שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה על ידי שחול הידראולי וכן לזהות ולבודד גרעיני שורש גב בעכברים וחולדות. זה מושג על ידי המתת חסד של המכרסם, ולאחר מכן עריפת ראש. העור נחתך לאורך עמוד השדרה ומופרד מהרקמה הבסיסית.

לאחר מכן, עמוד השדרה מופרד מהרקמה שמסביב על ידי חיתוך לאורך שני צידי עמוד השדרה בכיוון דיסטלי מעבר לעצם האגן. ואז עמוד השדרה נחתך דיסטלי לעצם האגן. מזרק עם קצה פיפטה מותאם מוחדר בקצה הדיסטלי ביותר של חוט השדרה.

על ידי הפעלת לחץ קבוע, חוט השדרה מוחלץ לתוך צלחת פטרי על קרח באמצעות PBS סטרילי קר כקרח. בעזרת מספריים קפיציים, עמוד השדרה מפוצל לאורך. לאחר מכן, אתרי ההתקשרות של הקוסטה הדיסטלית ביותר ממוקמים.

זה מאפשר לזהות את ה-DRGs הדיסטליים ביותר של בית החזה בכל צד המסומנים T13. כעת ניתן לזהות DRGs עוקבים. ה- DRGs המתאימים להגדלת המותניים בעמוד השדרה ממוקמים דיסטלית.

בעזרת מספריים קפיציים, שורשי הגב והגחון נחתכים וה-DRGs נשלפים בעדינות מהחלל ומועברים לצלחות פטרי מסומנות המכילות PBS סטרילי על קרח. שחול הידראולי של חוט השדרה הוא שיטה מהירה משמעותית מאשר כריתת למינקטומיה מסורתית שבה חוליות עמוד השדרה נשברות אחת בכל פעם. שיטה זו מפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות הנגרם מתהליך הדיסקציה ומניבה רקמה המתאימה למגוון רחב של ניתוחים.

גנגליוני שורש גב עשויים להיות בדרך כלל קשים לזיהוי. עם זאת, זיהוי נכון חשוב ביותר לניתוח נוסף של הרקמה למשל לאחר פגיעה בעצב הסיאטי. אז על ידי מספור גנגליוני השורש הגבי לפי הלוקליזציה ביחס לקוסטה, ניתן לזהות באופן עקבי גנגליוני שורש גב.

הכן מזרק לשחול חוט השדרה על ידי חיתוך הקצה הגדול של קצה פיפטה לא מסונן. הקצה יתאים היטב כאשר הוא מותאם כראוי. שאפו PBS סטרילי קר כקרח והשאירו את המזרק על קרח עד לשימוש נוסף.

עבור מכרסמים בוגרים, המתת חסד עם גז כגון CO2 או איזופלורן ולאחר מכן עריפת ראש. אל תבצע פריקת צוואר הרחם מכיוון שהדבר יפריע לחוליית עמוד השדרה ויהפוך את שחול חוט השדרה לבלתי אפשרי. ניתן להמית גורים על ידי עריפת ראש ישירה.

מפזרים מים על הפרווה כדי לשלוט בשיער. לאחר מכן, חתוך את הפרווה לאורך עמוד השדרה בכיוון דיסטלי. בודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משני הצדדים לאורך עמוד השדרה מעבר לעצם האגן וחתוך את עמוד השדרה הפרוקסימלי לאגן.

חתוך את עמוד השדרה כדי להימנע מהאזורים הפרוקסימליים והדיסטליים ביותר מכיוון שאלו עלולים להפוך את עמוד השדרה לצורת S מדי לשחול מוצלח של חוט השדרה. ודא שחוט השדרה נראה בשני הקצוות. אם חוט השדרה אינו נראה, חתוך את עמוד השדרה עד שחוט השדרה נראה לעין.

מניחים צלחת פטרי המכילה PBS על קרח. יישר את עמוד השדרה על ידי הנחת האצבע המורה על החלק הכפוף בקצה הפרוקסימלי של עמוד השדרה. הכנס את קצה הפיפטה בקצה הדיסטלי של חוט השדרה.

הפעל לחץ יציב והוציא את חוט השדרה לתוך צלחת הפטרי. חותכים את עמוד השדרה. חותכים כמה חוליות בצד הגחון של העמוד ואז מעבירים כדי לחתוך כמה חוליות בצד הגב.

המשיכו לצדדים לסירוגין לאורך עמוד השדרה. הנח את חוט השדרה הפתוח מתחת למיקרוסקופ. זהה את מקטע החוליה T13 על ידי איתור אתר ההתקשרות של הקוסטה הדיסטלית ביותר בעמוד השדרה.

היזהר לא לבלבל את הקוסטה הדיסטלית ביותר עם העצבים הבין-צלעיים הסמוכים. הקוסטה הדיסטלית ביותר מחוברת לחלק הפרוקסימלי של מקטע החוליה T13 וה-T13 DRGs ממוקמים דיסטלית לחוליה T13 וקרוב לחוליה L1. זהה DRGs נלווים בכיוון הדיסטלי. הכינו צלחות פטרי ממוספרות המכילות PBS סטרילי קר כקרח על קרח.

כדי למנוע נזק ל-DRG במהלך ההסרה, תפוס את שורשי הגב והגחון ולא את ה-DRG עצמו עם זוג של 5 פינצטה. בעזרת מספריים מיקרו, חתכו תחילה את העצב ההיקפי, ואחריו את שורשי הגב והגחון. אצל גורים, עצבים אלה אינם נראים בבירור כמו אצל מכרסמים בוגרים.

על מנת לחתוך את העצבים קרוב ככל האפשר ל-DRG, הניחו בעדינות לקצה המספריים להחליק לאורך ה-DRG כדי למקם את קצה המספריים לפני ביצוע החיתוך. בעזרת קצה הפינצטה הסגורה, הוציאו בעדינות את ה-DRG והעבירו אותם לצלחת הפטרי המתאימה. בחולדות בוגרות ובעכברים בוגרים, ה-DRGs לבנים עם שורשי גב וגחון נראים בבירור, בעוד שאצל גורים ה-DRGs נראים ככדורים שקופים.

לצורך כתמים מערביים, בודדו את הרקמה המעניינת והניחו את הרקמה במאגר ליזה. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה, צנטריפוגה, איסוף הסופרנטנט וביצוע כתמים מערביים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לניתוח RNA, בודד את הרקמה המעניינת והנח מיד את הרקמה בתמיסת ייצוב RNA.

לאחר מכן, בצע qPCR על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאימונוהיסטוכימיה על רקמה קפואה, הכינו אבקת קרח יבשה על פיסת נייר כסף. הניחו את הטישו על אבקת קרח יבשה כדי לאפשר לה לקפוא בנקישה.

לאחר מכן העבירו את הרקמה לקריוסטט והטמיעו את הרקמה לחיתוך. לאחר קיבוע הרקמה ב-4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר וביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור אימונוהיסטוכימיה על קריוהיסטוכימיה, קבע את הרקמה ב-4% PFA בארבע מעלות והעביר את הרקמה ל-25% משקל לנפח סוכרוז בן לילה בארבע מעלות.

מניחים את הרקמה בחומר הטבעה ומקפיאים את הרקמה באמצעות 2-מתילבוטן מקורר. פורסים את הרקמה בקריוסטט ומבצעים צביעה אימונוהיסטוכימית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור אימונוהיסטוכימיה על קטעי פרפין, קבע את הרקמה ב-4% PFA בארבע מעלות והעביר את הרקמה ל-25% משקל לנפח סוכרוז בן לילה בארבע מעלות.

הטמיעו את הרקמה בפרפין, חתכו את הרקמה על מיקרוטום ובצעו צביעה אימונוהיסטוכימית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בהתאם לנוגדנים המשמשים לצביעה אימונוהיסטוכימית, כל אחת משיטות הטיפול ברקמות המודגמות עשויות להימצא ישימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את חוט השדרה על ידי שחול הידראולי וכיצד לזהות ולבודד את גרעיני השורש הגבי בצורה עקבית.

השיטות המוצגות כאן ישימות לעכברים וחולדות בכל הגילאים, וניתן להשתמש ברקמה המבודדת למגוון רחב של ניתוחים, כולל שיטות הדורשות בידוד מהיר של רקמה לא מקובעת.