תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את רמות ה-mRNA בתאים בודדים באמצעות qPCR מיקרופלואידי, עם תקנים פנימיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תא בודד, כגון האם אוכלוסיות תאים של תאים מגיבות לגירוי בדרכים שונות באופן אופייני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה למדוד ביטוי של יותר גנים מאשר RNA FISH בעלות נמוכה יותר מ-RNA-Seq בתאים בודדים.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר חקרנו פרוטוקולים למדידת ביטוי גנים בתאים בודדים על ידי qPCR מיקרופלואידי. רצינו לשנות את השיטות הקיימות כדי להעריך בצורה מדויקת יותר את המספר המוחלט של תעתיקים שונים בתאים בודדים. מי שידגים את הליך מיון התאים יהיה וויליאם טלפורד, מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה המשמש את המעבדה שלי.

לאחר יצירה וטיהור של אמפליקונים מגנים מעניינים על פי פרוטוקול הטקסט, שלב 18 מיקרוליטר מכל אמפליקון מטוהר בצינור מיקרוצנטריפוגה בעל קשירה נמוכה של 2.0 מיליליטר, ולאחר מכן הוסף מאגר תרחיף DNA עד 1,800 מיקרוליטר כך שהריכוז של כל אמפליקון יהיה חמש פעמים 10 עד המולקולה השישית למיקרוליטר. מערבל היטב את תקן 5e6 ומחלק אותו ל-20 מיקרוליטר בצינורות PCR בעלי קשירה נמוכה. לאחר ציפוי תאי MCF7 p53-Venus על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף לתאים 400 ננוגרם למיליליטר של ניאוקרזינוסטטין וטפל בהם במשך שלוש, 8.5, 14 או 24 שעות.

כדי ליצור מאגר ליזה, שלב את הריאגנטים המפורטים בטבלה זו. העבר 92.4 מיקרוליטר של המאגר לצינור נפרד כדי לשמש כמאגר הליזיס לתקני האמפליקון. מאגר הליזה שנותר יהיה עבור התאים.

הכן והוסף DNA E.coli למאגר הליזיס עבור התאים, לפי פרוטוקול הטקסט. להכנת תקנים, סמן שישה צינורות צנטריפוגה מחייבים נמוכים. הוסף 90 מיקרוליטר של מאגר תרחיף DNA לצינור 5e5.

הוסף 90 מיקרוליטר של חוצץ המכיל 6.2 פיקוגרם למיקרוליטר של DNA E.coli לכל אחד מחמשת הצינורות האחרים ושמור את כל הצינורות על קרח. לאחר הוצאת תקן 5e6 מהאחסון, מערבל לזמן קצר את הצינור, ואז סובב אותו כדי לוודא שהנוזל נמצא בתחתית הצינור, ואז בעזרת קצה פיפטה מחייב נמוך, הוסף 10 מיקרוליטר של תקן 5e6 לצינור 5e5. מערבולת, סובב והחזיר את הצינור לקרח.

לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר מצינור 5e5 לתוך צינור 5e4, ואז מערבל לזמן קצר את הצינור, סובב אותו והחזיר את הצינור לקרח. חזור על הדילולים הסדרתיים עם כל צינור, וקבל 10 מיקרוליטר מהצינור הקודם עד שלכל הצינורות יש דילול סטנדרטי. לאחר הכנת צינורות PCR עם מאגר ליזה, באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, הפיצו תשעה מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים משורת צינורות ה-PCR לכל באר משבע השורות הראשונות של לוחית PCR.

מחלקים שבעה מיקרוליטרים של מאגר ליזה סטנדרטי לכל באר בשורה האחרונה של הצלחת, ולאחר מכן בעזרת קצות פיפטה מחייבים נמוכים, מוסיפים שני מיקרוליטר סטנדרטיים לכל באר בשורה התחתונה בהתאם למפת הצלחת. הוסף שני מיקרוליטרים של 3.1 פיקוגרם למיקרוליטר של DNA E.coli לבארות של 10 תאים ו-100 תאים, ואז הוסף שני מיקרוליטרים של 6.2 פיקוגרם למיקרוליטר של DNA E.coli לבארות ללא תאים. לאחר תכנות סדרן התאים המופעל פלואורסצנטי למיין לצלחת 96 בארות בהתאם למפת הצלחת, לכוון את המכונה, לאטום צלחת PCR ריקה ולהשתמש בזרם הבדיקה כדי למיין טיפות ו-PBS על אטם הצלחת הריקה.

אם הטיפות אינן נוחתות במיקום הנכון, נגב אותן מעל פני האטם, כייל מחדש את סדרן התאים בהתאם להוראות יצרן המכונה וחזור על הפעולה עד שהטיפות בזרם המיון יופקדו כהלכה. קצרו תאים על ידי טריפסיניזציה והשעו אותם מחדש ב-0.5 מיליליטר PBS עם 2% FBS, ואז העבירו לצינור ציטומטריית זרימה. כדי למיין תאים, הכנס את הצינור עם תרחיף התאים לתוך סדרן התאים, פתח את החותם על צלחת מאגר הליזיס, ומיין בזהירות את התאים המעניינים לתוך הצלחת בהתאם למפת הצלחת.

כדי להבטיח שתאים בודדים ממוינים בטוהר מקסימלי, הפעל את המכונה במצב תא יחיד והשתמש בשער ציטומטריית זרימה סטנדרטי המבוסס על פיזור קדימה וצדדי. לאחר הריצה, השתמש באיטום תרמי סטרילי חדש כדי לאטום את הצלחת ולצנטריפוגה אותה ב-400 פעמים גרם למשך ארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן הנח את הצלחת במחזור התרמי והפעל את תוכנית RT-STA שהוכנה קודם לכן. לאחר סיבוב צלחת ה-RT-STA השלמה, השתמש בפיפטה של 12 תעלות כדי להפיץ 3.6 מיקרוליטר של אקסונוקלאז I מדולל לכל באר של הצלחת.

אטום וסובב בקצרה את הצלחת, ולאחר מכן הנח את הצלחת במחזור התרמי והפעל את תוכנית exo I. כדי למדוד את ביטוי הגנים של משק הבית בכל דגימה, הכינו 900 מיקרוליטר של תערובת מאסטר qPCR של צבע קושר DNA ל-96 תגובות באמצעות פריימרים מאחד הגנים שנבחרו. מחלקים תשעה מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות, ולאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של דגימה מלוח הדגימה לבאר המתאימה של לוחית ה-PCR.

הפעל את הצלחת במכונת PCR בזמן אמת באמצעות פרוטוקול רכיבה תרמית שהוצע על ידי יצרן תערובת המאסטר או לפי פרוטוקול סטנדרטי, ולאחר מכן נתח את הדגימות וצור מפת צלחת תערובות לדוגמה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. סמן תערובות דגימת צלחת ולאחר מכן, באמצעות פיפטה של שמונה ערוצים, הפיץ 3.3 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים לטעינת דגימת תערובת מאסטר לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות. עבור כל לוחית PCR של דגימות, מערבל את הצלחת למשך 10 שניות וסובב אותה ב-500 פעמים גרם למשך 10 שניות.

הסר את המכסה והעבר 2.7 מיקרוליטר מכל דגימת תא חיובית לבאר המתאימה לה בצלחת תערובות הדגימה עבור בארות התא האחד המצוינות במפת הצלחת. קלף את המדבקה מתחתית שבב qPCR מיקרופלואידית חדש, ולאחר מכן השתמש במזרק של נוזל קו בקרה כשהמכסה עדיין דולק, דחף כלפי מטה כל קפיץ מצבר כדי לשחרר אותו והזריק לכל מצבר 100 עד 200 מיקרוליטר של נוזל קו בקרה. הכנס את השבב למכונת הטעינה והפעל את התסריט הראשוני, ולאחר מכן באמצעות פיפטה בעלת שמונה ערוצים, העביר 4.5 מיקרוליטר מכל תערובת בדיקה לצד שמאל של שבב ה-qPCR המיקרופלואידי.

זה קריטי להימנע מיצירת בועות אוויר בתחתית הבארות. זה ייצור בעיות טעינה. כדי למנוע זאת, גע בקצות הפיפטה לצד הבאר, ואז פיפטה רק עד לתחנה הראשונה.

העבר 4.5 מיקרוליטר מכל תערובת דגימה לצד ימין של שבב ה-qPCR המיקרופלואידי, ולאחר מכן הכנס את השבב למכונת הטעינה והפעל את סקריפט תערובת העומס. בסיום סקריפט ערבוב העומס, ודא שאין קווים על פני השבב, מה שיצביע על בעיית טעינה, ולאחר מכן השתמש בסרט כדי להסיר בזהירות חלקיקי אבק מהשבב, ולאחר מכן הכנס את השבב למכונת ה-PCR המיקרופלואידית בזמן אמת והפעל את סקריפט איסוף הנתונים. לבסוף, נתח את הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט.

איור זה מציג את רמות הביטוי של גן משק בית שנמדד על ידי qPCR כדי לקבוע אילו בארות קיבלו תא בודד. לדגימות שקיבלו תא יש ערכי CT נמוכים. לדגימות ללא תא יש ערכי CT גבוהים בהרבה.

הבארות לתקן אמפליקון צריכות להראות עקומות הגברה במרווחים שווים. צריכה להיות גם הפרדה ברורה בעקומות עבור בארות ללא תא, 10 תאים ו-100 תאים. דגימות DNA של זרעים המייצגות תאים אמיתיים נקטפות בדובדבן ממספר צלחות ממוינות של 96 בארות ומשולבות בצלחת אחת כדי להתכונן ל-qPCR מיקרופלואידי.

מפת חום זו מסכמת את תוצאות ה-qPCR המיקרופלואידי. וריאציית הצבע בכל עמודה מראה את השונות בביטוי של כל גן בין תאים שונים. שתי השורות הכהות בהרבה מהשאר מייצגות ככל הנראה דגימות גרועות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על אזור העבודה שלך נקי מ-RNase וללא DNA, במיוחד בעת ביצוע התקנים ומאגר הליזיס. החלקים שלפני ה-PCR של פרוטוקול זה רגישים לזיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת ביטוי של גנים מרובים בעלי עניין בתאים בודדים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו RNA FISH של מולקולה בודדת כדי לאמת מדידות של שפע mRNA בתאים בודדים.