Name: ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו באתרו Assay קשירת הסמיכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בגרעין ובציטופלזמה באמצעות שיטות co-immunoprecipitation ו-proximity ligation assay בתאי HEK293. השוואה זו מסייעת לבחור את השיטה המתאימה למחקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (SNSF, 31003A_163305).

1. Co-immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע HEK293 תאים ב 2 x 10 5 תאים לכל היטב צלחת אחת 6-היטב 2 מיליליטר הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תוספת עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו 100 U / mL פניצילין, סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם פוספט שנאגר מלוחים קרים (PBS) שלוש פעמים. קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שברים גרעיניים cytoplasmic באמצעות ריאגנטים הפקה מסחריים גרעיניים cytoplasmic. בצע הוראה של היצרן עם כמה שינויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 x 10 6 תאים לניסוי שיתוף immunoprecipitation אחד (כ 90% confluency מ 3 בארות של צלחת 6-גם אחד). הוספת 300 פתרון מיצוי ציטופלסמית μl קר (אני CER) ו מערבולת למשך 15 שניות במהירות הגבוהה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות על קרח. במהלך הדגירה, vortex עבור 5 ימים כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16.5 פתרון מיצוי ציטופלסמית קר μl השנייה (CER II), מערבולת למשך 5 שניות ו דגירה במשך 5 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס למשך 5 שניות ו צנטריפוגות ב XG 16,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (תמצית cytoplasmic) לתוך צינור מראש צונן חדש, ולשמור על הקרח עד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כדורי מסיסים (גרעינים המכיל) שלוש פעמים עם 1 מ&quot;ל קר PBS בכל פעם על ידי pipetting למעלה ולמטה חמש פעמים. הסר PBS לאחר לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 פתרון מיצוי גרעיני μl קר (NER), מערבולת עבור 15 שניות ו דגירה שעה 1 על הקרח. במהלך הדגירה, מערבולת עבור 15 שניות ו פיפטה 10 פעמים עם טיפ 200 μl כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס למשך 15 שניות ו צנטריפוגות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (תמצית גרעינית) לתוך צינור מראש צונן חדש, ולשמור על קרח עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא 10% מנפח של תמציות גרעיני cytoplasmic כל כתשומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אdd קר PBS על תמציות הנותרים לנפח סופי של 1 מ&quot;ל. שמור על הקרח עד לשימוש. הערה: Pre-הסליקה אינה הכרחית בעת שימוש חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים. עם זאת, אם הרקע הוא גבוה, לבצע מראש סליקה על ידי דוגרים 40 חרוזים מגנטיים μl חלבון G-מצומדות (50% תרחיף) ו 1 מ&quot;ל מדולל lysate משלב זה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על הכתף. supernatant הנפרד (lysate מראש פינה) עשויים חרוזים עם מתלה מגנטית. מחק את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי נוגדן ראשוני זוג עם חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים, דגירה 40 μl חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים (50% תרחיף) עם נוגדנים או IgG ארנב נגד RBM3 ארנב polyclonal 4 מיקרוגרם (שליטה שלילי) ב 200 μl PBS בתוספת חיץ Tween 20 (PBST, 0.02% Tween 20) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 40 דקות על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפרדים נוגדן מצמידים חרוזים supernatant עם מתלה מגנטי, וזורקים supernatant. שטפו את החרוזים פעם עם 200 PBST μl (0.02%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1מ&quot;ל מדולל lysates (או אם lysates הצורך, מראש פינה) על חרוזים, דגירה על הכתף ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, להפריד את החרוזים supernatant ידי מתלה מגנטי, וזורקים supernatant. לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ&quot;ל PBST (0.02%) עבור כל צינור ב 4 ° C על הכתף עם מהירות קבועה של 20 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבונים מן החרוזים ידי הוספת מאגר מדגם 40 μl (חיץ מדגם מסחרי 1x ו -50 מ&quot;מ 1,4-dithiothreitol (DTT)). מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ספין למטה ונוזלים והעברת צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל lysates קלט במאגר מדגם (ריכוז סופי: חיץ מדגם מסחרי 1x ו -50 מ&quot;מ DTT) וחום ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. תשומות טענו וחלבוני immunoprecipitated מהשלב האחרון ג&#39;ל טרומי 4-12% bis-טריס. היקף הטעינה של כל טוב לא יעלה על 20 μl. בצע אלקטרופורזה במאגר ריצה מסחרי 1x על קרח למשך 35 דקות. הערה: גרעיני טען ותמצית cytoplasmicים על יחס של 1: 2 (V / V), אשר משקף את הסכום הראשוני הזהה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלבוני קרום PVDF חיץ העברת מסחרי 1x 30 V עבור שעה 2 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק עם 5% חלב רזה ב PBST (0.1% Tween 20) ב RT במשך 40 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים (הן מדולל 1: 1,000) ב PBST (0.1%) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 x 10 דקות עם PBST (0.1%) ב RT על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם peroxidase חזרת (HRP), מצומדות אנטי עכבר או נוגדנים משני ארנבת אנטי (הן מדולל 1: 5,000) ב PBST (0.1%) ב RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 x 10 דקות עם PBST (0.1%) ב RT על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.2 מ&quot;ל chemiluminescence משופרת (ECL) תערובת המצע לכל קרום 2 ס&quot;מ, לדגור על RT במשך 5 דקות. הימנעו מכל אור משלב זה ואילך למעט אורות אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזלי ולחשוף את סרט רנטגן קלטת סרט. לפתח את הסרט באמצעות יחסי ציבור סרט אוטומטימכונת ocessing. </li></ol> 2. Immunocytochemistry ו Assay קשירת הסמיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע HEK293 התאים ב 1.5 x 10 4 תאים לכל קאמרית השקופית מצופה אחד 8-תא פולי- D- ליזין ב 0.4 מ&quot;ל DMEM בתוספת 10% FBS ו 100 U / ml עט סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני, ולתקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PFA, לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ&quot;ל PBS לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize ותאי לחסום עם 0.5% Triton X-100 ו בסרום עז נורמלי 5% (NGS) ב- PBS ב RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים עיקריים 0.1% Triton X-100 ו -5% NGS ב PBS על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדלל נוגדן אנטי NF90 חד שבטי עכבר הארנב polyclonal אנטי RBM3 נוגדן 1: 100 ב PBS עבור צביעה כפולה. לקבלת שליטה שלילית, להשמיט באופן עצמאי אחד משני הנוגדנים הראשוניים, ולהשמיט הוא נוגדני שליטה שלישית. הערה: אל תשתמשו חסימה מסחרית ריאגנטים דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ&quot;ל PBS לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכפוף פרוטוקולי assay קשירת immunocytochemistry או קרבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 1: 500 נוגדנים משני אנטי עכבר לצבוע מצמידים פלואורסצנטי ירוק מדולל ואדום ניאון לצבוע מצמידים נגד ארנב ב RT עבור שעה 1. הימנע אור משלב זה ואילך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעינים Counterstain עם 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) מדולל 1: 5,000 PBS ב RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ&quot;ל PBS לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור לתאי משקופית הזכוכית ויבשה. הר עם 250 μ, הרכבה בינונית לכל שקופית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay קשירת סמיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בדיקות assay קשירת הקרבה. מערבב לדלל שתי חלליות assay קרבת הקשירה (אנטי עכבר נוגדנים משני נגד ארנב מצורפים עם oligonucleotides שונה אשר יכול ולקשור ההתוספת הגסה של שני oligonucleotides אחרים בתמיסת קשירה) הוא 1: 5 ב 0.1% Triton X-100 ו -5% NGS ב PBS, בהיקף כולל של 320 μl עבור שקופית 8-תא אחד (כ 40 μl לסנטימטר 2) . לדגור על RT במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור לתאי משקופית הזכוכית ולהוסיף החלליות המדוללות. דגירה באינקובטור לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון קשירה. מיקס 8 μl אנזים, 64 μl 5 x מניות קשירה ו -248 μl H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הנוזל משקופית, ולשטוף 2 x 5 דקות 1x לשטוף הצפה (מצורף לערכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון קשירת דגירת חממת לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון הגברה. מערבבים 4 פולימראז μl, 64 μl המניות 5x הגברה 252 μl H 2 O. הימנע אור משלב זה ואילך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את נוזלי משקופית, ולשטוף 2 x 2 דקות בתוך א 1x הצפת לשטוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המגברפתרון lification דגירת חממת לחות כהה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הנוזל משקופית, ולשטוף 2 x 10 דקות ב 1x הצפה לשטוף B (מצורף לערכה). לשטוף דקות 1 ב 0.01x לשטוף הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את שקופית הר עם 250 μl של מדיום גובר מסחרי (עם DAPI) לכל שקופית. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אותות ניאון תחת מיקרוסקופ באמצעות עדשה עינית 10X ו 20X עדשה אובייקטיבית. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת CCD. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר יתרונות כמו גם חסרונות עבור שתי השיטות. כתוצאת שיטה חדשנית יחסית, יתרון ברור של assay קשירת הקרב הוא כדאי להבהיר אינטראקציות בין חלבונים ברמה מתא בודד במקום קבוצה של תאים הטרוגנית. תמונות עם גודל ורזולוציה גבוהים (למשל על ידי מיקרוסקופ confocal) לספק את אפשרות כימות על ידי ספירת כתמי פלורסנט בודדים. לעומת זאת, שילוב הקונבנציונלי של טכניקת שיתוף immunoprecipitation עם כתם מערבי יכול רק למחצה לכמת להקות חלבון, בעיקר בגלל טעינה מלאה מתאימה קשה לקבוע עבור דגימות IP....

גורם גרעיני 90 (NF90) הוא חלבון רב-איזופורם עם פונקציות רבות כולל בתגובה לזיהום ויראלי, הסדרת אינטרלויקין -2 שלאחר תעתיק ורגולציה של מירנה biogenesis 1-3. RBM3 הוא חלבון קושר RNA, מעורב biogenesis תרגום מירנה יכול להיגרם על ידי גורמי לחץ שונים כולל היפותרמיה היפוקסיה 4-6. לאחרונה, מצאנו NF90 ו RBM3 בתוך חלבון מורכב 7. האינטראקציה של NF90 ו RBM3 חיוני לווסת קינאז חלבון-RNA כמו קינאז reticulum endoplasmic (&quot;הערכה&quot;) פעילות בתגובה חלבון פרש 7. שניהם NF90 ו RBM3 ממוקמים בעיקר בגרעין אלא חלק קטן NF90 ושירות הסעות RBM3 לתוך הציטופלסמה לאגד יש לזה עבור פונקציות ספציפיות, למשל להסדיר את הפעילות &quot;הערכה&quot;. לכן, חשוב כדי להמחיש את ההפצה של אינטראקציות NF90-RBM3 בתא subcellular, אשר עשוי להצביעתפקידיהם השונים בתא בהתאמה. לפני עשרות שנים, היברידית שמרים שני (Y2H) פותחה כדי לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים 8. עם זאת, בשל בנייה מלאכותית של חלבונים התמזגו, תוצאות חיוביות כוזבות הגבילו את היישום של שיטה זו. במשך זמן רב, שיתוף immunoprecipitation היה הטכניקה העיקרית לנתח אינטראקציות בין חלבונים, במיוחד בתנאי endogeneous 9. כדי לנתח את מורכבות חלבון-immunoprecipitated שיתוף, כתם מערבי הוא הטכניקה הנוחה ביותר, תוך ספקטרומטריית מסה משמשת כאשר רגישות ודיוק סופר הם רצויות. בשנים האחרונות, assay קשירת הקרבה פותח שיטה חדשה לאיתור אינטראקציות חלבון-חלבון בשני התאים והרקמות באתרו 10,11. הנה, השווינו את שיטת שיתוף immunoprecipitation הפופולרית ביותר ושיטת assay רומן יחסית קרב קשירה בלכידת NF9האינטראקציה 0-RBM3 שברים subcellular. דנו גם את היתרונות והמגבלות של שתי הטכניקות.

<table><tbody><tr><td>הנשר השונה של דולבקו s בינוני (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>גלוקוז 4,500 מ"ג/</td></tr><tr><td>ליטר סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER ריאגנטים למיצוי גרעיני וציטופלזמי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110) נוגדן</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>להשתמש ב-1:1,000 עבור WB ו-1:100 עבור נוגדן ICC/PLA</td></tr><tr><td>RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>השתמש ב-1:1,000 עבור WB ו-1:100 עבור ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C</td><td>טכנולוגיית</td> <td>איתות תאי נוגדנים#2032</td><td>השתמש ב-1:1,000 עבור WB&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>השתמש ב-1:1,000 עבור WB&nbsp;</td></tr><tr><td>ארנב רגיל IgG</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG, נוגדן משני מקושר HRP</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> <td>#7074</td><td>השתמש ב-1:5,000 עבור WB&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן משני HRP נגד עכבר</td><td>קארל רות'</td><td>4759.1</td><td>השתמש ב-1:5,000 עבור WB&nbsp;</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS מאגר ריצה (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF ממברנה</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (נוגדן H+L), Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG (נוגדן H+L), Alexa Fluor 568 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-דיאמידין-2-פנילינדול (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA בדיקה נגד עכבר PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; בדיקה אנטי ארנב MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink זיהוי ריאגנטים אדום</td><td>סיגמא</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Wash Buffers פלואורסצנטי</td><td>סיגמא</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink הרכבה בינונית עם DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>סרט רנטגן</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>מכונת עיבוד סרטים</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; assay קשירת הסמיכות

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

אינטראקציות חלבון-חלבון מעורבות באלפי תהליכים תאיים ומתרחשות בהקשר מרחבי מובהק. באופן מסורתי, קו-אימונו-משקעים היא טכניקה פופולרית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון. ניתוח כתמים מערביים לאחר מכן הוא השיטה הנפוצה ביותר להמחשת חלבונים בעלי משקעים חיסוניים. לאחרונה, בדיקת קשירת הקרבה הפכה לכלי רב עוצמה להמחשת אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן ומספקת את האפשרות לכמת אינטראקציות חלבון-חלבון בשיטה זו. בדומה לאימונוציטוכימיה קונבנציונלית, טכניקת בדיקת קשירת הקרבה מבוססת גם על נגישות של נוגדנים ראשוניים לאנטיגנים, אך לעומת זאת, בדיקת קשירת קרבה מזהה אינטראקציות חלבון-חלבון בטכניקה ייחודית הכוללת PCR במעגל מתגלגל, בעוד שאימונוציטוכימיה קונבנציונלית מראה רק לוקליזציה משותפת של חלבונים.
גורם גרעיני 90 (NF90) וחלבון מוטיב קושר RNA 3 (RBM3) הוכחו בעבר כשותפים אינטראקטיביים. הם ממוקמים בעיקר בגרעין, אך גם נודדים לציטופלזמה ומווסתים את מסלולי האיתות בתא הציטופלזמי. כאן, השווינו אינטראקציה של NF90-RBM3 הן בגרעין והן בציטופלזמה על ידי בדיקת קו-אימונו-משקעים וקשירת קרבה. בנוסף, דנו ביתרונות ובמגבלות של שתי הטכניקות הללו בהדמיית אינטראקציות חלבון-חלבון ביחס להתפלגות מרחבית ולתכונות של אינטראקציות חלבון-חלבון.

איור 1 מדגים כי NF90 ו RBM3 הוא חלבונים גרעיניים רק חלק קטן נוכח בציטופלסמה. יש לציין, יש שלוש להקות שונות מוכתמות חיובי RBM3. הקטן רק מתחת ל -20 kDa משקף את הגודל הנכון של RBM3 (המשקל המולקולרי החזה של RBM3 הוא 17 KDA). מקורו של שתי הלהקות האחרות נשאר להיחקר. ניסויי Co-immunoprecipitation עם RBM3 כמו חלבון הפיתיון גילו כי אינטראקציות NF90-RBM3 נוכחות בעיקר בגרעין ומיעוט בציטופלסמה. נתונים Co-immunoprecipitation תומך בלוקליזציה של ...

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשוות בין היתרונות והחסרונות של שיטת השקיעה החסונית משותפת (co-immunoprecipitation, או co-ip) לבין בדיקת קישור קרבה (proximity ligation assay, או pla), לצורך ויזואליזציה של אינטראקציות בין חלבונים במדורים תאיים שונים. ההשוואה המוצגת כאן בין שתי שיטות שונות יכולה לסייע למדעים להחליט איזו מהן מתאימה יותר למטרתם הספציפית בעת חקירת דפוסי ההפצה של אינטראקציות בין חלבונים בגרעין ובציטופלזמה של התא. היתרון העיקרי של co-ip הוא זיהוי אינטראקציות אותנטיות בין חלבונים.לעומת זאת, היתרון של pla הוא ניתוח אינטראקציות בין חלבונים באופן מהיר ברמת התא הבודד. לאחר גידול וקצירה של תאי hex293 בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ל-3 times 10 to the 6th תאים, יש להוסיף 300 µL של תמיסת מיצוי ציטופלזמית קרה, ולערבב את התאים במכשיר vortex במהירות הגבוהה ביותר למשך 15 שניות. יש לדגור את המיצוי על קרח למשך 30 דקות, ובכל 10 דקות במהלך הדגירה, לערבב את הדגימה במכשיר vortex למשך חמש שניות.לאחר מכן, הוסיפו 16.5 µL של תמיסת מיצוי ציטופלזמית קרה, ערבבו ב-vortex למשך חמש שניות, והדגירו את הדגימה על קרח למשך חמש דקות. ערבבו את התמצית ב-vortex למשך חמיש שניות וסבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-16,000 x g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. העבירו את עלון הנוזל (supernatant) למבחנה חדשה ומקוררת ושמרו אותה על קרח עד לשימוש, ולאחר מכן השתמשו ב-1 mL של PBS קר כדי לשטוף את המשקעים הבלתי מסיסים שלוש פעמים על ידי שאיבה והזרקה (pipetting up and down) והסרת ה-PBS לאחר כל שטיפה.בשלב הבא, הוסיפו 150 µL של תמיסת מיצוי גרעינית קרה, ערבבו במערבל Vortex למשך 15 שניות, והדגירו על קרח למשך שעה אחת. בכל 10 דקות במהלך ההדגרה, ערבבו את הדגימה ב-Vortex למשך 15 שניות, והשתמשו בטיפ של 200 µL כדי לבצע פיפוט של התמיסה 10 פעמים. ערבבו את המבחנה ב-Vortex למשך 15 שניות, וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 16,000 x g בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות, לאחר מכן העבירו את העלייה (supernatant) המכילה את התמצית הגרעינית למבחנה חדשה שקוללה מראש ושמרו אותה על קרח עד לשימוש.הסיר 10% מכל אחד מנפחי התמציות הגרעיניות והציטופלזמיות כדגימות קלט (inputs), ולאחר מכן הוסף PBS קר לתמציות שנותרו עד לנפח סופי של מיליליטר אחד. שמור על קרח עד לשימוש. לאחר ניקוי מקדמי (preclearing) של חרוזי מגנט מצופים ב-protein g במידת הצורך, ערבב 40 µL של חרוזי מגנט מצופים ב-protein g עם ארבעה µg של נוגדן פוליקלונלי מהיר נגד RBM3, או rapid IGG כביקורת שלילית ב-200 µL של PBST.דגרו עד לטמפרטורת החדר על שייקר סיבובי למשך 40 דקות. הניחו את המבחנות על מגנט, לאחר מכן הסירו והשליכו את העילוי. לאחר מכן, שטפו את החרוזיים פעם אחת עם 200 µL של PBST.הוסיפו מיליליטר אחד של ליסאטים מהולים לחרוזים, והדגירו במטיל (rotator) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הניחו את המבחנות על המגנט (magnetic rack) ושאבו את העילאי (supernatant). הוסיפו 0.5 מיליליטר של PBST לחרוזים, ושטפו אותם שלוש פעמים במטיל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, במהירות קבועה של 20 rpm למשך 10 דקות.אלטרו את החלבון מהחרוזים על ידי הוספת 40 µL של תמיסת דגימה, ולאחר מכן חממו את הדגימה בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות. לאחר סבב צנטריפוגה להסמקת החרוזים, העבירו את הנוזל למבחנה חדשה בנפח 1.5 mL. לביצוע אימונוציטוכימיה, זרעו תאי HEK293 בריכוז של 1.5 × 10⁴ תאים לתא בתוך שקופית עם שמונה תאים המצופה ב-polydelysine.ב-0.4 מיליליטר של DMEM המועשר ב-10% FPS ו-100 units per milliliter של penstrep. דגרו את התאים ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות, לאחר מכן שאבו את המצע והשתמשו ב-4% PFA כדי לקבע את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במנדף זרימה למינרית. לאחר מכן שאבו את ה-PFA והשתמשו ב-0.5 מיליליטר של PBS לכל תא כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.הוסיפו 0.5%tritonX100 עם 5%NGS ו-PBS כדי להחדיר חומרים (permeabilize) ולחסום את התאים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, לאחר דילול של נוגדנים ראשוניים מونوקלונליים נגד NF90 ופוליקלונליים נגד RBM3 ביחס של 1:100, הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים לבארים והדגירו על מנער בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמשו ב-0.5 milliliters של PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם.לביצוע אימונוכימיה של תאים, הוסיפו לתאים נוגדנים נגד עכבר המשורבבים לצבע פלואורסצנטי ירוק ונוגדנים נגד ארנב המשורבבים לצבע פלואורסצנטי אדום בדילול של 1:500, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. הוסיפו DAPHE NBPS בדילול של 1:5,000 לצביעת נגדית של הגרעינים והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו את הדגימות עם PBS כפי שבוצע קודם לכן. הסירו את התאיות מהמסלייד וייבשו אותן, לפני שימוש ב-250 µL של מדיום קיבוע לכל מסלייד לצורך קיבועם.להכנת גששים עבור בדיקת ליגציה בקרבה (proximity ligation assay) בשפופרות, לאחר דגירה של התאים והנוגדנים הראשוניים, ושטיפה כפי שהודגם זה עתה, לדלל את הגששים המוכנים ביחס של 1 ל-5 ב-0.1% tritonx100 ו-5% NGS ו-PBS, בנפח כולל של 320 µL עבור למסחת שמונה תאים אחת. לדגור את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. להסיר את התאיים מצד הזכוכית ולהוסיף את הגששים המדוללים, ולאחר מכן לדגור את התאיים באינקובטור לחות ב-37 °C למשך שעה אחת.הכינו תמיסת ליגציה על ידי ערבוב של שמונה מיקרוליטרים של ליגאז, 64 מיקרוליטרים של תמיסת ליגציה מרוכזת 5x, ו-248 מיקרוליטרים של מים. הקישו להסרה את הנוזל מהשקף, והשתמשו ב-onex wash buffer A כדי לשטוף את הדגימות פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם. הוסיפו את תמיסת הליגציה לדגימות, והדגירו אותן באינקובטור לחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות.הכינו את תמיסת ההגברה על ידי ערבוב של 4 µL פולימראז, 64 µL של תמיסת הגברה מרוכזת 5x, ו-252 µL מים, ועטפו את המבחנה בנייר אלומיניום להגנה מאור. לאחר מכן, נקו את הנוזל מהסלייד, והשתמשו ב-1x wash buffer A כדי לשטוף את הדגימות פעמיים למשך שתי דקות בכל פעם. הוסיפו את תמיסת ההגברה לדגימות והדגירו להן להתרחב בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח וחשוך למשך 100 דקות.לאחר ניקוז הנוזל כפי שנעשה קודם לכן, שטפו את הדגימות פעמיים, 10 דקות בכל פעם, בבופר שטיפה B, לפני שטיפה אחת בבופר שטיפה B בריכוז 0.1x. לבסוף, ייבשו את הפסלודה והצמידו את הדגימות בעזרת 250 µL של מדיום הצמדה מסחרי עם DAPHE, בחנו את הפלואורסצנציה תחת מיקרוסקופ וצלמו תמונות באמצעות מצלמת CCD. ניסויי שיקיעת אימונו-חלבון (Co-immunoprecipitation) שבהם שימש RBM3 כחלבון הפיתיון הראו כי האינטראקציות בין NF90 ל-RBM3 נמצאות בעיקר בגרעין ומיעוטן נמצא בציטופלזמה. בניסוי אימונו-פלואורסצנציה זה, ניתן לראות הן את NF90 והן את RBM3 בגרעין.שני החלבונים נמצאים גם בציטופלזמה ב-C2, ושני החלבונים מראים קולוקליזציה מושלמת בכל תא. כפי שניתן לראות בתמונות אלו, בדיקת ה-proximity ligation assay חשפה את דפוס האינטראקציות של NF90-RBM3, אשר דומה מאוד לשיטת אימונוציטוכימיה קונבנציונלית, שבה רוב האינטראקציות מתרחשות בגרעין ברוב התאים. רק חלק קטן מהתאים הראו התפלגות ציטופלזמית דומיננטית של אינטראקציות NF90-RBM3.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי למרות הנוחות הגדולה יותר, PLA אינה משקפת אינטראקציות בין חלבונים באופן ישיר. תהליך co-ip, לעומת זאת, מזהה אינטראקציה מכוונת. בנוסף, הספציפיות של הנוגדן הראשוני קובעת את איכות התוצאה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה כיצד לבחור בשיטה המתאימה למחקר אינטראקציות בין חלבונים במדורים תאיים שונים, בהתאם למטרות הניסוי שלכם.

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בגרעין ובציטופלזמה באמצעות שיטות co-immunoprecipitation ו-proximity ligation assay בתאי HEK293. השוואה זו מסייעת לבחור את השיטה המתאימה למחקר.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו

גלה סרטונים נוספים