Name: שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד שיטת שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד גרעיני שורש הגבה במכרסמים. שיטה זו מהירה יותר מטכניקות מסורתיות ומפחיתה נזק לרקמות עבור מחקר נוירוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לדיוויד קיל, אוניברסיטת ארהוס, על הצילום והעריכה. תוכנת VirtualDub שימשה לעיבוד רצפי וידאו במיקרוסקופ. אנו מודים למכון המחקר הדני למדעי המוח התרגומיים - DANDRITE, לשותפות EMBL הנורדית, על הגישה לציוד, ולקרן המחקר של אוניברסיטת ארהוס, לפרויקט 7FP של האיחוד האירופי PAINCAGE, ל-Det Frie Forskningsrad (DFF) ולקרן לונדבק על המימון.

כל החיות טופלו תוך ציות מלא לתקנות דניות ואירופאיות. רשות מספר: 2012-15-2934. 1. הכנת המזרק הידראולי שהחול של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חולדה בוגרת, להשתמש מזרק 10 מ&quot;ל. עבור עכבר מבוגר, להשתמש במזרק 5 מ&quot;ל. עבור גורים, להשתמש במזרק מ&quot;ל 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קצה פיפטה הלא פילטר מתאים אוניברסלית עבור 2-200 טפטפות μL ידי זמירה סוף גדול של קצה פיפטה עד שהוא משתלב היטב את המזרק. הנח את קצה פיפטה המתואם על המזרק. עבור גורים, השתמש 23 G או מחט דומה במקום קצה פיפטה מתואם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב קר כקרח סטרילי PBS ולהשאיר את המזרק על הקרח עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. המתת חסד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תבצע נקע בצוואר הרחם, כמו זה יהיה להפריע את חוליות עמוד השדרה טיוח שחול בלתי אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברוש / עכבר בוגר, להרדים באמצעות גז כגון CO 2 או isofluRANE. חומרים אלו הם מזיקים. בצע המתת חסד במנדף ולטפל החומרים על פי הנחיות המוסד. (זהירות: CO 2: H280, P410, P403; isoflurane: H361d, P260, P281, P280) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח כי המכרסם מת, להבטיח היעדר רפלקס ידי צובט כפה עם פינצטה. לערוף את המכרסם באמצעות מספריים גדולים. עבור גורים, להרדים על ידי עריפת ראש. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של עמוד השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזרי מים על הפרווה לשלוט השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים, לחתוך את הפרווה לאורך עמוד השדרה לכיוון דיסטלי ולבודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משני הצדדים לאורך עמוד השדרה בעבר עצם האגן. חותכים את חוט השדרה distally עד העצם האגן עם זוג מספריים. הערה: הציר מקורי, הזנב הוא כונה כציר הפרוקסימלי-דיסטלי ברחבי הפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את עמוד השדרה בעזרת זוג מספריים כדי למנוע את proximal-רוב ואזורים דיסטלי ביותר מכיוון שהן עשויות להפוך את עמוד השדרה מדי בצורת האות S לשחול חוט השדרה מוצלח. ודא כי חוט השדרה גלוי בשני קצותיו. אם חוט השדרה אינו גלוי, חתוך את עמוד השדרה במספריים עד חוט השדרה הופך לגלוי. </li></ol></li></ol> 4. שחול הידראולי של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) מלא PBS סטרילית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את עמוד השדרה על ידי יישום אצבע מצד המכופף (הקצה הפרוקסימלי ביותר) של עמוד השדרה, ובכך ליישר את עמוד השדרה ככל האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גורים, למנוע כיפוף עמוד השדרה, כמו החוליות תיפגענה טיוח שחול חוט שדרה בלתי אפשרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה פיפטה (23 G מחט עבור גורים, לחילופין 18 G מחט עבור עכברים בוגרים) בקצה הדיסטלי ביותר של עמוד השדרה. אם מוכנס כראוי, הקצה הוא התייצב בחלל השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי עמוד השדרה הוא יישר ככל האפשר. החל לחץ יציב, ו extrude חוט השדרה לתוך צלחת פטרי על קרח. ודא כי חוט השדרה נשמר לחות על קרח על ידי שמירה על אותה ב PBS עד לטיפולה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> איור 1: מיתרי השדרה נציג. הידראולית הנמתח מיתרי השדרה. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר. גדלות מותנהיות בסימן תיבה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> זיהוי 5. של שורש הגבה גרעינים (DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול עמוד השדרה בשני חלקים אורכים שווים באמצעות מספריים ולמקם את עמוד שדרת הפיצול תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פלח חולית T13 ידי<html> איתור באתר המצורף של costae דיסטלי ביותר על שם לב עמוד השדרה לא לבלבל את costae עם עצבי צלע הסמוכים. Costae דיסטלי ביותר מחוברים החלק הפרוקסימלי של קטע T13 חוליה ואת T13 DRG ממוקם distally כדי T13 החוליה proximally לחוליה L1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה DRGs במקביל לכיוון דיסטלי. עבור חולדה בוגרת, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור עכבר מבוגר, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור גורים, DRGs במקביל מופיע בתחומים ברורים. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> איור 2: זיהוי של DRGs בעמוד השדרה לאחר שחול של חוט השדרה. עמוד השדרה פוצל המאפשר הדמיה של DRGs כפי שצוין על ידי חיצים. שהודגם גור חולדה ועכבר מבוגרים.<html> נ&quot;צ = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בידוד 6. DRGs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות מספר פטרי (30 מ&quot;מ קוטר) על פי DRGs הספציפי להיות מבודדות, למשל L3, L4, L5. מלא את צלחות פטרי עם PBS סטרילי קר כקרח ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מיקרו, הגבי לחתוך ושורשים הגחון קרוב DRGs ככל האפשר כדי לשחרר אותם תוך הימנעות מפגיעה DRGs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקצה של פינצטה הסגור, בעדינות לגרוף את DRGs ולהעבירם צלחות פטר ממוספרים המקבילות. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> איור 3: נציג מבודד DRGs. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. עיבוד 7. של רקמות לצורך ניתוח נוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה. במידת הצורך, להפריד את חוט השדרה לתוך צדדי ipsilateral ו נגדיים ויותר לתוך הגבי וקרנות גחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת חיץ תמוגה כגון חיץ תמוגה TNE (10 מ&quot;מ טריס-בסיס, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 ב O כפול מזוקקים H 2) המכיל מעכבי האנזים המתאים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמת כ 30 שניות על הקרח באמצעות העלי שחיקה מכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 16,000 ב 4 ° C ולהשתמש supernatant לעיבוד נוסף על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 5, 6 או לשמור את supernatant ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA-אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הרקמה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקום הרקמה בתמיסה ייצוב RNA כדי לייצב את RNA לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת RNA ל cDNA ולבצע qPCR פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רקמה טרי קפוא (תחולה על חוט השדרה): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אבקת קרח יבש על ידי כתישת קוביות קרח יבשות עד לסכום המתאים שתי כפות של אבקה. מכסה קוביות קרח יבשות עטופים בבד לכתוש את הקוביות באמצעות פטיש. מניחים נייר כסף (כ 5 ס&quot;מ x 5 ס&quot;מ) על שכבה של קוביות קרח יבש ולכסות את בנייר כסף עם אבקת קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חוט השדרה באזור שנבחר עבור ניתוחים נוספים על אבקת קרח יבש באמצעות פינצטה, ולתת לו snap-הקפאה, ולהעביר את חוט השדרה לצינור קריו. שמור את זה על קרח יבש בכל עת או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לקדם אותנודואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חוט השדרה על cryostat (-20 ° C). במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה בתוך cryostat. מניחים את חוט השדרה בהטמעת החומר בתוך cryostat כדי לצרף אותו לדיסק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר, ולאסוף על צלחות זכוכית. מחמם את לוחות הזכוכית באצבע ערב לאוסף רקמה מצורפת טוב יותר. שמור את כל רקמת שאריות צינורות קריו ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הסעיפים על צלחות זכוכית בתוך cryostat עד מוכן תיאום פוסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את הסעיפים על ידי טבילה לתוך 4% PFA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות קבועות עבור חתך קריו (תחולה על חוט שדרה ו DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) ב4 ° C (חוט שדרה במקום במצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה כדי לפצות את ההרחבה המותני רק על לוח סיליקון או דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש הקצה של מגבת נייר, לשאוב תמיסת סוכרוז עודפת מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים חצי עובש קריו עם הטבעת חומר. לדחוף את כל בועות לצדדים של עובש קריו עם כלים כגון פינצטה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה על חומר ההטבעה באמצעות פינצטה ולהבטיח את הכיוון לרקמה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את תבנית קריו לחלוטין עם הטבעת חומר ולדחוף כל בועות הכי רחוק מן הרקמה ככל האפשר (למשל באמצעות פינצטה סגור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת פטרי (100 מ&quot;מקוטר) עם 2-methylbutane. חומר זה מזיק. בצע פעולה זו במנדף ולטפל החומר על פי הנחיות המוסד (זהירות: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי על שכבה של קרח יבש ולהוסיף שתי קוביות קרח יבש כדי בצלחת פטרי. מניחים את התבנית קריו בצלחת פטרי לאפשר את החומר הטבעה להקפיא לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הרקמות המוטבעות על קרח יבש בכל העת או ב -80 ° C עטופים Parafilm עד לעיבוד נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה על cryostat (-20 ° C) בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות קבועות עבור הטבעת פרפין (תחולה על חוט שדרה ו DRGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) בשעה 4 ° C (חוט השדרה מקוםבמצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא חצי עובש הטבעה עם פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנן את בקצרה עובש ההטבעה ידי הצבתו על אזור הקירור של מכונה ההטבעה להקשיח את פרפין מעט. זה מאפשר מיצוב רקמה טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה בכיוון הרצוי עובש ההטבעה. ממלאים את התבנית הטבעה עם פרפין לקרר מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את תבנית הטבעה המכיל פרפין ב 4 ° C למשך הלילה כדי לתת לה להתקשות לחלוטין ולהסיר את בלוק פרפין המכיל את הרקמות מתבנית ההטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut סעיפים oנה microtome בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אם עמוד השדרה מופר, למשל על ידי נקע בצוואר הרחם, חוט השדרה יהיה לפצל במהלך שחול. אם חוט השדרה לא ניתן נמתח, עמוד השדרה ניתן גזוז מעט בשני קצותיו וניסיון שהחול ניתן לחזור. במקרה חוט השדרה כולו נדרש לניתוח נוסף, כלומר מורכב של הרחבת צוואר הרחם, כמו גם את ההרחבה המותני, עמוד השדרה צריך להיות מטופח רק במעט. אם רק את ההרחבה המותני נדרשת לניתוח נוסף, חוט השדרה צריך להיות מטופח לפי הפרוטוקול הנוכחי. עמוד השדרה צריך להיות יישר באמצעות קצות האצבעות כדי להקל שחול. הפרוטוקול הוא ישים מכרסמים מכל הגילים מודגם כאן על ידי עכבר בוגר (8 שבועות), גור עכבר (5 ימים) חולדה בוגרת (10 שבועות). בהתאם לסוג ומתח חיה, מספר סעיפים ובית החזה המותני עשוי להשתנות 9, </sup&gt; 10, 11. בהתאם חלבונים להיות מנותח, מכרסמים מבוגרים ניתן perfused עם פתרונות אנזים-עיכוב לפני המתת חסד. אם ביצוע ניסוי מעורבים פגיעה עצבית חד צדדי, חוט השדרה ניתן לפצל הצדדים ipsilateral ו הנגדי באמצעות פינצטה Ultra- בסדר מיד לאחר שחול. יתר על כן, כל צד יכול להיות נחלק גב ועל צדדי גחון. הרקמה אז יכול להיות מעובד על ניתוחים נוספים, המערבי סופג למשל. זלוף קיבוע transcardial עם PFA לפני שחול חוט שדרה יש להימנע, כמו זה הופך את חוט השדרה שאינו גמיש ומונע שחול הידראולי חוט שדרה. שחול חוט שדרה הידראולי יקרע את השורשים מגבים. בניסויים שבם שורשים הגבו מצורפים נחוצים, laminectomy מומלץ. יתר על כן, קרומי המוח השדרה הם איבדו ידי שחול הידראולי, אשר יכול להימנע על ידי laminectomy תקן שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד DRG יכול גם להתבצע באמצעות מלאכותי הנוזל השדרתי מחומצן (ACSF) במקום קר כקרח PBS. שימוש ACSF מאפשר שימור של הרקמה המבודדת בסביבה פיזיולוגית טוב יותר, וזה חשוב במיוחד במקרה של הקלטות הבאות אלקטרו 12, 13. חלופה ACSF יכול להיות PBS המכיל 1 גרם / גלוקוז L עבור הדור של תרבויות DRG העיקרי 14. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה משמעותית מהר יותר מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, צמצום זמן טיפול רקמות ולכן להקטין את הסיכון לנזק חלבון. זלוף עם מקבע לפני לבודד את חוט השדרה על ידי laminectomy עשויה להפחית את הסיכון של נזק לרקמות במהלך דיסקציה במהלך ההסרה הסופית שלחוט השדרה של עמוד השדרה. עם זאת, קיבעון רקמות מונע ישימותה ניתוחים כגון מערבי סופג. תשואות שחול הידראוליות רקמות ניזוק מבני 3 מתאימות למגוון רחב יותר של ניתוחים. זיהוי עקבי של DRGs עלול להיות קשה. עם זאת, זה חיוני עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. הכתמה של רקמת חוט שדרה וכן של DRGs יכולה להיות מותאמת על ידי ביצוע וריאציות טיפול רקמות המאוירות מפורטות צעד פרוטוקול 7.

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה וכן לזהות ולבודד DRGs 1, 2. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה מהירה יותר באופן משמעותי מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, כלומר על ידי שבירת חוליות עמוד השדרה אחת בכל פעם, ושיטה זו מפחיתה את הסיכון של נזק לרקמות שנגרם על ידי תהליך לנתיחה 3, 4 . DRGs עלול להיות קשה לזהות. זיהוי נכון חשוב מאוד עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. רקמות המבודדים על ידי הטכניקות הפגינו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של ניתוחים כולל מערבי סופג 5,6, qPCR 7 והכתים 8 immunohistochemical. כאשר זיהוי DRGs, חשוב לקחת בחשבון כי מספר מגזרי חוט שדרה ידוע להשתנות עם סוג חיה ומתח 9, 10, 11. היתרונות בביצוע שיטה זו בעכברים הם המספר הגבוה של הגירסות זמינות מהונדס גנטיות ואת הוצאות הדיור הנמוכות יחסית. היתרונות בשימוש חולדות הם התשואה גבוהה יחסית רקמות ואם מעורבי פציעות עצבות, ההליך יהיה הקל עם גודל.

<table><tbody><tr><td>מספריים בון, עדינים במיוחד, ישרים, 8.5 ס"מ</td><td>F.S.C. (כלי מדע משובחים)</td><td># 14084-08</td><td>לחיתוך חוט השדרה לפני בידוד DRGs (עכבר בוגר, חולדה בוגרת); ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>לצנטריפוגה של רקמה הומוגנית</td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>לחיתוך הרקמה המוטבעת לפני הצביעה; ניתן להשתמש בדגם ויצרן אחר</td></tr><tr><td>מלקחיים, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (כלי מדע עדין)</td><td># 11231-30</td><td>לטיפול בחוט השדרה לאחר שחול; ניתן להשתמש ביצרן/סוג אחר</td></tr><tr><td>מלקחיים, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (כלי מדע עדין)</td><td># 11252-20</td><td>לבידוד DRGs (עכבר בוגר, חולדה בוגרת, גור); ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>איזופלורן (פוראן) IsoFlo Vet 100%</td> <td>Abbott</td><td># 002185</td><td>להמתת חסד; ניתן להשתמש ביצרן אחר; זהירות:</td></tr><tr><td>כימיקלים רעילים</td> <td>של איזו-פנטן GPR rectapur</td> VWR <td># 24872.298</td><td>להקפאת רקמות בהצמדה; ניתן להשתמש ביצרן אחר; זהירות:</td></tr><tr><td>מיקרוטום</td> רעיל <td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>לחיתוך רקמה משובצת פרפין; ניתן להשתמש בדגם ויצרן אחרים</td></tr><tr><td>כדורי שעוות פרפין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>להטמעת פרפין; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>תחנת הטמעת רקמות פרפין</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>להטמעת פרפין של רקמה לחתך מאוחר יותר; ניתן להשתמש בדגם ויצרן אחר</td></tr><tr><td>Pellet pestel, מנוע אלחוטי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>להומוגניזציה מכנית של רקמות מבודדות לפני הכתמה מערבית; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, 35 מ"מ</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>לאחסון DRGs מבודדים; ניתן להשתמש ביצרן וגודל אחרים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, 100 מ"מ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> <td># P7741</td><td>לשחול חוט השדרה; ניתן להשתמש ביצרן וגודל אחרים</td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז, פוסטופ</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' # 04906845001</td><td>קוקטייל מעכב פוספטאז לתוספת למאגר TNE-lysis במידת הצורך; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>קצה פיפטה, 1-200 &mu; L, ללא פילטר</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>לשחול הידראולי; ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במעכב פרוטאז, קוקטייל מעכב</td><td>פרוטאז מלא Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>לתוספת למאגר TNE-lysis במידת הצורך; יצרן אחר עשוי לשמש</td></tr><tr><td>תמיסת RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>לייצוב RNA לאחסון; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>לבידוד RNA; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>אזמל; להב כירורגי Swann-Morton מס' 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>לבידוד אזור המותני של חוט השדרה; ניתן להשתמש ביצרן / סוג אחר</td></tr><tr><td>מספריים, ישרים, סוג 3, קצה חיתוך 25 מ"מ</td><td>Bochem</td> <td># 4070</td><td>לבידוד עמוד השדרה; ניתן להשתמש ביצרן / סוג אחר</td></tr><tr><td>מספריים, 130 מ"מ קצה חיתוך</td><td>Hounisen</td> <td># 1902.0130</td><td>לבידוד חוט השדרה (חולדה בוגרת)</td></tr> <tr><td>מספריים קפיציים, ישרים, 8 מ"מ קצה חיתוך</td><td>F.S.C. (כלי מדע עדין)</td><td># 15009-08</td><td>לחיתוך עמוד השדרה לפני בידוד DRGs (גור) ולבידוד DRGs (עכבר בוגר, חולדה בוגרת, גור); ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>מזרקים סטנדרטיים, 2.5 מ"ל, 5 מ"ל, 10 מ"ל</td><td>Terumo</td> <td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>לשחול הידראולי; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ MZ12.5 עם אובייקטיבי 1X ועינית 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>ניתן להשתמש ביצרן/סוג אחר</td></tr> סטרילי <tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>לשחול הידראולי; ניתן לייצר גם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים</td></tr><tr><td>מחט מזרק 23 G x 1 אינץ', 0.6 x 25 מ"מ</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>לשחול הידראולי בגורים; ניתן להשתמש ביצרן/סוג אחר</td></tr><tr><td>מחט מזרק 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 מ"מ</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>חלופה לקצה פיפטה לשחול הידראולי בעכברים בוגרים; ניתן להשתמש ביצרן אחר</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Tssue חומר הטמעה עבור חיתוך קריוגרפי מאוחר יותר</td></tr><tr><td>TNE-lysis</td><td>מאגר VWR כימיקלים</td> <td># 10128-582</td><td>לליזה רקמות לפני כתמים מערביים; ניתן להשתמש ביצרן אחר; ניתן להכין גם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים</td></tr></tbody></table>

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

באופן מסורתי, חוט השדרה מבודד על ידי כריתת למינקטומיה, כלומר על ידי שבירת חוליות עמוד השדרה אחת בכל פעם. זה גם גוזל זמן וגם עלול לגרום לנזק לחוט השדרה הנגרם מתהליך הדיסקציה. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להוציא את חוט השדרה באמצעות לחץ הידראולי. זמן הטיפול מצטמצם משמעותית למספר דקות בלבד, מה שככל הנראה מפחית את נזקי החלבון. הסיכון הנמוך לפגיעה ברקמת חוט השדרה משפר את הניתוח האימונוהיסטוכימי שלאחר מכן. על ידי ביצוע שחול חוט שדרה הידראולי במקום כריתת למינקטומיה מסורתית, ניתן להשתמש במכרסמים עוד יותר לבידוד DRG, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים ולאפשר ניתוח על פני רקמות מאותו מכרסם. אנו מדגימים שיטה עקבית לזיהוי ובידוד ה-DRGs על פי הלוקליזציה שלהם ביחס לקוסטה. עם זאת, חשוב להתאים שיטה זו לבעל החיים הספציפי בו נעשה שימוש, מכיוון שמספר מקטעי חוט השדרה, הן בית החזה והן המותני, עשוי להשתנות בהתאם לסוג החיה והמתח. בנוסף, אנו מדגימים דוגמאות עיבוד נוספות של הרקמות המבודדות.

הידראולי נמתח מייתרי שדרה להציג משטח ניזוק חלק שמוצג באיור 1. ההגדלה המותני ניתן לזהות בקלות כאזור המעובה של חוט השדרה, התאגרף באיור 1. הגבו ו גחון הצדדים של חוט השדרה יכולים להיות מזוהים על ידי עין על פי המורפולוגיה. באיור 1, בצד הגחון עומד בפני הצופה, המזוהים על ידי קו האמצע אחת ברורה לאורך חוט השדרה כולו. שני קווים רחבים לאורך חוט השדרה לאפשר זיהוי של הצד הגבה. בקצה הדיסטלי-ביותר, equina cauda עשוי לעתים נשאר צמוד חולדות מבוגרי עכברים בוגרים. DRGs הפרט ניתן לזהות רק בעוד ממוקם עמוד השדרה, איור 2. בעקבות הבידוד, איור 3, DRGs הפרט לא ניתן לזהות לפי המראה. במידת הצורך, ולכןחשוב לשמור אותם מופרדים בבירור על הבידוד. לאחר בידוד, חוט השדרה DRGs ניתן לעבד ומוכתמת כפי שמתואר בשלב 7.3 וייצג באיור 4. איור 4 א מראה מכתים immunohistochemical של קטע DRG שבו נוירונים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם גלויים לעין. על ידי זיהוי נכון של DRG אפשר לנתח את ההשפעה של פציעות גיד הנשה על סומה של נוירון הפצוע וכן על ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם. איור 4 מראה מכתים Nissl של חוט שדרה נמתח הידראולית שבו הרקמה היא תמה כפי שמשתקפים הקצוות החלקים של הסעיף. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> איור 4: קטעי רקמה נציג. א. מכתים immunohistochemical של סעיף DRG. B. Nissl מוכתם section של חוט שדרה נמתח הידראולית. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה באמצעות דחיקה הידראולית, וכן לזהות ולבודד גנגליוני שורש אחוריים בעכברים ובחולדות. הדבר משיג תחילה על ידי הקרבת בעלי החיים, ולאחריה עריפתם. העור נחתך לאורך עמוד השדרה ומופרד מהרקמה שמתחתיו.בשלב הבא, עמוד השדרה מופרד מהרקמה הסובבת על ידי חיתוך לאורך שני צדדיו של עמוד השדרה בכיוון הדיסטלי, מעבר לעצם האגן. לאחר מכן, עמוד השדרה נחתך באופן דיסטלי לעצם האגן. מזרק עם קצה פפילטה מותאם מוחדר לקצה הדיסטלי ביותר של חוט השדרה.על ידי הפעלת לחץ קבוע, מוציאים את חוט השדרה אל תוך צלחת פטרי על קרח באמצעות PBS סטרילי קר מאוד. בעזרת מספרי קפיץ, מפצלים את עמוד השדרה לאורכו. לאחר מכן, מאתרים את נקודות החיבור של הצלע המרוחקת ביותר.פעולה זו מאפשרת את זיהוי ה-DRGs התורקיים הדיסטליים ביותר בכל צד, המסומנים כ-T13. כעת ניתן לזהות את ה-DRGs העוקבים. ה-DRGs המתאימים להרחבה הלומבלית של חוט השדרה ממוקמים באופן דיסטלי.באמצעות מספרי קפיץ, חותכים את השורשים הגביים (dorsal) והבטניים (ventral), ואת ה-DRGs מוציאים בעדינות מהחלל ומעבירים לצלחונות פטרי מדוייקים המכילים PBS סטרילי על קרח. דחיקה הידראולית של חוט השדרה היא שיטה מהירה משמעותית מאשר למינקטומיה מסורתית שבה שוברים את חוליות השדרה אחת אחת. שיטה זו מפחיתה את הסיכון לנזק רקמתי הנגרם מתהליך הדיסקציה ומספקת רקמה המתאימה למגוון רחב של סוגי אנליזה.זיהוי של גנגליון השורש האחורי עשוי להיות קשה באופן כללי. עם זאת, זיהוי נכון הוא חשוב ביותר לצורך ניתוח נוסף של הרקמה, למשל בעקבות פגיעה בעצב הסיאטי (sciatic nerve). לפיכך, על ידי מספור גנגליוני השורש האחורי בהתאם למיקומם ביחס לצלע (costa), ניתן לזהות את גנגליוני השורש האחורי באופן עקבי.הכינו מזרק להוצאת חוט השדרה על ידי חיתוך הקצה הרחב של טיפ פילטר למטריצה. הטיפ יתחבר באופן הדוק כאשר יכוון כראוי. שאבו PBS סטרילי קר מאוד והשאירו את המזרק על קרח עד לשימוש הבא.עבור מכרסמים בוגרים, בצעו קטילה באמצעות גז כגון CO2 או isoflurane, ולאחריה עריפת ראש. אין לבצע פריקה של חוליות הצוואר, שכן פעולה זו תפגע בחוליות השדרה ותהפוך את הוצאת חוט השדרה לבלתי אפשרית. ניתן לקטול גורים באמצעות עריפת ראש ישירה.פזר מים על הפרווה כדי לשלוט בשיער. לאחר מכן, חתוך את הפרווה לאורכה של עמוד השדרה בכיוון הדיסטלי. בודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משני הצדדים לאורך עמוד השדרה מעבר לעצם האגן, וחתוך את עמוד השדרה פרוקסימלית לאגן.יש לקטמ את עמוד השדרה כדי להימנע מהאזורים הפרוקסימליים והדיסטליים ביותר, שכן אלו עלולים להפוך את עמוד השדרה למעוקל מדי (בצורת S) עבור הוצאה מוצלחת של חוט השדרה. ודאו שחוט השדרה נראה בשני הקצוות. אם חוט השדרה אינו נראה, קטמו את עמוד השדרה עד שחוט השדרה יהיה גלוי.הניחו צלחת פטרי המכילה PBS על קרח. יישרו את עמוד השדרה על ידי הנחת האצבע המורה על החלק הכפוף בקצה הפרוקסימלי של עמוד השדרה. הכניסו את טיפ הפפיטה לקצה הדיסטלי של חוט השדרה.הפעיל לחץ קבוע והזרם את חוט השדרה אל תוך צלחת פטרי. חתוך את עמוד השדרה. חתוך מספר חוליות בצד הבטני של העמוד, ולאחר מכן עבור לחתוך מספר חוליות בצד הגבי.המשיכו להחליף צדדים לאורך כל עמוד השדרה. הניחו את חוט השדרה הפתוח תחת מיקרוסקופ. זהו את פלח חוליה T13 על ידי איתור נקודת ההיחSockets של הצלע הדיסטלית ביותר בעמוד השדרה.היזהרו שלא לבלבל בין הצלע הדיסטלית ביותר לבין העצבים הבין-צלעיים הסמוכים לה. הצלעות הדיסטליות ביותר מחוברות לחלק הפרוקסימלי של סגמנט חוליה T13, וגנגלי השורש האחוריים (DRGs) של T13 ממוקמים דיסטלית לחוליה T13 ופרוקסימלית לחוליה L1. זהו את ה-DRGs הנלווים בכיוון דיסטלי. הכינו צלחות פטרי ממוספרות המכילות PBS סטרילי קר במקרר, על קרח.כדי למנוע נזק ל-DRG במהלך ההוצאה, אחזו בשורשים הגביים (dorsal) והבטניים (ventral) באמצעות פינצטה 5, במקום לאחוז ב-DRG עצמו. בעזרת מיקרו-מספריים, חתכו תחילה את העצב ההיקפי, ולאחר מכן את השורשים הגביים והבטניים. בגורים, עצבים אלו אינם נראים בבירור כפי שהם נראים במכרסמים בוגרים.על מנת לחתוך את העצבים קרוב ככל האפשר ל-DRG, הניחו לקצה המספריים להחליק בעדינות לאורך ה-DRG כדי למקם את קצה המספריים לפני ביצוע החיתוך. באמצעות קצה של פינצטה סגורה, הוציאו בעדינות את ה-DRGs והעבירו אותם לצ그러ת הפטריה המתאימה. בחולדות בוגרות ובעכברים בוגרים, ה-DRGs הם לבנים עם שורשים דורסליים וונטרליים גלויים בבירור, בעוד שגורים ה-DRGs נראים ככדוריים שקופים.עבור Western blotting, בודדו את הרקמה הרלוונטית והניחו אותה במסלק לסיס (lysis buffer). לאחר מכן, הומוגניזו את הרקמה, בצעו סנטריפוגה, אספו את העילאי (supernatant) ובצעו Western blotting לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור ניתוח RNA, בודדו את הרקמה הרלוונטית והניחו אותה באופן מיידי בתמיסה לייצוב RNA.בשלב הבא, בצע qPCR לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. לצורך אימונוהיסטוכימיה ברקמה שהוקפאה במהירות (snap-frozen), הכן אבקת קרח יבש על פיסת נייר כסף. הנח את הרקמה על אבקת קרח היבש כדי לאפשר לה לקפוא במהירות.לאחר מכן, העבירו את הרקמה לקריוסטט והטמיעו אותה לצורך חיתוך. בצעו קיבוע לאחר החיתוך (post-fixation) ב-4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ובצעו צביעה אימונוהיסטוכימית לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור אימונוהיסטוכימיה של חיתוכים קריוגניים, קבעו את הרקמה ב-4% PFA בטמפרטורה של ארבע מעלות, והעבירו את הרקמה ל-25% weight per volume sucrose למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות.הניחו את הרקמה בחומר הטמעה והקפיאו אותה באמצעות 2-methylbutane מקורר. חתכו את הרקמה בקריוסטט ובצעו צביעה אימונוהיסטוכימית לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. לצורך אימונוהיסטוכימיה על חתכי פראפין, קיבעו את הרקמה ב-4% PFA בטמפרטורה של ארבע מעלות והעבירו את הרקמה ל-25% weight per volume sucrose למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות.יש להטמיע את הרקמה בפרפין, לחתוך את הרקמה במיקרוטום ולבצע צביעה אימונוהיסטוכימית בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. בהתאם לנוגדנים המשמשים לצביעה האימונוהיסטוכימית, ניתן למצוא כל אחת משיטות הטיפול ברקמה שהודגמו כמתאימה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן בידוד של חוט השדרה באמצעות דחיקה הידראולית, וכן באופן זיהוי ובידוד עקבי של גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglia).השיטות המוצגות כאן ישימות לעכברים ולחולדות בכל הגילאים, וניתן להשתמש ברקמה המבודדת למגוון רחב של ניתוחים, כולל שיטות הדורשות בידוד מהיר של רקמה שאינה מקובעת.

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

בסרטון זה אנו מדגימים מיצוי גנגליון שורש גבי או DRG מעמוד שדרה של חולדה שנקטפה עבור יישומים במורד הזרם.

קצירת DRG מעמוד השדרה של חולדה: הליך לחילוץ גנגליון שורש גבי מעמוד השדרה של מודל חולדה

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד חוט השדרה ממודל עכבר עבור מחקרי מבחנה.

מיצוי חוט השדרה: פרוטוקול לבידוד חוט השדרה המורין למחקרי מבחנה

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

סרטון זה מציג שיטה לבידוד תאי גזע/אב עצביים מרקמה פרי-חדרית של חוט השדרה בחולדות בוגרות. הטכניקה כוללת דגירה של מקטעי הרקמה בתמיסה המכילה אנזימים מפרקי חלבון כדי לשבש את המטריצה החוץ תאית ולשחרר את התאים. לאחר מכן, התאים המשוחררים מצופים בתווך המכיל גורמי גדילה ספציפיים המגבירים את התרבות הגזע העצבי / האב ומקדמים צבירה לנוירוספרות תלת ממדיות.

בידוד תאי אב עצביים מאזור חוט השדרה הפריוונטריקולרי של חולדה בוגרת

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

פרוטוקול זה מציג את השימוש בהזרקת גנגליון שורש גבי (DRG) עם וקטור ויראלי ופגיעת ריסוק שורש גבי במקביל בחולדה בוגרת כמודל לחקר התחדשות אקסון חושי. מודל זה מתאים לחקירת השימוש בריפוי גנטי לקידום התחדשות אקסון חושי.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

גנגליוני שורש גביים (DRG) מכילים גופי תאי נוירון חישה ראשוניים ומעבירים אותות חושיים היקפיים לחוט השדרה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפירוק DRG בעכברים התומכת בבידוד סטנדרטי של גנגליונים שלמים מבניים, זיהוי סגמנטלי אנטומי, הכוונה אינטואיטיבית למשתמשים מתחילים, והפחתת פגיעות ברקמה פרוצדורלית.

ניתוח ובידוד של גנגליוני שורש גבי בעכבר

למד שיטת שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד גרעיני שורש הגבה במכרסמים. שיטה זו מהירה יותר מטכניקות מסורתיות ומפחיתה נזק לרקמות עבור מחקר נוירוביולוגי.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

גלה סרטונים נוספים