צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

המטרה הכוללת של צבירת תאים מגנטיים זו ושיטת התבגרות דינמית היא לשפר את הכונדרוגנזה במבחנה של תאי סטרומה מזנכימליים או MSC. צבירה מגנטית של תאי גזע במקום כונדרוגנזה כעיבוי תאים היא שלב מפתח מוקדם בתהליך התחדשות הסחוס. לאחר שתאי הגזע מוגבלים לפיגומים, ניתן להעביר את הפיגומים לביו-ריאקטור תאי כדי להעריך את ההתבגרות הדינמית של התאים.

ניתן ליישם שיטת דינמיקה חשובה על מערכות ביולוגיות אחרות כגון תיקון שרירים, לב או כלי דם. אבל כפי שתראה, זה מתאים מאוד להתחדשות הסחוס. הדגמה חזותית של זריעת התאים המגנטיים והבשלת התא הדינמית באמצעות הביוריאקטור בפועל הם קריטיים מכיוון שקשה ללמוד את שתי הטכניקות הללו מהוראת טקסט בלבד.

כדי לבנות את מכשיר המיקרומגנט להיווצרות אגרגטים, הכנס תחילה קצה מגנטי בקוטר 750 מיקרומטר לכל חור של שלושה סנטימטרים בצלחת אלומיניום בעובי שישה מילימטרים, והנח את הצלחת מעל מגנט ניאודימיום קבוע. כדי לבנות מכשיר לזריעת פיגומים יש לחתוך תחילה פוליסטירן קשה לריבועים של 2.4 סנטימטר רבוע ולהכניס מגנטים בקוטר שלושה מילימטרים, באורך שישה מילימטר במרחק שווה על פני משטח של 1.6 סנטימטר מרובע. לאחר מכן הנח את המכשיר על מגנט ניאודימיום קבוע.

כדי לסמן MSC אנושי, תרבית תחילה את תאי הגזע במדיום גידול MSC שלם ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני עד שהם מתכנסים ל-90%. שאפו ולאחר מכן שטפו את התאים בסרום שלושה מדיום RPMI ללא גלוטמין, והוסיפו 10 מיליליטר תמיסת ננו חלקיקים של תחמוצת ברזל לכל בקבוק תרבית של 150 סנטימטר מרובע לדגירה של 30 דקות בחממת תרבית התאים. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים במשך חמש דקות בסרום שלושה מדיום RPMI ללא גלוטמין כדי להפנים את חלקיקי הננו שעדיין מחוברים לקרום הפלזמה.

לאחר מכן החלף את ה-RPMI בכל בקבוק ב-25 מיליליטר של מדיום גידול MSC שלם והחזיר את התאים לחממת תרבית התאים למשך הלילה. למחרת בבוקר, נתק את התאים המגנטיים עם שמונה מיליליטר של 05% טריפסין-EDTA לכל בקבוק. ולאסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה.

אנו משעים את הכדורים לספירה ומניחים צלחת פטרי של תרבית תאים 35 מילימטר על גבי כל מכשיר מגנטי. כדי ליצור את האגרגטים באופן מגנטי, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום כונדרוגני לכל צלחת פטרי והפקיד בעדינות לא יותר משמונה מיקרוליטרים של 2.5 כפול 10 לתאים המסומנים 5 לכל אגרגט. זה קריטי שהתאים לא יופקדו לאט מדי ולא מהר מדי.

ולא קרוב מדי ולא רחוק מדי מהמגנטיות. כאשר כל האגרגטים הונחו אפשר לספרואידים להיווצר במשך 20-30 דקות ללא הפרעה. לאחר מכן העבירו את האגרגטים לחממת תרבית התאים.

באותו יום, צרו אגרגטים על ידי צנטריפוגה של 2.5 פעמים 10 עד 5 תאי גזע מסומנים בצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר עם 1.5 מיליליטר של מדיום כונדרוגני. כדי לזרוע מגנטית את הפיגומים מניחים פיגום נקבובי פוליסכריד פולולן / דקסטרן מיובש אחד לכל צלחת פטרי ומדללים 2 פעמים 10 עד התאים המסומנים ב-350 מיקרוליטר של מדיום כונדרוגני ללא TGFbeta3. פיפטה בזהירות את התאים על הפיגומים ודגירה על המבנים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר חדירה מלאה של התאים.

לאחר חמש דקות הוסיפו בעדינות שלושה מיליליטר של מדיום כונדרוגני לצלחת הפטרי והחזירו את הפיגומים לחממת תרבית התאים למשך ארבעה ימים כדי לאפשר לתאים לנדוד דרך נקבוביות הפיגום. באותו יום, זרעו גם קבוצה נוספת של פיגומים עם תאי גזע מסומנים פעמיים כפול 10 עד 6 כפי שהודגם ודגרו על התאים ללא המגנט כדי לקבל פיגומים עם זרעים אחידים כבקרות חיוביות. לצורך כונדרוגנזה לפיגומים ביום החמישי, הסר את המכשיר המגנטי מכל הפיגומים והחזיר את הפיגומים הסטטיים לחממת תרבית התאים עד ליום 25, והחלפת המדיום פעמיים בשבוע.

לתרבית תאים דינמית גם ביום החמישי חתכו צינורות סיליקון לאורך המתאים על פי הוראות היצרן וקצב הצינורות, תא התרבות של 500 מיליליטר המסובבים הדו-כיווניים והכלובים לתחנת בטיחות מיקרוביולוגית סטרילית. בהתאם להוראות היצרן, חבר את הצינור למסובבים הדו-כיווניים בתא התרבות. לאחר מכן השתמש במרית סטרילית כדי להעביר בזהירות שני פיגומים סלולריים לכל כלוב.

לאחר העברת כל הפיגומים, הכנס את הכלובים דרך המחטים במכסה כדי למנוע מהם לנוע במהלך הסיבוב. וממלאים את תא התרבות במדיום כונדרוגני. השתמש בטכניקת חיטוי סטרילית בעת הכנת התאים כדי למנוע זיהום של כל אחד מהכלים או הפיגומים.

לאחר מכן, הכנס את הכלובים לתא ולאחר מכן סגור את החדר והפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי למלא את הצינור במדיום כונדרוגני ולחסל בועות אוויר. הנח ואבטח את התא המלא בתוך המנוע של הביוריאקטור והפעל את המחשב השולט בסיבובי הזרוע והחדר. לאחר מכן הפעל מהירות סיבוב של חמישה סיבובים לדקה הן על הזרוע והן על החדר, והתאם את המשאבה הפריסטלטית לקצב זרימה של 10 סיבובים לדקה להזנה רציפה של הפיגומים הסלולריים.

כדי ליצור מבנה אגרגט תלת מימדי נטול פיגומים ביום השמיני, התחל את ההיתוך על ידי הצבת שני אגרגטים במגע בתווך כונדרוגני לשמונה דובלטים. לאחר מכן, ביום ה-11, ממזגים שני דובלטים ליצירת ארבעה רביעיות, ויוצרים את המבנה הסופי ביום ה-15 על ידי מיזוג ארבעת הרביעיות. רקמות שנוצרו על ידי היתוך מגנטי מדגימות עלייה משמעותית בביטוי קולגן II בהשוואה לכדורים המתקבלים על ידי צנטריפוגה.

עם מגמה מוגברת של ביטוי אגרגנטי. עבור פיגומים סטטיים תאיים ועלייה בביטויי אגרגנט וקולגן II נצפים כאשר משתמשים בזריעה מגנטית, בהשוואה לפיגום שנזרע ללא כוחות מגנטיים. מעניין שהביטוי של קולגן II גבוה בהרבה כאשר זריעה מגנטית משולבת עם התמיינות דינמית.

ניתוח היסטולוגי באמצעות כחול טולואידין מגלה כי היתוך מגנטי רציף של 16 אגרגטים מציג תצהיר שפע של גלוקוזאמין גליקנים. יתר על כן, בפיגומים עם זרעים מגנטיים, תכולת הגלוקוזאמין גליקן גבוהה יותר כאשר הפיגומים מובחנים בביו-ריאקטור מאשר כאשר הם מתורבתים באופן סטטי. לאחר השליטה ניתן להשלים את צבירת התאים המגנטיים תוך שעתיים אם מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להשעות מחדש את התאים המסומנים בנפח קטן ככל האפשר כדי להקל על היווצרות הצבירה. לאחר הזריעה המגנטית של הפיגומים ניתן לבצע את ההתבגרות הדינמית באמצעות הביוריאקטור בפועל כדי לשפר את ביטוי הכונדרוציטים המסונתזים החדשים. מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור את התחדשות הסחוס המפרקי בבני אדם.

לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד לבנות מכשירים מגנטיים, לתייג תאי גזע היוצרים אגרגטים של תאי גזע, לזרוע פיגומים מגנטיים ולהשתמש בביו-ריאקטור אמיתי. אל תשכח שעבודה עם תאים ורקמות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, מעילי מעבדה ומשקפי מגן.