדרים.

ב 0.4 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FPS ו -100 יחידות למיליליטר פנסטרפ. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות, ואז שאפו את המדיום והשתמשו ב-4% PFA כדי לקבע את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במכסה זרימה למינרית. לאחר מכן שאפו את ה-PFA והשתמשו ב-0.5 מיליליטר PBS לכל תא כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.

הוסף 0.5% tritonX100 עם 5% NGS ו-PBS כדי לחלחל ולחסום את התאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, לאחר דילול נוגדנים ראשוניים חד-שבטיים נגד NF90 ואנטי RBM3 מ-1 עד 100, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לבארות ודגרו על השייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש ב 0.5 מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד.

כדי לבצע כימיה אימונוציטית, הוסף דילול של 1 עד 500 של נוגדנים נגד עכברים בשילוב צבע פלואורסצנטי ירוק ונוגדנים נגד ארנב בצבע פלואורסצנטי אדום לתאים ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. הוסף דילול של 1 עד 5,000 של DAPHE NBPS כדי להכתים את הגרעינים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף את הדגימות עם PBS כמו קודם. הסר את התאים ממגלשת הזכוכית וייבש אותם, לפני השימוש ב-250 מיקרוליטר של מדיום הרכבה לכל שקופית כדי להרכיב אותם.

כדי להכין בדיקות בדיקת קשירת קרבה לצינור, לאחר דגירה של תאים ונוגדנים ראשוניים, ושטיפה כפי שהודגם זה עתה, יש לדלל את הבדיקות המוכנות מראש מאחד ל-5 ב-0.1% טריטונקס100 ו-5% NGS ו-PBS, בנפח כולל של 320 מיקרוליטרים עבור שקופית אחת של שמונה חדרים. דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הסר את התאים מצד הזכוכית והוסף את הבדיקות המדוללות, ואז דגר את התאים בחממת לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

הכן תמיסת קשירה על ידי ערבוב שמונה מיקרוליטר ליגאז, 64 מיקרוליטר של מלאי קשירה פי 5 ו-248 מיקרוליטר מים. הקש על הנוזל מהשקופית, והשתמש במאגר כביסה אחד A כדי לשטוף את הדגימות פעמיים למשך חמש דקות כל אחת. מוסיפים את תמיסת הקשירה לדגימות, ומדגרים אותן באינקובטור לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הכן את תמיסת ההגברה על ידי ערבוב ארבעה מיקרוליטר פולימראז, 64 מיקרוליטר של מלאי הגברה פי 5 ו-252 מיקרוליטר מים, ועטוף את הצינור בנייר כסף כדי להגן עליו מפני אור. לאחר מכן, הקש על הנוזל מהשקופית, והשתמש במאגר כביסה אחד A כדי לשטוף את הדגימות פעמיים למשך שתי דקות כל אחת. הוסף את תמיסת ההגברה לדגימות ודגר בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה כהה למשך 100 דקות.

לאחר מכן לאחר הקשה על הנוזל כמו קודם, שטפו את הדגימות פעמיים למשך 10 דקות כל אחת במאגר כביסה B לפני שטיפתן פעם אחת במאגר כביסה של 0.1 x B.לבסוף, יבשו את השקופית והרכיבו את הדגימות עם 250 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מסחרי עם DAPHE, בחנו את העflourescence תחת מיקרוסקופ ורכשו תמונות עם מצלמת CCD. ניסויי קו-אימונו-משקעים עם RBM3 כחלבון הפיתיון גילו כי אינטראקציות NF90-RBM3 קיימות בעיקר בגרעין ומיעוטן נמצא בציטופלזמה. בניסוי אימונופלואורסצנטי זה, NF90 ו-RBM3 נראים שניהם בגרעין.

שני החלבונים נמצאים גם בציטופלזמה ב-C2, ושני החלבונים מראים קולוקליזציה מושלמת בכל תא. כפי שניתן לראות בתמונות אלה, בדיקת קשירת הקרבה חשפה את הדפוס של אינטראקציות NF90-RBM3, הדומה מאוד לכימיה אימונוציטית קונבנציונלית, שרוב האינטראקציות בגרעין ברוב התאים. רק חלק קטן מהתאים הפגין בעיקר התפלגות ציטופלזמית של אינטראקציות NF90-RBM3.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלמרות שנוח יותר, PLA אינו משקף אינטראקציות חלבון ישירות. במקום זאת, co-ip מזהה אינטראקציה מכוונת. בנוסף, הספציפיות של הנוגדן הראשוני קובעת את איכות התוצאה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור שיטה מתאימה לחקר אינטראקציות חלבון בתאים תאיים שונים בהתאם למטרת הניסוי שלך.