בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד תאי סטרומה מזנכימליים מארבעה מקורות רקמה נפרדים סביב הלידה, רירית חבל הטבור, ג'לי וורטון, צומת השליה החבל והשליה העוברית. שיטה זו יכולה לסייע בקידום תחום הביולוגיה של תאי הגזע, הרפואה האלטרנטיבית על ידי השגת תאי גזע מזנכימליים באיכות מיוחדת, באופן לא פולשני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מניבה באופן פרודוקטיבי מספר רב של אוכלוסיות תאים הומוגניות באיכות גבוהה ממקורות רקמה מובהקים סביב הלידה.

ניתן להשתמש בתאי סטרומה מזנכימליים רב-עוצמתיים שמקורם בטכניקה זו לטיפול במחלות והפרעות שונות מכיוון שהם פרימיטיביים יותר מתאי גזע מזנכימליים המבודדים מרקמות בוגרות. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המאפיינים של תאי סטרומה מזנכימליים ממקטעים שונים ונישות ספציפיות של חבל הטבור והשליה. התחל בהנחת הדגימה בצלחת פטרי 150 מילימטר על קרח בארון בטיחות ביולוגי והשתמש במחט ובמזרק כדי לשטוף את הטישו מספר פעמים עם PBS קר כקרח.

לאחר הסרת כל קרישי הדם, בדוק היטב את הדגימה כדי לזהות את האזורים האנטומיים השונים. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הקצה העוברי של חבל הטבור והשתמש במספריים כדי לבצע בזהירות חתך בחלק העליון של צומת חבל הטבור-שליה. בצע חתך שני מתחת לצומת כדי להפריד בין צומת השליה לשליה.

ופיצלו את הרקמות המופרדות לצלחות פטרי בודדות. לאחר מכן, חתכו את חבל הטבור לאורך כדי לחשוף לחלוטין את כלי הדם ואת הג'לי של וורטון שמסביב מבלי להפריע לאפיתל. השתמש באזמל כדי לגרד את הג'לי של וורטון הרחק מכלי הדם והאינטראפיתל של תת-השפיר.

לאחר מכן, הסר את כלי הדם, העביר את כל הג'לי הפרי-וסקולרי שנותר מתחת ומסביב לכלי הדם לתוך צלחת הג'לי של וורטון והנח את רקמת רירית החבל הנותרת בצלחת משלו. לאחר שכל הרקמות נותחו, החליפו את ה-PBS בכל צלחת בשלושה עד חמישה מיליליטר טריפסין והשתמשו במספריים כדי לחתוך כל דגימת רקמה לחתיכות של מילימטר עד שניים למשך 30 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להתבונן בעיכול החלקי על ידי הדמיית שחרור תאים מהרקמה.

בתום תקופת העיכול החלקית, יש לנטרל את הטריפסין בנפח שווה של מדיום תרבית ולהעביר את הדגימות לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר. הניחו לחתיכות הטישו להתייצב במשך שלוש דקות. לאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט וצלחו 15 עד 20 חתיכות רקמה מעוכלות חלקית לדגימה לתוך צלוחיות תרבית רקמה בודדות בגודל 75 סנטימטרים רבועים.

לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של מדיום תרבית לדגירה של יומיים-שלושה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. החלף את מדיום התרבית לאחר שלושה ימים ובדוק את ה-xplants במיקרוסקופ ניגודיות פאזה לצמיחת תאים. כאשר צמיחת התאים מגיעה למפגש של 70 אחוזים, נתקו את התאים במיליליטר אחד עד שניים של תמיסת טריפסין לכל בקבוק, סובבו את הבקבוק לציפוי אחיד עם תמיסת האנזים ודגרו על התרביות למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

ואז לנטרל את התגובה עם מיליליטר עד שניים של מדיום תרבות. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעיה מחדש של הגלולה במדיום תרבית לתת-תרבות בצפיפות זריעה של עשרה עד ארבעה תאים לסנטימטר בריבוע. התאים מרירית חבל הטבור ותרביות הג'לי של וורטון מציגים ערכי יעילות של 59 ו-80 מושבות בהתאמה.

עם זאת, ערך היעילות של יצירת המושבה של תאי צומת השליה דומה לזה שנצפה עבור תאי גזע מזנכימליים של מח עצם, מה שמצביע על כך שלתאים שמקורם בצומת שליה חבל הטבור יש יכולות שגשוג וחידוש עצמי גבוהות יותר. צד זרימה: ניתוח מטרי של תרחיפי התאים הבודדים שבודדו מרקמות סביב הלידה הללו מצביע על כך שאחוזי התאים החיוביים לסמני תאי גזע מזנכימליים ספציפיים מכל ארבעת מקורות הרקמה דומים לאלה המתבטאים בתאים מזנכימליים סטנדרטיים שמקורם במח עצם. עם זאת, יחסי עוצמת הקמח החציוניים מצביעים על כך שהתאים שמקורם בג'לי וורטון ובצומת השליה החבל דומים מאוד או גבוהים יותר מרירית חבל הטבור בתאים שמקורם בשליה עוברית.

מעניין לציין שלמרות ערכי היעילות המשתנים של יצירת המושבה שלהם, כל התאים מהמקורות השונים מבטאים רמות דומות של סמני פלוריפוטנטיות על ידי ניתוח RTPCR כמותי למעט תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בצומת חבל הטבור-שליה, שביטאו את רמות הביטוי הגבוהות ביותר עבור כל סמני הפלוריפוטנטיות שנבדקו. יתר על כן, תאי סטרומה מזנכימליים המבודדים מכל המקורות הסביב הלידה מתמיינים בקלות לסוגי תאים אדיפוגניים, כונדרוגניים ואוסטאוגניים, כמו גם מדגימים התמיינות משולשת. למרות שפוטנציאל ההתמיינות משתנה בהתאם למקור תאי הסטרומה המזנכימליים.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת ביעילות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לתרגל טכניקה רוחבית ולהימנע מזיהום צולב בין מקורות הרקמה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את טבען של נישות תאי גזע ברקמות סביב הלידה.