פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להציג טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנס-סקלרלית הניתנת לשחזור כדי להעביר אפיתל פיגמנט רשתית אנושי, או תאי RPE, לחלל התת-רשתית של עיני המכרסם עם סיכון מינימלי לנזק לרשתית. זה מושג על ידי ביצוע חתך קטן בלחמית הטמפורלית האחורית ללימבוס כדי לחשוף את הסקלרה הבסיסית. לאחר מכן, נעשה שימוש במחט אינסולין משופעת בגודל 31 כדי לחדור לקומפלקס ליבת הסקלרה על ידי החדרת המחט 500 מיקרון או כמחצית מהקצה לתוך הרקמה כשהצד המשופע פונה כלפי מעלה ליצירת חור פיילוט.

לאחר מכן, מחט הזרקה משופעת בגודל 33 המחוברת למזרק מונחית לתוך חור הפיילוט ומוכנסת בזווית ובעומק ספציפיים, חור ההזרקה אוטם את עצמו לאחר נסיגת המחט ואין צורך בתפר או בדבק רקמות. רטינופתיה ניוונית מורכבת מספקטרום רחב של מחלות הכוללות סוגים שונים של תאי רשתית. המחלה הנפוצה ביותר ברחבי העולם, ניוון מקולרי הקשור לגיל, או AMD, מתרחשת בקרב קשישים ומובילה לעיוורון קבוע.

השינויים הפתולוגיים המתרחשים ב-AMD כרוכים בניוון ראשוני של תאי אפיתל פיגמנטיים ברשתית, או RPE. אובדן RPE מוביל לתפקוד לקוי של קולטני פלואורואורקטור ברשתית או למוות. הטיפולים התרופתיים הנוכחיים ל-AMD בשלב מוקדם מוגבלים להאטת ההתקדמות או להקלה על התסמינים.

זה יחד עם פוטנציאל התחדשות מוגבל של הרשתית פירושו שאין טיפול יעיל לשיקום הראייה. המכון לתאי גזע עצביים זיהה לאחרונה אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים באוכלוסיית תאי ה-RPE. תאים אלה יכולים לשמש כמקור לטיפול בהחלפת תאי גזע.

כיום המכון שלנו מפעיל מחקרים פרה-קליניים כדי לחקור את היעילות והבטיחות של טיפול בהשתלת תאי גזע RPE במודל חיות חולדה ניווניות RPE. במחקר זה, אנו משתמשים בטכניקת הזרקה טרנס-סקלרלית, תת-רשתית כדי להעביר תאי גזע RPE לעיני החולדה, בין שכבת הרשתית לשכבת ה-RPE. השיטה שלנו היא אמצעי קל ואמין להעברה מוצלחת של תאים לחלל התת-רשתית.

תזדקק לריאגנטים ולציוד הבאים. 1% טרופיקמיד ו-2.5% פנילפרין, המיוצרים טריים מ-10% פנילפרין, על ידי דילול בתמיסת מלח סטרילית של 0.9% ביום הניתוח, משמשים להרחבת האישון. שטיפת עיניים משמשת לשטיפת העין ולשמירה על לחות העין שאינה מנותחת.

נעשה שימוש בחומר סיכה לעיניים כדי לשמור על לחות העין הימנית שלא נותחה במהלך הניתוח. 0.5% פרופרקאין משמש כהרדמה מקומית. נעשה שימוש בחומר סיכה לעיניים על העין השמאלית המנותחת במהלך סריקת ה-OCT.

יש צורך בכמות מינימלית של חומר וציוד לטכניקה זו. מידע מפורט על ציוד וריאגנטים המשמשים בטכניקה זו מתואר בפרוטוקול. מזרק של 10 מיקרוליטר משמש להזרקת תאים.

לפני ההזרקה, אנו מרכיבים תחילה את המזרק ומעקרים אותו באתנול. הכנס מחט משופעת סטרילית בגודל 33 למזרק והברג היטב כדי להרכיב את המזרק. שטפו את המזרק ב-100% אתנול, לאחר מכן 70% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים נטולי יונים, ברצף במשך חמש עד שש פעמים כל אחד.

סמן את מחט המזרק בעט טוש שחור סטרילי במיקום במרחק של 600 מיקרון מקצה המחט. הנח את המזרק על מיקרו מניפולטור לשימוש בהזרקה. תאי RPE אנושיים מוכנים ביום הניתוח ונשמרים בתערובת מי קרח.

משולש בעדינות את מתלה התא והעמיס את המזרק ב-1.2 מיקרוליטר, ה-0.2 מיקרוליטר הנוספים משמשים לפיצוי על זרימה חוזרת של ההזרקה, כדי להבטיח נפח של הזרקת מיקרוליטר אחת. החלף את המזרק המלא בתרחיף התאים במיקרומניפולטור, או בקש מעוזר להחזיק אותו אנכית, מכיוון שתאי RPE נוטים לשקוע בקלות בתמיסות. הכן את אזור הניתוח הסטרילי על ידי הנחת כרית ניתוח סטרילית עם כרית חימום מתחתיה על במת המיקרוסקופ המנתח.

כל ההליכים הנוגעים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מדינת ניו יורק באולבני. שקלו את החיה והרדימו אותה באמצעות מערכת אספקת אדי האיזופלורן כפי שמוצג כאן. העבירו את החולדה לאזור הניתוח לאחר ההרדמה, והניחו אותה בקונוס אף המחובר למערכת האיזופלורן כדי לשמור על הרדמה.

כסו את גוף החולדה בגזה, וצבטו את הבוהן של החולדה כדי לאשר הרדמה מלאה. מרחו טיפת חומר סיכה על עין ימין של החולדה מקמו את החולדה על צד ימין, כאשר עינה השמאלית פונה לתקרה להזרקה, ראשה לכיוון יד ימין של המנתח, והיא חזרה לכיוון המנתח. חתוך את כל השפם שמכסה את העין.

טפטפו כמות קטנה של שטיפת עיניים לצד הטמפורלי של העין השמאלית, ואספו את העודפים בצד האף בעזרת מוליך כותנה כדי לשטוף את העין. הרחב את האישון עם 1% טרופיקמיד, 2.5% פנילפרין, עבור טומוגרפיה קוהרנטית אופטית לאחר ההזרקה, או בדיקת OCT, על ידי מריחת טיפה אחת מכל אחד. יש למרוח טיפה של סבון עיניים כדי לשמור על לחות העין.

מרחו טיפה של פרופרקאין על העין והסירו את העודפים בעזרת מוליך כותנה. עסו בעדינות את העור המקיף את העין ארבע עד שש פעמים כדי לפתוח את העפעף, כך שהעין תצא באופן זמני ומעט מהארובה שלה כדי לאפשר גישה נוחה למחט המזרק. השתמש בכוחות כדי לאחוז בלחמית האחורית ללימבוס, וסובב את העין כדי למצוא מקום טוב יותר לניתוח מבלי לפגוע בשרירי העין.

הרם בעדינות את הלחמית כדי ליצור אוהל, וסובב את העין באף. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את החלק העליון של האוהל, כדי ליצור פתח קטן בלחמית ולחשוף את הסקלרה. לאחר מכן, השתמשו במלקחיים כדי לאחוז בקצה פתח הלחמית ליד הלימבוס, וסובבו את העין באף, כך שציר האישונים יהיה בזווית של כ-30 מעלות ביחס לקרקע.

מחט אינסולין סטרילית משופעת בגודל 31 משמשת לחדירה לקומפלקס ליבת הסקלרה עם שיפוע המצביע כלפי מעלה ומחצית מהקצה, או כ-500 מיקרון המוחדרים לרקמה, כדי ליצור חור פיילוט להזרקה. משוך בזהירות את מחט האינסולין, וניתן לראות תפליט קטן של דם. ניתן למרוח חנית עין כדי לנקות את החור ולעצור את הדימום במידת הצורך.

הנח את מחט המזרק הטעונה בתאי RPE לתוך חור הפיילוט בזווית של כ-10 עד 15 מעלות ביחס למשטח המקומי של הסקלרה כדי להגיע לחלל התת-רשתית על ידי החדרת המחט באורך של 500 מיקרון לחלוטין לתוך הרקמה והשארת מרחק של 100 מיקרו בין הנקודה על המחט המכוסה על ידי הרקמה לבין נקודת הסמן השחור על המחט. אמור לעוזר ללחוץ על הבוכנה של המזרק, כדי להזריק את נפח התאים המתאים. החזק את המזרק במקומו למשך 25 עד 30 שניות לאחר ההזרקה, ולאחר מכן משוך לאט את המזרק.

חור ההזרקה נאטם אוטומטית, ובדרך כלל נצפית כמות קטנה של כ-0.2 מיקרוליטר של זרימה חוזרת. יש לשטוף את מקום ההזרקה בשטיפת עיניים סטרילית שלוש פעמים, ולאסוף את העודפים בעזרת מוליך כותנה. יש למרוח טיפת חומר סיכה על העין המנותחת, ולהעביר את החולדה לתחנת OCT, כדי לבחון את מיקום התאים המושתלים, ואת גודל הגלם התת-רשתית.

החזירו את החולדה לכלוב ההתאוששות מתחת למנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה לאחר סיום ה-OCT. התבוננו בחולדה כדי לוודא שהיא יוצאת מההרדמה, ועקבו מדי יום אחר סימני מצוקה. הודע לווטרינר מיד אם יש חששות.

באמצעות הטכניקה שלנו, העברנו באופן עקבי ומוצלח תאי RPE אנושיים לחלל התת-רשתית. מיד לאחר ההשתלה ביצענו בדיקת OCT כדי לבחון את מקום ההזרקה ואת הכתם התת-רשתית שנוצר על ידי התאים המושתלים. זה משמש ככלי סינון טוב להערכת איכות הזריקות ומידת הנזק לרשתית, או דימום.

ניתן היה לראות השתקפות אור בהירה סביב מקום ההזרקה וכתם תת-רשתית מלא בתרחיף התא תחת סריקת ה-OCT. אין דימום, דליפת נוזל בין-עיני או היפרדות רשתית, הנראים סביב מקום ההזרקה או החלל התוך-זגוגי בהזרקה מוצלחת, מה שמדגים את הטראומה המינימלית הנגרמת מההזרקה. עיני החולדה המנותחות עברו גרעין, קובעו ונחתכו לניתוח אימונוהיסטולוגי שבעה ימים לאחר ההשתלה.

הסמן הגרעיני האנושי, Hunu, וסמן התא RPE, OTX2, שימשו לזיהוי התאים המושתלים. ציון חיובי של שני הסמנים הראה שתאי RPE אנושיים מושתלים היו ממוקמים בחלל התת-רשתית של עיני החולדה. טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנס-סקלרלית זו היא פשוטה וקלה ללמידה.

זה גורם פחות טראומה לניתוח ומשאיר את הרשתית שלמה על ידי העברת מחט ההזרקה דרך השכבות החיצוניות של דופן העין, מבלי לשבור את הרשתית העצבית. הטיפות המכומתות למחט הפיילוט ומחט ההזרקה להיכנס לרקמה והזווית המשמשת במהלך ההזרקה מאפשרות העברת תאים באופן אמין לחלל התת-רשתית עם דיוק ואחוזי הצלחה גבוהים בהרבה. בשיטת הזרקה זו, העברנו באופן עקבי ומוצלח תאי RPE אנושיים שמקורם בתאי גזע RPE לחלל התת-רשתית של חולדות RCS.

הליך זה יכול לחזור בקלות על ידי כל מי שצופה בסרטון.