Name: תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: למדו פרופיל ביטוי גנים בתאים בודדים באמצעות FACS ו-qPCR עם סטנדרטים פנימיים. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של רמות mRNA ומספקת חלופה חסכונית ל-RNA-Seq במחקר ביולוגיית תאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות V. קאפור ב Core cytometry זרימת CCR ETIB עבור לעזרתה בביצוע מיון התא במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים גם מ Raffeld ויחידת האבחון המולקולרי CCR LP וג &#39;ג&#39; ו ואת רצף NHLBI דנ&quot;א ג&#39;נומיקס Core עבור לעזרתם בביצוע qPCR במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. מחקר זה נתמך על ידי התכנית העירונית של NIH.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הצגנו שיטה לבידוד בתאי יונקים בודדים מתוך אוכלוסייה של תאי חסיד הגדלים בתרבית ועבור מנסה לאמוד את הביטוי של כ 96 גנים בכל תא. הכנה מראש טוב הוא קריטי עבור בשיטה זו כדי לעבוד היטב. בפרט, בעיצוב פריימר בדיקות זוגות מסוימים אל תעתיקי עניין (שלבי 1.2-1.3) צורכים זמן אבל חשובי צעדים, כמו פריימרים לקבוע את איכות המדידות-התא הבודד. לאחר זוגות פריימר אמינים התקבלו, הם משמשים כדי להגביר cDNA מן תמלילי העניין; amplicons מכן משולבים יחד בכמויות equimolar לעשות סטנדרטים (שלב 1.4). שלב זה הוא ...

תאים בודדים בתוך אוכלוסייה יכול להראות תגובות ומעולם שונות לגירוי 1 פיסיולוגי אחיד, 2, 3, 4. הווריאציה הגנטית של תאים באוכלוסייה היא מנגנון אחד עבור מגוון זה של תגובות, אבל יש גם כמה גורמים שאינם גנטיים שיכול להגדיל את ההשתנות של תגובות, גם באוכלוסייה משובטת של תאים. לדוגמא, הרמות של חלבונים בודדים מולקולות איתות חשובות אחרות יכולות להשתנות על בסיס תא אחר תא, והולידו וריאצית פרופילי ביטוי גנים במורד זרם. בנוסף, הפעלת גנים יכולה להתרחש התפרצויות קצר משך התמלילים 5, 6 שעשויות להיות מוגבל למספר קטן יחסית של תמלילים לכל פרץ 7, 8, 9. כגוןstochasticity ב הפעלת הגן יכול לתרום השתנות מאוד תגובות ביולוגיות והוא יכול לספק יתרון סלקטיבי מיקרואורגניזמים 10 ו בתאי יונקים 1, 2 מגיבים על גירוי פיזיולוגי. בשל שני המקורות הגנטיים שאינם גנטיים של וריאציה, פרופיל ביטוי גנים של כל תא נתון בתגובה לגירוי עשוי להיות שונה באופן משמעותי מפרופיל ביטוי גנים הממוצע המתקבל מדידת התגובה בתפזורת. קביעת המידה שבה תאים בודדים מראים השתנות בתגובה לגירוי דורשת טכניקות עבור הבידוד של תאים בודדים, מדידת רמות ביטוי תמלילי העניין, ועל הניתוח חישובית של נתוני הביטוי שהתקבלו. ישנן מספר גישות מנסים לאמוד ביטוי גנים בתאים יחידים, מכסי מגוון רחב של עלויות, מספר תמלילי נחקר, ודיוק של כימות. לדוגמא, תא בודד RNA-seq מציע עומק רחב של כיסויי תמליל ואת היכולת לכמת אלף תמלילים ברורים עבור הגנים הביעו הגבוהה ביותר בתאים בודדים; עם זאת, העלות הכרוכה עומק רצף כזה עלולה להיות מרתיעה, אם כי עלויות ממשיכות לרדת. לעומת זאת, קרינת RNA מולקולה בודדת הכלאה באתרו (FISH smRNA) מציעה כימותים מדויקים של תמלילים אפילו נמוך לבטא גנים במחיר סביר לכל גן של עניין; עם זאת, רק מספר קטן של גני מטרה ניתן assayed בתא נתון על ידי גישה זו. מבחני PCR מבוססים כמוני, כמתואר בפרוטוקול זה, לספק את שביל זהב בין הטכניקות הללו. מבחנים אלו להעסיק המכונים PCR microfluidic בזמן אמת לכמת עד 96 תמלילי עניין בכל פעם עד 96 תאים. בעוד כל אחת מהשיטות הנ&quot;ל יש עלויות חומרה נדרשות, את העלות של כל assay qPCR פרט היא יחסיתנָמוּך. פרוטוקול זה מותאם מאחד שהוצע על ידי היצרן של מכונת PCR microfluidic בזמן אמת (פרוטוקול ADP 41, Fluidigm). כדי להפעיל את הערכת מספרם המוחלט של כל תמליל בגישה מבוססת PCR, הרחבנו את הפרוטוקול לעשות שימוש לגבי הבקרה פנימית על amplicons גן המטרה המוכן שניתן להשתמש בה בכל ניסויים מרובים. כדוגמה של טכניקה זו, כימות של ביטוי גנים מוסדר על ידי p53 מדכא גידולים בתאי סרטן שד אנושיים MCF-7 מתוארת 11. התאים מאותגרים עם סוכן כימי שגורם הפסקות פעמים גדיל DNA. מחקרים קודמים הראו כי התגובה p53 הפסקות DNA פעמיים גדיל מפגין מידה רבה של ההטרוגניות בתאים בודדים, הן מבחינת רמות ה- p53 12 ו בהפעלת גני מטרה מובחנת 11. יתר על כן, p53 מסדיר את הביטוי של למעלה מ -100היטב מאופיין גני מטרה המעורבים מסלולים רבים במורד הזרם, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס, והזדקנות 13, 14. מאז התגובה בתיווך p53 בכל תא היא גם מורכבת ומשתנה, הניתוח של יתרונות המערכת מגישה שבה כמעט 100 גני המטרה ניתן נחקר בו זמנית בתאים בודדים, כמו זו מתוארת להלן. עם שינויים קלים (כגון שיטות חלופיות עבור בידוד תא בודד תמוגה), הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאים של יונקים, תעתיקים, ואת תגובות הסלולר. עם הכנה מראש נכונה, סבב מיון תא ומדידת ביטוי גנים יכול להתנהל על פי פרוטוקול זה על פני תקופה של שלושה ימים. העיתוי הבא הוא הציע: מראש, בחר את תמלילי העניין, לזהות ולאמת את הזוגות פריימר כי להגביר את cDNA מאלה transcripts, ולהכין את הסטנדרטים ותערובות פריימר באמצעות פריימרים אלו. ביום 1, לאחר טיפול בתא, קציר ולמיין את התאים, לבצע שעתוק לאחור והגברת יעד ספציפי, ולטפל דגימות עם exonuclease להסיר פריימרים מאוגדים. ביום 2, לבצע בקרת איכות על תאים ממוינים באמצעות qPCR. לבסוף, ביום 3, למדוד את ביטוי הגנים בתאים המסודרים באמצעות microfluidic qPCR. איור 1 מסכם את השלבים הכרוכים.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה עם מעכב RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT ערכת בדיקת dsDNA ברגישות גבוהה</td><td>תרמו-פישר</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עם הידבקות נמוכה</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>מאגר השעיה DNA</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 מ"ל שחזור מקסימום צינורות PCR קיר דק</td><td>קורנינג</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 מערך דינמי DNA מחייב צבע דגימה & ערכת ריאגנטים לטעינת בדיקה</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 מדיה</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך (ארה"ב)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>קורנינג</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>ניאוקרזינוסטטין</td><td>סיגמא</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect חד-שלבי qRT-PCR ערכת</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal סרט איטום, סטרילי</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro; m מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix עם ROX</td><td>Bio-Rad</td> נמוך <td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 מערך דינמי IFC לביטוי גנים (שבב qPCR מיקרופלואידי)</td> <td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>בקר IFC HX (מכונת טעינה)</td> <td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark או BioMark HD (מכונת qPCR מיקרופלואידית)</td>תוכנת ניתוח PCR בזמן אמת <td>של Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>תוכנת <td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תאים יחידים gene expression profiling שימוש facs ו qpcr עם סטנדרטים פנימיים

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

מדידות ביטוי גנים מאוכלוסיות בתפזורת של תאים יכולות לטשטש את השונות הטרנסקריפטומית הניכרת של תאים בודדים בתוך אוכלוסיות אלה. מדידות ביטוי גנים של תא בודד יכולות לעזור להעריך את תפקיד הרעש בביטוי גנים, לזהות מתאמים בביטוי של זוגות גנים ולחשוף תת-אוכלוסיות של תאים המגיבים בצורה שונה לגירוי. כאן, אנו מתארים הליך למדידת הביטוי של עד 96 גנים בתאי יונקים בודדים שבודדו מאוכלוסייה הגדלה בתרבית רקמה. תאים ממוינים למאגר ליזה על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS), ומיני ה-mRNA המעניינים מתועתקים ומוגברים לאחור. לאחר מכן נמדד ביטוי הגנים באמצעות מכונת PCR מיקרופלואידית בזמן אמת, המבצעת עד 96 בדיקות qPCR על עד 96 דגימות בכל פעם. אנו מתארים גם את היצירה והשימוש בתקני אמפליקון PCR כדי לאפשר הערכה של המספר המוחלט של כל תעתיק. בהשוואה לשיטות אחרות למדידת ביטוי גנים בתאים בודדים, גישה זו מאפשרת כימות של תעתיקים מובחנים יותר מ-RNA FISH בעלות נמוכה יותר מ-RNA-Seq.

סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1, כוללת צעדים לטיפול תא, הבידוד של תאים בודדים על ידי FACS, דור מראש הגברה של ספריות cDNA מ lysates תא בודד, האישור של ספריות cDNA מתא בודד ב בארות מיון, וכן מדידה של ביטוי גנים על ידי qPCR. לקראת בידוד תא בודד וניתוח ביטוי גנים, יש צורך לזהות זוגות פריימר oligonucleotide תקפים ראשון עבור כל גן...

אנו מתארים שיטה למיון תאי יונקים בודדים ולכמת את הביטוי של עד 96 גנים מעניינים בכל תא. שיטה זו כוללת שימוש בתקני qPCR פנימיים כדי לאפשר הערכה של ספירת תעתיקים מוחלטת.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את רמות ה-mRNA בתאים בודדים באמצעות qPCR מיקרופלואידי עם סטנדרטים פנימיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאים בודדים, כגון השאלה האם אוכלוסיות של תאים מגיבות לגירוי בדרכים שונות באופן אופייני. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת למדוד ביטוי של גנים רבים יותר מאשר ב-RNA FISH, ובעלות נמוכה יותר מ-RNA-Seq בתאים בודדים.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר בחנו פרוטוקולים למדידת ביטוי גנים בתאים בודדים באמצעות qPCR מיקרופלואידי. רצוננו היה לשנות שיטות קיימות כדי להעריך בדיוק רב יותר את המספר המוחלט של תמלילים שונים בתאים בודדים. את הליך מיון התאים יעגים וילם טלפורד, מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שבו משתמש המעבדה שלי.לאחר הפקה וטיהור של אמפליקונים מהגנים הרלוונטיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ערבבו 18 מיקרוליטר מכל אמפליקון מטוהר בתוך מבחנה מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מיליליטר בעלת קישור נמוך (low binding), ולאחר מכן הוסיפו באפר לתליה של DNA עד לנפח של 1,800 מיקרוליטר, כך שריכוזו של כל אמפליקון יהיה 5×10⁶ מולקולות למיקרוליטר. ערבבו היטב באמצעות וורטקס את סטנדרט ה-5e6 וחלקו אותו לאליקוטיות של 20 מיקרוליטר במבחנות PCR בעלות קישור נמוך. לאחר זריעת תאי MCF7 p53-Venus בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו לתאים 400 ננוגרם למילליטר של neocarzinostatin וטפלו בהם למשך 3, 8.5, 14 או 24 שעות.להכנת תמיסת ליזיס (lysis buffer), ערבבו את הרכיבים המפורטים בטבלה זו. העבירו 92.4 microliters מהתמיסה למבחנה נפרדת שתשמש כתמיסת ליזיס עבור סטנדרטי האמפליקון (amplicon standards). שאר תמיסת הליזיס תשמש עבור התאים.הכינו והוסיפו DNA של E.coli למסיי (lysis buffer) עבור התאים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב. להכנת סטנדרטים, סמנו שש מבחנות צנטריפוגה בעלות קישור נמוך (low binding). הוסיפו 90 µL של תמיסת DNA למבחנה המסומנת כ-5e5.הוסיפו 90 µL של תמיסת בופר המכילה 6.2 pg/µL של DNA של E.coli לכל אחת מחמש הפרוטות האחרות ושמרו את כל הפרוטות על קרח. לאחר הוצאת מנה של 5e6 סטנדרט מהאחסון, ערבבו את הפרוטה קצרות במערבל (vortex), לאחר מכן צנטריפוגו אותה כדי להבטיח שהנוזל נמצא בתחתית הפרוטה, ובאמצעות טיפ של פפיטה בעלת קישור נמוך (low binding), הוסיפו 10 µL של 5e6 סטנדרט לפרוטה של 5e5. ערבבו במערבל, צנטריפוגו והחזירו את הפרוטה לקרח.בשלב הבא, העבירו בעזרת פפית 10 µl מהמבחנה 5e5 למבחנה 5e4, לאחר מכן ערבבו את המבחנה קצרה ב-vortex, צנטריפוגו והחזירו אותה לקרח. חזרו על הדילולים הסדרה עם כל מבחנה, כאשר לכל מבחנה מועברים 10 µl מהמבחנה הקודמת, עד שכל המבחנות יכילו דילול של התקן. לאחר הכנת מבחנות PCR עם תמיסת ליזיס, חלקו בעזרת פפית 12 ערוצים תשעה µl של תמיסת ליזיס לתאים משורת מבחנות ה-PCR לכל באר בשבע השורות הראשונות של פלטת PCR.חלקו שבעה µL של באפר ליזיס סטנדרטי לכל באער בשורה האחרונה של הפלטה, ולאחר מכן, באמצעות טיפים של פ pipette בעלי קישור נמוך (low binding), הוסיפו שני µL של סטנדרט לכל באער בשורה התחתונה בהתאם למפת הפלטה. הוסיפו שני µL של 3.1 pg/µL של DNA של E.coli לבאערים של 10 תאים ו-100 תאים, ולאחר מכן הוסיפו שני µL של 6.2 pg/µL של DNA של E.coli לבאערים ללא תאים. לאחר תכנות המיון התאי הפלואורסצנטי (fluorescence activated cell sorter) למיון לתוך פלטת 96 באערים בהתאם למפת הפלטה, כדי לכוון את המכשיר, אטמו פלטת PCR ריקה והשתמשו בזרם הבדיקה כדי למיין טיפות ו-PBS על גבי האטם של הפלטה הריקה.אם הטפטופים אינם נוחתים במיקום הנכון, נגבו אותם מפני השטח של האטם, כיילו מחדש את ממייין התאים בהתאם להוראות יצרן המכשיר, וחזרו על הפעולה עד שהטפטופים בזרם המיון יופקדו באופן תקין. קצרו את התאים באמצעות טריפסינציה ותלה אותם מחדש ב-0.5 milliliters של PBS עם 2%FBS, ולאחר מכן העבירו אותם לשפופרת ציטומטריית זרימה. כדי למיין את התאים, הכניסו את השפופרת עם תרחיף התאים לממייין התאים, פתחו את האטם בלוחית של תמיסת הליזה, ומיינו בזהירות את התאים הרצויים לתוך הלוחית בהתאם למפת הלוחית.כדי להבטיח מיון של תאים בודדים בטוהר מרבי, הפעילו את המכשיר במצב תאים בודדים והשתמשו בסינון (gating) סטנדרטי של ציטומטריית זרימה המבוסס על פיזור קדמי וצדי (forward and side scatter). לאחר ההרצה, השתמשו באיטום תרמי סטרילי חדש כדי לאטום את הפלטה וסובבו אותה בצנטריפוגה ב-400 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן הניחו את הפלטה במכשיר ה-thermal cycler והפעילו את תוכנית ה-RT-STA שהוכנה מראש. לאחר סבוב של פלטת ה-RT-STA שהושלמה, השתמשו בפיפט רב-ערוצי (12 ערוצים) כדי לחלק 3.6 µL של exonuclease I מדולל לכל באער בפלטה.אטמו את הפלטה וסובבו אותה קצרקם בצנטריפוגה, ולאחר מכן הניחו את הפלטה בטרמיקלסייקליר והריצו את תוכנית ה-exo I. כדי למדוד את ביטוי הגן של בית האחזקה (housekeeping gene) בכל דגימה, הכינו 900 מיקרוליטר של תערובת מאסטר qPCR עם צבע קושר DNA ל-96 תגובות, תוך שימוש בפריימרים של אחד מגני בית האחזקה שנבחרו. חלקו תשעה מיקרוליטר של תערובת המאסטר לכל באער בפלטת PCR בעלת 96 באערים, ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של דגימה מפלטת הדגימות לבאער התואם בפלטת ה-PCR.הריצו את הפלטה במכשיר real time PCR באמצעות פרוטוקול מחזורי תרמי המוצע על ידי יצרן ה-master mix או לפי פרוטוקול סטנדרטי, ולאחר מכן נתחו את הדגימות והכינו מפת פלטה של תערובות דגימה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סמנו פלטה של תערובות דגימות ולאחר מכן, באמצעות פיפט שמונה-ערוצי, חלקו 3.3 µL של תערובת ריאגנט טעינת דגימות master mix לתוך כל באר בפלטת PCR בעלת 96 בארות. עבור כל פלטת PCR של דגימות, ערבבו את הפלטה ב-vortex למשך 10 שניות וסובבו אותה ב-500 ×g למשך 10 שניות.הסיר את המכסה והעבר 2.7 µL מכל דגימה חיובית של תא בודד לבאר התואמת בלוח תערובות הדגימות, עבור בארי התא הבודד המצוינים במפת הלוח. קלף את המדבקה מהחלק התחתון של שבב qPCR מיקרופלואידי חדש, ולאחר מכן, באמצעות מזרק עם נוזל קו בקרה כאשר הפקק עדיין סגור, לחץ על כל קפיץ צובר כדי לשחרר אותו והזרק לכל צובר 100 עד 200 µL של נוזל קו בקרה. הכנס את השבב למכונת הטעינה והפעל את סקריפט ההכנה (prime script), ולאחר מכן, באמצעות פיפט שמונה ערוצים, העבר 4.5 µL מכל תערובת בדיקה לצד שמאל של שבב ה-qPCR המיקרופלואידי.חשוב מאוד להימנע מיצירת בועות אוויר בתחתית הבארות. דבר זה יגרום לבעיות בהטענה. כדי למנוע זאת, השמחו את קצות הפפיטות לדופן הבאר, ולאחר מכן שאיפו נוזל רק עד לעצירה הראשונה.העבירו 4.5 µL מכל תערובת דגימה לצדו הימני של שבב ה-qPCR המיקרופלואידי, לאחר מכן הכניסו את השבב למכונת הטעינה והפעילו את סקריפט טעינת התערובת. עם סיום סקריפט טעינת התערובת, ודאו שאין קווים החוצים את השבב, דבר שעשוי להעיד על בעיית טעינה; לאחר מכן השתמשו בסרט דביק כדי להסיר בזהירות חלקיקי אבק מהשבב, הכניסו את השבב למכונת ה-real time PCR המיקרופלואידית והפעילו את סקריפט איסוף הנתונים. לבסוף, נתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.איור זה מציג את רמות הביטוי של גן בית (housekeeping gene) שנמדדו באמצעות qPCR כדי לקבוע באילו בארות נמצא תא בודד. לדגימות שבהן נמצא תא יש ערכי CT נמוכים. לדגימות ללא תא יש ערכי CT גבוהים בהרבה.הבארים עבור הסטנדרט של האמפליקון צריכים להציג עקומות הגברה במרווחים שווים. כמו כן, צריכה להיות הפרדה ברורה בעקומות עבור הבארים ללא תאים, עם 10 תאים ועם 100 תאים. דגימות DNA של תאי זריעה המייצגות תאים ממשיים נבחרות באופן סלקטיבי ממספר פלטות 96-בארים ממוינות ומאוחדות לפלטה אחת כדי להכין ל-qPCR מיקרופלואידי.מפת חום זו מסכמת את תוצאות ה-qPCR המיקרופלואידיות. השונות בצבע בכל עמודה מראה את השונות בביטוי של כל גן בין תאים שונים. שתי השורות הכהות משמעותית משאר השורות מייצגות ככל הנראה דגימות פגומות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על אזור העבודה נקי מ-RNase ומ-DNA, במיוחד בעת הכנת התמיסות הסטנדרטיות ובופר הליזיס. שלבי ה-pre-PCR בפרוטוקול זה רגישים לזיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לכמת ביטוי של מספר גנים רצויים בתאים בודדים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון single molecule RNA FISH, כדי לתקף מדידות של שפע mRNA בתאים בודדים.

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

ניתן להבחין בין ניתן להבחין בין כרומוזומי מעצבים של פרויקט גנום השמרים הסינתטיים, Sc2.0, לבין עמיתיהם המקוריים באמצעות בדיקת גנוטיפ מבוססת PCR הנקראת PCRTagging, שיש לה נקודת קצה של נוכחות/היעדרות. כאן אנו מתארים שיטת זיהוי PCR בזמן אמת בתפוקה גבוהה עבור גנוטיפ PCRTag.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

למדו פרופיל ביטוי גנים בתאים בודדים באמצעות FACS ו-qPCR עם סטנדרטים פנימיים. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של רמות mRNA ומספקת חלופה חסכונית ל-RNA-Seq במחקר ביולוגיית תאים בודדים.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

גלה סרטונים נוספים