Name: פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: למד טכניקת הזרקה תת-רשתיתית טרנס-סקלרלית לשתלת תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושיים בעיני מכרסמים. שיטה זו מספקת מסירה מדויקת של תאים עם סיכון מינימלי לנזק רשתיתי והתאמה עצמית ללא צורך בתפרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להודות לפטי לדרמן על הסיוע על הניתוח, סוזן בורדן להכנה תאי RPE. אנו גם להכיר NYSTEM C028504 לצורך מימון לפרויקט זה. ג'סטין ד מילר נתמך על-ידי NIH הענק F32EY025931.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)-המדינה באוניברסיטת ניו יורק באולבני.
1. הזרקת טרום הכנה
<ol><li>
הכנת השעיה תא hRPESC-RPE הערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בתרביות רקמה סטרילי הוד, היכרות עם סטרילי טכניקה בסיסית נדרשת.<ol>
<li>בידוד תאי hRPE העיקרי של האדם תורם העיניים בגילאי 50-90 שנים ותאים תרבות. ובכן 24 צלחות12. Cryopreserve התאים-מעבר 1, הפשרה לפי הצורך ותרבות המעבר 2 תאים (P2) למשך 4-5 שבועות (איור 1 א') להזרקה.</li>
		<li>להסיר את תרבות בינוני12 , ואז בעדינות וולס יש לשטוף פעמיים עם 500 µL מראש 1 X של Dulbecco פוספט Buffered מלוחים ללא סידן & מגנזיום (1 x DPBS-CMF) על-ידי הוספת 1 X DPBS-CMF לתוך בארות באמצעות פיפטה 1,000 µL והסרה של אותו באמצעות ואקום.</li>
		<li>להוסיף טריפסין µL 300/DNAse מכל קידוח. דגירה תאים hRPESC-RPE טריפסין/DNAse (4 kU DNase לכל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA) במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם התאים.</li>
		<li>בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם הם יש המעוגל כלפי מעלה. להמשיך דגירה התאים טריפסין/DNase למשך 2 דקות נוספות, אם הם לא יש מעוגל למעלה עדיין.</li>
		<li>לאחר התאים מעוגלים, להשתמש פיפטה 1,000 µL triturate התאים מנותקת מן הבאר ולהעביר את טריפסין/DNase המכיל תאים מנותקת לתוך צינור חרוטי 15-mL עם שווה נפח בינוני תרבות ומחוממת מראש, כדי להשבית את טריפסין/DNase.</li>
		<li>לשטוף את וולס עם מראש ומחוממת 1 X DPBS-CMF מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה, במיוחד מסביב לקצוות של הבאר; לאחר מכן להוסיף תאים אלה הצינור חרוט הקודם.</li>
		<li>Centrifuge צינור חרוטי ב 286 g x דקות 5-4 ° C עד הצניפה התאים.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים בינונית 1 מ"ל-תרבות.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
		<li>צנטריפוגה-286 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה התאים.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend תאים ב סטרילי מאוזנת מלח פתרון (BSS) ב- 50,000 תאים/µL (להעביר 50,000 תאים בנפח µL 1 במהלך ההזרקה subretinal).</li>
		<li>העברת התליה תא הסופי (CS) לתוך צינור 1.7-mL microcentrifuge זכור כי תערובת קרח-מים עד שימוש בהזרקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מזרק תא
	<ol>
<li>מכניס מחט סטרילית של משופע 33-מד הזרקת מזרק, בורג בחוזקה כדי להרכיב את מזרק.</li>
		<li>לרוקן את מזרק עם אתנול 100% 5 - 6 פעמים.</li>
		<li>לרוקן את מזרק עם אתנול 70% 5 - 6 פעמים.</li>
		<li>לרוקן את מזרק עם BSS 5 - 6 פעמים.</li>
		<li>סמן את המחט מזרק עם עט סטרילי הסמן השחור במיקום של מיקרומטר 600 מן קצה המחט תחת המיקרוסקופ ויבתר (איור 1B).</li>
		<li>מניחים את מזרק על micromanipulator להזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הזרקת subretinal
<ol><li>
האזור הכירורגי והכנת בעלי חיים
	<ol>
<li>שוקל חולדה RCS שבוע 4-5 (60-100 גרם), עזים ומתנגד זה באמצעות מערכת משלוח של אדי איזופלוריין. הערה: כדי לגרום הרדמה לשמור על קצב הזרימה איזופלוריין ב-5%. לאשר את העומק של הרדמה על ידי לחיצה על הכפות ולאחר מכן להקטין את קצב הזרימה ל 2-3% לתחזוקה הרדמה במהלך הניתוח.</li>
		<li>במקום תלוי ניתוח סטרילי, עם כרית חימום מתחת, על הבמה של המיקרוסקופ ויבתר כדי להגדיר את אזור כירורגי סטרילי.</li>
		<li>להעביר את העכברוש האזור הכירורגי ולמקם את החולדה בגביע האף מחובר למערכת איזופלוריין לשמור על הרדמה.</li>
		<li>לכסות את הגופה של החולדה עם גזה. קמצוץ הבוהן של החולדה כדי לאשר הרדמה מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הזרקת subretinal טרנס-scleral תחת המיקרוסקופ
	<ol>
<li>יש לטפטף לעין טיפת למרוח את העין unoperated של החולדה.</li>
		<li>מקם את החולדה על הצד השמאלי שלו בעין השמאלית שלו מול התקרה עבור הזרקה, ראשו לכיוון היד הימנית של המנתח, גבו לכיוון המנתח.</li>
		<li>חתוך כל שפם לכסות את העין עם מספריים קטנות.</li>
		<li>לטפטף כמות קטנה של שטיפת עיניים מהצד הטמפורלי של העין השמאלית ולאסוף את עודף בצד האף עם המוליך כותנה לשטוף את העין.</li>
		<li>אני התלמיד עם 1% tropicamide ו- 2.5% phenylephrine (טרי מתוצרת מ 10% phenylephrine לדלל אותה ב- saline 0.9% סטרילי ביום של הניתוח) עבור בדיקת OCT שלאחר הזרקת על-ידי החלת טיפה אחת...</li>
		<li>משוך בעדינות את העור סביב העין 4 - 6 פעמים כדי לפתוח העפעף כך העין היא מעט proptosed לצורך גישה קלה יותר באזורים האחוריים לימבוס.</li>
		<li>החל טיפה של שטיפת עיניים, לשמור על לחות העין.</li>
		<li>בעדינות triturate CS (להכין בשלב 1.1.12) ולטעון את מזרק עם 1.2 µL CS. µL 0.2 נוסף משמש כדי לפצות על הזרקת זרם אחורי. הערה: בהתבסס על המידות שלנו, על 5000-8000 תאים אבודים בתוך זרם אחורי עם זריקה של 50,000 תאים/µL השווה לכ-10-16% של איבוד תאים, תוספת של 0.2 µL CS הוזרק לפיצוי על אובדן תא זה.</li>
		<li>מקם את מזרק מלא עם CS-micromanipulator (או עוזר להחזיק את זה) אנכית בתור RPE התאים נוטים לשקוע בקלות ההשעיה.</li>
		<li>החל ירידה של 0.5% proparacaine (מקומיים הרדמה מקומית) על העין, להסיר את עודף עם המוליך כותנה. הערה: שלב זה צריך לדכא את רפלקס המצמוץ ולמנוע לעין למצמץ במהלך והשלבים.</li>
		<li>להשתמש מלקחיים כדי לאחוז לחמית האחורי לימבוס, לסובב את העין אפילו, והרם לחמית לעשות "אוהל".</li>
		<li>להשתמש במספריים לחתוך את החלק העליון של "האוהל" לעשות חור קטן בלחמית ולחשוף את sclera הבסיסית.</li>
		<li>להשתמש מלקחיים כדי לאחוז בקצה של השוליים לחמית הנותרים לצד לימבוס וסובב לעין אפילו כך שהציר האישון הוא בזווית של 30 מעלות ביחס השולחן (איור 1C). המשך מרתק השוליים לחמית נדרש לספק כוח נגד במהלך המחט הוספות וכדי לשמור על העין בזווית אופטימלית.</li>
		<li>לעשות חור פיילוט להזרקה תא, מיקום סוף מחט סטרילית משופע אינסולין 31-מד ב 1200-1500 מיקרומטר האחורי לימבוס עם פתיחתו של קצה פונה כלפי מעלה.</li>
		<li>להתאים את הזווית של המחט אינסולין כך. זה 10-15 מעלות מעל sclera (וצורניים עד מטוס דמיוני באתר הזרקת המיועד). אט-אט לחדור המתחם בסקלרה-choroid המחט לעומק של-500 מיקרומטר. בחולדה פיגמנט, בקצה המחט "ייעלמו" מתחת דמית פיגמנט. עבור המותג של אינסולין מחט בשימוש כאן, המרחק בין קצה המחט אל שפוע הוא 500 מיקרומטר.</li>
		<li>תיסוג בקפידה את המחט אינסולין (תפליט קטן מאוד של דם, ניתן לראות).</li>
		<li>אם דימום יתר הוא ציין, ניתן להחיל על חנית העין כדי לנקות את החור, במידת הצורך. דימום מתמשך לאחר היישום חנית מציין כלי קיבול נפגמה.</li>
		<li>מדריך מחט מזרק שנטענו תא RPE לתוך החור פיילוט, עם פתיחת פונה למטה, בזווית של כ- 10-15 מעלות ביחס השטח המקומי של sclera.</li>
		<li>הכנס בעדינות את המחט מזרק לתוך החור פיילוט עד לעומק של-500 מיקרומטר, כדי לגשת אל החלל subretinal. צריך להיות על שוליים 100 מיקרומטר בין הקצה של הסימן עט שחור לנקודה בה המחט מכוסה על ידי דמית פיגמנט (איור 1C וד' 1).</li>
		<li>לשאול את העוזרת בעדינות את הבוכנה של המזרק מזרק להחדיר את אמצעי האחסון המתאים של תאים (בערך 1.2 µL). תהיו מוכנים לספק כוח כלשהו נגד כעוזר לוחץ על הבוכנה. הערה: תרגול מעושה מוקדמת עם המסייע יכול לספק של המנתח וגם עוזר עם ניסיון הכרחי עם שלב זה.</li>
		<li>תוך התמקדות באופן חזותי העט מארק קצה, להחזיק את מזרק במקום עבור 25-30 s, ואז לאט לאט. משכי את מזרק. כמות קטנה של זרם אחורי בדרך כלל נצפית. הערה: אם אין זרם אחורי נצפית, אולי היו זריקה intravitreal. אם אתה רואה זרם אחורי דרך חותם או תאים מילוי מתחת בסקלרה, הזרקת היה רדוד מדי.</li>
		<li>לשטוף את בזרימת תא מן האתר הזרקת לשטוף את העין סטרילית 3 פעמים ולאסוף את העודפים עם המוליך כותנה.</li>
		<li>להחיל יש לטפטף לעין טיפת על העין המופעלים ולהעביר את החולדה לתחנת OCT כדי לבחון את המיקום של התאים המושתלים ואת גודל bleb subretinal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הזרקת שלאחר הטיפול
<ol><li>
אנטי דלקתיות וטיפול משכך כאבים
	<ol>
<li>להזריק הבופרנורפין-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף בתוך תמיסת מלח subcutaneously להפחתת הכאב.</li>
		<li>להזריק דקסמתזון ב 1.6 מ"ג/ק"ג משקל גוף בתוך תמיסת מלח בזריקה בקרום הבטן (I.P.) עבור פקד דלקת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
שחזור בעלי חיים
	<ol>
<li>להחזיר את החולדה לכלוב. שחזור תחת מנורת חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף.</li>
		<li>להתבונן העין המופעלים סימנים של דימום.</li>
		<li>להתבונן העכברוש כדי להבטיח שמגיע מההרדמה.</li>
		<li>לחזור החיה התאושש כלוב טריים בדגל את הכלוב עם כרטיס ניתוח ו לפקח מדי יום על סימנים של מצוקה, דימום עינית או אטימות הקרנית. הודע הוטרינר באופן מיידי אם יש חששות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>De Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ambati, J., Fowler, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794258">Mechanisms of agerelated macular degeneration.</a> Neuron. 75, 26-39 (2012).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and retinal repair.</a> Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cells+Grown+into+Polarized+RPE+Monolayers+on+a+Polyester+Matrix+Are+Maintained+after+Grafting+into+Rabbit+Subretinal+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+retinal+pigment+epithelial+stem+cell-derived+RPE+monolayers+exhibit+key+physiological+characteristics+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
<li>Davis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cell-Derived+RPE+Preserves+Photoreceptors+in+the+Royal+College+of+Surgeons+Rat%3A+Method+for+Quantifying+the+Area+of+Photoreceptor+Sparing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+Subretinal+Injections+in+Rodents+to+Deliver+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+in+Suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension.</a> J Vis Exp. (95), e52247(2015).</li>
<li>Lopez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+Retinal+Pigment+Epithelium+Modifies+the+Retinal+Degeneration+in+the+RCS+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+Transplantation+of+MACS+Purified+Photoreceptor+Precursor+Cells+into+the+Adult+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Common+Anesthetics+on+Eye+Movement+and+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram.</a> Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).</li>
<li>McGill, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+central+nervous+system+stem+cells+-+neuroprotection+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration.</a> Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).</li>
<li>Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+retinal+pigment+epithelium+cells+are+retained+in+the+cell+cycle+and+proliferate+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo.</a> Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).</li>
<li>Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+ARPE-19+and+Schwann+Cells+to+the+Subretinal+Space+in+RCS+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).</li>
<li>Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+corneal+opacities+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Induced corneal opacities in the rat.</a> Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

טכניקת הזרקת subretinal המתואר במאמר זה היא באמצעות מסלול טרנס-scleral, שבו מחט מזרק חודר השכבות החיצוניות (sclera-שכבה דמית-RPE קומפלקס) של הקיר העין ללא פגיעה עצבית ברשתית או מטריד את חלל בזגוגית. גישה טרנס-vitreal חלופי יש סיכון פוטנציאלי של העדשה נזק המוביל קטרקט, מאז עדשה של מכרסמים שוכן הרוב של חלל בזגוגית. בהשוואה לשיטה זו, הטכניקה שלנו פחות מסוכן וגורם טראומה מינימלית כמו מחט מזרק אינו צריך לחצות כל חלל בזגוגית להגיע לשטח subretinal. אכן, OCT בדיקות במחקרים שלנו הראה אירועים חדירה רשתית נדירים מאוד ויש, בבחינות ל...

הרשתית האנושית ממוקם בירכתי הפונקציות העין כמו רקמה חושית אור, משחק תפקיד קריטי בתפיסה חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית או מוות של תאים ולכן גורם בעיות ראייה או עיוורון תמידי. הפרעות ניוון או תפקוד לקוי של התאים בשכבות השונות של הרשתית ידועים כמו מחלות רשתית ניווניות, ביניהם AMD הוא הסוג הנפוץ ביותר הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך אצל הקשישים במדינות המפותחות 1,2. תהליך פתולוגי של AMD מזוהה עם הצטברות "drusen" בין השכבה RPE הקרום של ברוך הבסיסית, אשר בתורו פוגע RPE תמיכה של פיזיולוגיה קולט אור, המוביל ניוון רשתית עצבי הראייה הפסד3, 4,5. עד כה, אין שום תרופה לקבלת מתקדם יבש AMD (שאינם neovascular). הופעתה של טיפול בתאי גזע כמו פרדיגמה חדשה ב רפואה רגנרטיבית מביא את התקווה של החלפת תאי RPE לקוי או מת עם תאי גזע-derived תאים בריאים. ואכן, מחקרים מקיפים פרה של משתילים גזע תאים (למשל, תאי גזע עובריים אנושיים)-תאי RPE נגזר לתוך מודלים RPE-ניוונית היית בביצוע6,7, אשר חלקם התקדמו אל ניסויים קליניים8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). לאחרונה, מקור חלופי של תאי גזע תושב בשכבה RPE האנושי, תאי הגזע האנושי RPE (hRPESCs), זוהה על ידי המעבדה שלנו ומשמש כיום במחקרים פרה של טיפול השתלת תאים (hRPESC-RPE) נגזר-RPE hRPESC ל- AMD 10 , 11 , 12 , 13.
טכניקת הזרקת subretinal מוחל במחקרים פרה שהוזכרו לעיל על ידי קבוצות מרובות, כולל הקבוצה שלנו. ישנן שתי גישות כלליות להזרקה subretinal בבעלי חיים: טרנס-vitreal, טרנס-scleral. הגישה הטרנס-vitreal יש את היתרון של המנתח היכולת לצפות ישירות בקצה המחט כפי שזה חודר העין הקדמי, חוצה את החלל כולו vitreal סמוכים על העדשה, חודר הרשתית מאחור את העין כדי להגיע את subretinal מקום14,15,16. עם זאת, זה דורש שיבוש הרשתית בשני מיקומים (anterior ואת אחורי), נושאת את הסיכון של פגיעה העדשה והיא יכולה לגרום בתוך זרם אחורי של תאים לתוך הזגוגיות כאשר המחט "ניתק". לעומת זאת, הגישה הטרנס-בסקלרה, בעקרון, מונע מעורבות של הרשתית, הזגוגיות, ויוצא זרם אחורי העין. בחולדות פיגמנט, המנתח יכול לצפות בתחילה חדירה בסקלרה, אבל לאחר המעבר לתוך דמית פיגמנט, בקצה המחט אינה גלויה. ללא התבוננות ישירה, פורצים הרשתית נפוץ, עלול לגרום הקרע ברשתית ואספקה של תאים ו/או דם לתוך הזגוגיות. יתר על כן, כי השטח העין עקום, זה מאוד קשה לדעת איזה זוויות המחט ועומקי יעילים ביותר לזריקות טרנס-scleral.
במאמר זה דמיינו, אנחנו מציגים את שיטת הזרקת subretinal טרנס-scleral הודיע על ידי שימוש הערכות לאחר ניתוח עם אופטי טומוגרפיה קוהרנטיות (אוקטובר), אשר מאפשר בדיקה מקיפה של ההזרקה. הטכניקה שלנו הזרקה טרנס-scleral מנצל במיקומים מוגדרים, זוויות, בעומק של מחטים הזרקת לייצר טראומה כירורגי נמוך מאוד, אמינות גבוהה. כאן, במיוחד נדגים ההזרקה של תאי hRPESC-RPE לחלל subretinal של העכברוש RCS, דגם פרה-קליניים של AMD אנושי. בשיטה זו זריקה, בהצלחה ובעקביות נמסר לנו תאים hRPESC-RPE לחלל subretinal RCS עיניו חולדה עם שיעור הצלחה גבוה מאוד. הזרקה של תאי נמצאה בעבר את התוצאה שימור RCS photoreceptors לפחות 2 חודשים לאחר הזרקת13. הליך זה מבוצע תחת המיקרוסקופ ויבתר והוא קל ללמוד. זה דורש שני אנשים (מנתח ועוזר) כדי לבצע את הזריקה, הזמן הממוצע של הזרקת עבור כל בעל חיים הוא פחות מ-5 דקות. זוויות מוגדר ועומקי מחטים הזרקת מאפשרים עבור מעבדות, איפה OCT אינה זמינה להשיג הזרקת subretinal מוצלח. הוא מאפשר גישה subretinal מאוד לשחזור, יכול לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור טיפולים תרופתיים משלוח וג'ין.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן & מגנזיום (1xDPBS-CMF)</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח סטרילית מאוזנת (BSS)</td><td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>שטיפת עיניים סטרילית</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>סטרילית 0.9% תמיסת מלח</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)</td><td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת עיניים טרופיקמיד, USP (1%)</td><td>באוש & Lomb</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) מלאי</td><td>Bausch & Lomb</td><td>42702010305</td><td>זה משמש לייצור 2.5% פנילפרין</td></tr><tr><td>בופרנקס</td><td>פטרסון</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>615090040</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל</td> <td>עיניים סטרילי GenTealנוברטיס</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>טיפות עיניים סטריליות Systane Ultra Lubricant</td><td>Alcon</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>תאי hRPESC-RPE</td><td>לא זמין מסחרית</td><td></td><td>אנא עיין ב"הפניה #12" לבידוד ותחזוקה של תאים.</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>צינורות חרוטיים Corning</td><td>3526</td><td></td></tr> (<tr><td>15 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מיקרוצנטריפוגה עם טבעת</td><td>O LPS inc</td><td>L233126 צינורות</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה ללא מכסה (1.7 מ"ל)</td><td>LPS inc</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>מגבון אלכוהול סטרילי</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים סטריליים של קצה כותנה</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי Weck-Cel חניתות</td><td>Beaver-Visitec International&nbsp;</td><td></td><td></td>0008680</tr><tr><td>וילונות כירורגיים סטריליים&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>גזה</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>מזרק ננופיל (10 ul)</td> <td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>ננופיל</td><td></td></tr><tr><td>ננופיל משופע 33 מד מחט</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מזרק אינסולין 31 מד</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם שיניים חולדה</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים מיקרו חיתוך</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>משאבת T מים במחזור&nbsp;</td><td>Stryker</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה לבעלי חיים</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td>Ohaus</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מקור אור</td><td>Schott</td><td>ACE series</td><td></td></tr><tr><td>Bioptigen Envisu תחום ספקטרלי מערכת הדמיה</td> עיניים <td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>עט טוש שחור סטרילי</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>סולם מדידה מיניאטורי</td><td>Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>מנורת ספוט אינפרא אדום&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>משמשת כמנורת חימום לבעלי חיים בשלב ההחלמה שלאחר הניתוח</td></tr></tbody></table>

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

מחלות רשתית ניווניות כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) הן הגורם המוביל של אובדן ראייה בלתי הפיך ברחבי העולם. AMD מאופיין על ידי ניוון תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, אשר הם טפט של תאים פונקציונלית ותמיכה אנטומית לעטוף עצביים ברשתית. טיפולי תרופתי הנוכחי AMD שאינו neovascular (AMD יבש) רק להאט את התקדמות המחלה, אך לא ניתן לשחזר את החזון, המחייב מחקרים שמטרתם זיהוי אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. החלפת תאי RPE ניוונית עם תאים בריאים מביאות הבטחה להתייחס AMD יבש בעתיד. מחקרים מקיפים פרה של תאי גזע החלפת טיפולים ל- AMD לערב את השתלת תאי RPE נגזר תאי גזע לתוך מרחב subretinal של דגמים בעלי חיים, שבו מוחל על טכניקת ההזרקה subretinal. הגישה תכוף במחקרים אלה בעלי חיים פרה היא דרך המסלול טרנס-scleral, אשר נעשית קשה על ידי חוסר של פריט חזותי ישיר של הסוף מחט יכול לעיתים קרובות לגרום נזקים ברשתית. גישה חלופית דרך הזגוגיות מאפשר התבוננות ישירה של העמדה קצה המחט, אבל זה סיכון גבוה של טראומות כירורגיים כמו רקמות העין יותר נגרמת הפרעה. פיתחנו פחות מסוכן לשחזור ששונה הזרקה טרנס-scleral שיטה המשתמשת המחט מוגדר זוויות ועומקי בהצלחה ובעקביות לספק תאי RPE לחלל subretinal חולדה, למנוע פגיעה ברשתית מוגזמת. תאים מועברים באופן זה הוכחו בעבר בתמימותה בחולדה המלכותי המנתחים (RCS) לפחות 2 חודשים. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור משלוח של מולקולות קטנות או בטיפולים גנטיים.

שימוש בטכניקה המתוארת במאמר זה, אנחנו בעקביות נמסר hRPESC-RPE תאים לחלל subretinal של חולדות RCS על ידי שליטה בדיוק את מיקום, זווית ועומק של החדרת מחט מזרק לתוך הרקמה (איור 1B-D ). מיד בוצעה ההשתלה הבאים, בדיקת OCT להתבונן ההזרקה, את bleb subretinal שנוצרו על-ידי התאים המושתלים. לאחר ניתוח ההערכה OCT משמש ככלי מיון להערכת האיכות של זריקות ומעקב ברשתית או דימום. שניהם bleb subretinal (איור 2 א, C ו- <stro...

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

המטרה הכללית של סרטון זה היא להציג טכניקה שמישה לביצוע הזרקה תת-רשתית דרך הלובדון (trans-scleral) להחדרת תאי אפיתל של הרשתית האנושית, או תאי RPE, אל החלל התת-רשתי בעיני מכרסמים, תוך מזעור הסיכון לנזק לרשתית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חתך קטן בלחמית הרקה (temporal conjunctiva) posterior ללימבו כדי לחשוף את הלובדון שמתחתיה. לאחר מכן, נעשה שימוש במחט אינסולין במידה 31 עם חוד אלכסוני כדי לחדור את מכלול הליבה של הלובדון, על ידי החדרת המחט לעומק 500 מיקרון או כחצי מאורכה של הקצה אל תוך הרקמה, כאשר הצד האלכסוני פונה כלפי מעלה כדי ליצור חור מקדמי.בשלב הבא, מחט הזרקה בשיפוע (beveled) במידה 33, המחוברת למזרק, מודרכת אל תוך חור הפיילוט ומוחדרת בזווית ובעומק ספציפיים; חור ההזרקה נסגר באופן עצמי לאחר נסיגת המחט, ואין צורך בתפר או בדבק רקמות. רטינופתיות דגנרטיביות מורכבות מקשת רחבה של מחלות המערבות סוגים שונים של תאי רשתית. המחלה השכיחה ביותר בעולם, ניוון מקולרי תלוי גיל, או AMD, מופיעה בקרב קשישים ומובילה לעיוורון קבוע.השינויים הפתולוגיים המתרחשים ב-AMD כוללים דגנרציה ראשונית של תאי אפיתל הפיגמנט של הרשתית, או RPE. אובדן ה-RPE מוביל לתפקוד לקוי או למותם של הפוטורספטורים ברשתית. הטיפולים הפרמקולוגיים הנוכחיים לשלבי AMD מוקדמים מוגבלים להאטה של התקדמות המחלה או להקלה על התסמינים.עובדה זו, יחד עם פוטנציאל התחדשות מוגבל של הרשתית, פירושה שאין טיפול יעיל להשבת הראייה. מכון תאי הגזע העצביים (Neural Stem Cell Institute) זיהה לאחרונה אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים בתוך אוכלוסיית תאי ה-RPE. תאים אלו יכולים לשמש כמקור לטיפול בתחליפי תאי גזע.נכון לעת זו, המכון שלנו מקיים מחקרים פרה-קליניים כדי לבחון את היעילות והבטיחות של טיפול בהשתלת תאי גזע של RPE במודל חולדה עם ניוון RPE. במחקר זה, אנו משתמשים בטכניקת הזרקה תת-רשתית דרך הסקלרה כדי להחדיר תאי גזע של RPE לעיני החולדה, בין שכבת הרשתית לשכבת ה-RPE. השיטה שלנו מהווה אמצעי פשוט ואמין להחדרה מוצלחת של תאים לחלל התת-רשתי.יהיו דרושים לך התסמינים והציוד הבאים. Tropicamide 1% ו-Phenylephrine 2.5%, שהוכנו טריים מ-Phenylephrine 10% על ידי דילול במי מלח סטריליים 0.9% ביום הניתוח, משמשים להרחבת האישון. תמיסת שטיפת עיניים משמשת לשטיפת העין ולשמירה על לחות העין שאינה מנותחת.חומר סיכה לעין משמש לשמירה על לחות העין הימנית שאינה מנותחת במהלך הניתוח. 0.5% proparacaine משמש כחומר אלחוש מקומי. חומר סיכה לעין משמש בעין שמאל המנותחת במהלך סריקת ה-OCT.דרושה כמות מינימלית של חומרים וציוד עבור טכניקה זו. מידע מפורט על הציוד והריאגנטים שנעשה בהם שימוש בטכניקה זו מפורט בפרוטוקול. להזרקת התאים נעשה שימוש במזרק של 10 µL.לפני ההזרקה, נרכיב תחילה את המזרק ונעקר אותו בעזרת אתנול. נחדיר מחט בעלת חוד אלכסוני במידה 33-gauge למזרק ונהדק אותה היטב להרכבת המזרק. נשטוף את המזרק עם אתנול 100%, לאחר מכן עם אתנול 70%, ולאחר מכן עם מים מזוקקים דה-יוניים, באופן רצופי, חמש עד שש פעמים לכל חומר.סמנו את מחט המזרק בעזרת טוש שחור סטרילי במיקום של 600 microns מקצה המחט. הניחו את המזרק על מיקרו-מניפולטור לביצוע ההזרקה. תאי RPE אנושיים מוכנים ביום הניתוח ונשמרים בתערובת של קרח ומים.בצעו הומוגניזציה עדינה (trituration) של תרחיף התאים ומלאו את המזרק ב-1.2 µL; ה-0.2 µL הנוספים משמשים לפיצוי על נסיגה של הנוזל בעת ההזרקה, כדי להבטיח נפח הזרקה של 1 µL. החזירו את המזרק המלא בתרחיף התאים אל המיקרו-מניפולטור, או בקשו מעוזר להחזיקו בצורה אנכית, מכיוון שתאי RPE נוטים לשקוע בקלות בתמיסות. הכינו את אזור הניתוח הסטרילי על ידי הנחת רפידת ניתוח סטרילית עם פלטת חימום תחתיה על משטח העבודה של מיקרוסקופ הדיסקציה.כל ההליכים הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ובשימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטה הממלכתית של ניו יורק באלבני. שקלו את בעל החיים והרדימו אותו באמצעות מערכת להגשת אדי איזופלורן כפי שמוצג כאן. העבירו את החולדה לאזור הניתוח לאחר שהורדמה, והניחו אותה במסיכת אף המחוברת למערכת האיזופלורן כדי לשמר את ההרדמה.כסו את גוף החולדה בגזה, וצבטו את בהו הניצב של החולדה כדי לאשר הרדמה מלאה. מרחו טיפה של חומר סיכוך לעין במיקום העין הימנית של החולדה, הניחו את החולדה על צדה הימני, כאשר העין השמאלית פונה לתקרה לצורך ההזרקה, ראשה לכיוון ידו הימנית של המנתח וגבה לכיוון המנתח. גזרו את השערות (whiskers) המכסות את העין.טפטפו כמות קטנה של תמיסת שטיפה לעין בצד הרקתי של העין השמאלית, ואספו את השאריות בצד הנחיר באמצעות מקלוני צמר גפן כדי לשטוף את העין. הרחיבו את האישון באמצעות 1%tropicamide ו-2.5%phenylephrine, לצורך בדיקת טומוגרפיה קוארהנטית של הרשתית (OCT) לאחר ההזרקה, על ידי החדרת טיפה אחת מכל תמיסה. מרחקו טיפה של תמיסת שטיפה כדי לשמור על לחות העין.יש להניח טיפה של Proparacain על העין ולהסיר את העודפים באמצעות מקלוני צמר גפן. יש לעסות בעדינות את העור שסביב העין ארבע עד שש פעמים כדי לפתוח את העפעף, כך שהעין תבלוט באופן זמני וקל מהמ Orbita כדי לאפשר גישה נוחה למחט המזרק. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את הלבדה (conjunctiva) מאחורי הלימבוס, וסובבו את העין כדי למצוא נקודה טובה יותר לניתוח מבלי לפגוע בשרירי העין.הרימו בעדינות את הלחמית כדי ליצור "אוהל", וסובבו את העין לכיוון האף (נזאלית). לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לחתוך את קודקוודה של ה"אוהל", במטרה ליצור פתח קטן בלחמית ולחשוף את הלובן (סקלרה). בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את קצה הפתח בלחמית סמוך ללימבוס, וסובבו את העין לכיוון האף, כך שציר האישון יהיה בזווית של כ-30 מעלות ביחס לקרקע.מחט אינסולין סטרילית בכיסוי אלכסוני (bevel) בקוטר 31-gauge משמשת לחדירה למכלול הליבה של הלובן (sclera core complex), כאשר הצד האלכסוני פונה כלפי מעלה ומחצית מהחוד, כ-500 microns, נכנסת לרקמה, כדי ליצור חור חלוץ להזרקה. יש לשלוף בזהירות את מחט האינסולין, וייתכן שייראה נזילה קלה של דם. ניתן להשתמש ב-eye spear כדי לנקות את החור ולהפסיק את הדימום במידת הצורך.הנחו את מחט המזרק הטעונה בתאי RPE אל תוך חור הפיילוט בזווית של כ-10 עד 15 מעלות ביחס לפני השטח המקומי של הסקלרה כדי להגיע לחלל הסוב-רטינלי, על ידי החדרת המחט לעומק של 500 microns באופן מלא אל תוך הרקמה, תוך השארת מרחק של 100 micro בין הנקודה על המחט המכוסה על ידי הרקמה לבין נקודת סימון הטוש השחור על המחט. הנחו את העוזר ללחוץ על בוכנת המזרק כדי להזריק את נפח התאים המתאים. החזיקו את המזרק במקומו במשך 25 עד 30 שניות לאחר ההזרקה, ולאחר מכן הוציאו את המזרק באיטיות.חור ההזרקה נסגר באופן אוטומטי, ובדרך כלל נצפה נזילה קלה של כ-0.2 µL חזרה. שטפו את נקודת ההזרקה בתמיסת שטיפת עיניים סטרילית שלוש פעמים, ואספו את העודפים בעזרת מקלון צמר. מרחו טיפה של חומר סיכוך על העין המטופלת, והעבירו את החולדה לתחנת ה-OCT, כדי לבחון את מיקום התאים המשתבנים ואת גודלו של השלפוחית (bleb) הסוב-רטינלית.החזירו את החולדה לכלוב ההתאוששות תחת מנורת חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה לאחר סיום ה-OCT. עקבו אחר החולדה כדי לוודא שהיא מתעוררת מההרדמה, ובדקו אותה מדי יום לאיתור סימני מצוקה. הודיעו לווטרינר באופן מיידי אם עולות חששות כלשהם.באמצעות הטכניקה שלנו, הובאנו באופן עקבי ומוצלח תאי RPE אנושיים לחלל התת-רשתית. מיד לאחר השתלה, ביצענו בדיקת OCT כדי לצפות באתר ההזרקה ובשלפוחית התת-רשתית שנוצרה על ידי התאים שהושתלו. בדיקה זו משמשת ככלי סינון יעיל להערכת איכות ההזרקות ומידת הנזק לרשתית או הדימום.ניתן היה לראות בסריקת OCT השתקפות של אור בהיר סביב אתר ההזרקה ושלפוחית סוב-רטינלית (subretinal bleb) מלאה בתרחיף התאים. בהזרקה מוצלחת, לא נצפו דימומים, דליפת נוזלים בין-עינית או התנתקות רשתית סביב אתר ההזרקה או בחלל הוויטראלי, דבר המעיד על הטראומה המינימלית שנגרמה מההזרקה. עיני החולדות המנותחות הוצאו (nucleated), קובעו ונחתכו לצורך אנליזה אימונוהיסטולוגית שבעה ימים לאחר השתלה.הסמן הגרעיני האנושי, Hunu, והסמן לתאי RPE, OTX2, שימשו לזיהוי התאים המושתלים. צביעה חיובית של שני הסמנים הראתה כי תאי ה-RPE האנושיים המושתלים היו ממוקמים בחלל התת-רשתית של עיני החולדה. טכניקה זו של הזרקה תת-רשתית דרך הלובן היא פשוטה וקלה ללמידה.שיטה זו גורמת לפחות טראומה כירורגית ומשאירה את הרשתית שלמה על ידי העברת מחט ההזרקה דרך השכבות החיצוניות של דופן העין, מבלי לפגוע ברשתית העצבית. כמות הטיפות המדויקת עבור מחט הפיילוט ומחט ההזרקה לצורך החדירה לרקמה, והזווית שבה נעשתה ההזרקה, מאפשרות הזרקה אמינה של תאים לחלל התת-רשתי בדיוק גבוה ובשיעור הצלחה גבוה בהרבה. באמצעות שיטת הזרקה זו, הזרקנו באופן עקבי ומוצלח תאי RPE המופקים מתאי גזע של RPE אנושיים אל החלל התת-רשתי של חולדות RCS.ניתן לחזור על פרוצדורה זו בקלות על ידי כל מי שצופה בסרטון.

development-refined-protocol-for-trans-scleral-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) אסטרטגיות החלפה וטיפול מבוססי גנים נחשבים במשך כמה תנאים ניווניות ברשתית. לתרגום קליני, במודלים של בעלי חי עין גדולים נדרשים ללמוד טכניקות ניתוחיות בחולים ישימות. כאן אנו מציגים מודל ארנב לניתוח subretinal המיועד השתלת רשתית, אשר היא תכליתי וחסכוני.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

השתלה תת-רשתית של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) היא אחת הגישות המבטיחות ביותר לטיפול במחלות רשתית ניווניות. עם זאת, הביצועים של מחקרים פרה-קליניים על מודלים של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות נותרו מאתגרים. דו"ח זה מציג הנחיות להשתלה תת-רשתית של RPE על נשא תאים במיני-חזירים.

השתלה תת-רשתית של RPE על נשא במיני-חזירים: הנחיות להכנות טרום ניתוחיות, טכניקות כירורגיות וטיפול לאחר ניתוח

פרוטוקול זה מציג גישה טרנס-סקלרלית מונחית ראייה טרנס-אישונים להעברה בטוחה ומדויקת של שתלים תאיים תת-רשתית, עם שיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים, במושתלי עכבר עם או בלי ניוון רשתית.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

למד טכניקת הזרקה תת-רשתיתית טרנס-סקלרלית לשתלת תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושיים בעיני מכרסמים. שיטה זו מספקת מסירה מדויקת של תאים עם סיכון מינימלי לנזק רשתיתי והתאמה עצמית ללא צורך בתפרים.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

גלה סרטונים נוספים