כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

המטרה הכללית של שיטה זו היא למדוד את התנהגות הטיפוח (grooming) של זבוב הפירות Drosophila על ידי כימות והשוואה של שאריות צבע צהוב Brilliant Yellow על גופם של בעלי החיים בתנאי טיפוח ובלי טיפוח. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הנוירוביולוגיה והגנטיקה ההתנהגותית, כגון תיאום מיומנויות מוטוריות עדינות והווסתים המולקולריים והמעגלים העצביים הקשורים אליהן. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם היותה מהירה, חסונה וקלה לביצוע על ידי חוקרים וסטודנטים רבים בעלי רמות מיומנות שונות.

את הפרוצדורה יעמיד באופן מעשי פרנקי באראדייל, סטודנט במעבדתי. כדי להתחיל את הניסוי, הכינו שואב (aspirator) להעברת זבובים חיים מסוג Drosophila מבקבוק תרבית לתא הטיפוח.

גזרו לפחות שורה אחת מקצה של טיפ מיקרו-פיפט חד-פעמי של 1 ml והחזיקו פיסת רשת ריבועית של 1 ס"מ מעל הפתח של הטיפ הגזור. הצמידו היטב טיפ מיקרו-פיפט חדש של 1 ml מעל הרשת והטיפ הגזור כדי ליצור תא החזקה לזבובים. גזרו את הקצה הקיצוני של טיפ המיקרו-פיפט החדש כדי להרחיב את הפתח מספיק כדי לאפשר מעבר של זבוב בודד.

החור יתאים בקירוב לפתח של תא הטיפוח. התקינו את הקלפים המקוננים באופן הדוק מקצה צינור ה-Tygon. דחפו את הקלפים לתוך הצינור כדי להבטיח התאמה הדוקה שתאפשר לחץ ואקום.

בקצה השני של הפיתול, גזרו את קצהו של טיפ למקרו-פיפט של 200 מיליליטר והכניסו את הקצה הגזור והצר לתוך הפיתול כדי ליצור את צד הפיה של השואב. להכנת מבחנות עם מנות אבקה, שקלו חמישה מיליגרם של צבע צהוב בוהק (brilliant yellow dye) על נייר שקילה. שפכו את האבקה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 8 מיליליטר וסגרו את המכסה היטב.

בשלב הבא, להכנת מבחנות אתנול, העבירו בפיפטה 1 milliliter של 100%ethanol למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 15 milliliter. סמנו את המבחנות, סגרו אותן במכסה ושמרו את מבחנות האתנול עד להשלמת בדיקת הטיפוח (grooming assay). יש לכלול גם לפחות דגימה אחת ריקה המכילה 1 milliliter של אתנול ללא זבוב, לצורך בקרות שליליות.

הרכיבו כל תא טיפוח על ידי הברגת לוחית העליונה הנחלקת בעלת החורים הקטנים יותר, אך השאירו את הלוחית התחתונה בעלת החורים הגדולים יותר מחוץ לתא לצורך הוספת האבק. הניחו כל תא טיפוח נדרש בצורה שטוחה על שולחן כאשר הפנים העליונה פונה כלפי מטה. טענו מנה של 5 mg של צבע צהוב בוהק לתוך כל תא, על ידי הקשה עם המבחנה על פני התא מעל הבאר הרצויה.

הקישו את התא נגד השולחן כדי להבטיח שכל האבק יפול דרך הרשת אל חלקו העליון של הלוח. לאחר מכן, הבריגו את הלוח התחתון לכל תא, כך שהקצוות הרחבים יותר של הפתחים הקוניים פונים החוצה והחורים אינם ממוקמים מעל הבארים. הדקו את הלוח התחתון היטב, כדי שלא יחליק ויגרום לדליפת צבע.

הפוך את התא והדק אותו מספר פעמים על השולחן כדי שהאבק ייפול דרך הרשת אל הפלטה התחתונה. החלק את הפלטה העליונה של התא למצב הפתוח שבו החורים הקטנים מיושרים עם 15 הבארות, כדי לאפשר את הכנסת הזבובים לבארות הבודדות. העבר זבוב אחד לשואב הזבובים על ידי שאיבה עדינה מקצה אחד של השואב, בדומה לשימוש בקשבייה.

העבירו את הזבובים על ידי נשיפה קלה תוך הכוונת הפתח לעבר היעד. לאחר מילוי באער, החליקו את הפלטה העליונה כך שהזבוב יילכד בתא, והדביקו סרט דביק מעל פתח הבאער במהלך מילוי תאי החורים, כדי למנוע את בריחת הזבוב בזמן מילוי שאר הבאערים. אם מספר זבובים נשאבו לבאער בודד, השאירו פתח זה פתוח עד שיישאר בו זבוב אחד בלבד.

לאחר שמילאו את כל הבארים הדרושות בזבובים, הפכו את התא כך שהפלטה התחתונה תהיה פונה כלפי מעלה, כדי שהאבקה תוכל לצפות את הזבובים על ידי נפילה דרך הרשת. הדקו היטב את הפלטות העליונה והתחתונה על ידי הידוק הברגים, ובצעו ערבוב במכשיר vortex לתא במשך ארבע שניות כדי לאבק את הזבובים. הקישו את התא, כשהפלטה העליונה פונה כלפי מטה, פעמיים נגד השולחן, כדי שהצבע ינפול דרך הצד השני.

לאחר מכן, הפכו את התא כך שהלוח העליון יפנה כלפי מעלה והקישו פעמיים על התא, כדי להבטיח שהצבע ישקע ברצפת התא התחתון, הרחק מהזבוב המוחזק בתא העליון. עבור זבובים של קבוצת הביקורת, שאינם מורשים לנקות את עצמם, עברו מיד להכנת הדגימה. הניחו את התא בצורה שטוחה על השולחן או על משטח העבודה, כאשר הלוח העליון פונה למעלה, למשך 30 דקות כדי לאפשר לזבובים לנקות את עצמם.

הניחו את התא בחלל נקי מרעשים ומרעידות, כדי לשמור על סביבה קבועה עבור כל ניסויי הטיפוח. תוך שמירה על התא במצב מאוזן כאשר הפלטה העליונה פונה למעלה, שחררו בעדינות את הפלטה התחתונה והסירו אותה מהתא, תוך הקפדה לא לאבד צבע.

הסירה את הפלטה העליונה מהתא, השתמש בפינצטה בזהירות כדי לתפוס רגל והוצא זבוב אחד מאובק מכל תא והעברה אותו לשפרויר מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל אתנול. לאחר שבכל שפרויר מיקרו-צנטריפוגה יש זבוב אחד, סגור את המכסה והפוך את השפרוירים שלוש פעמים כדי לערבב את תמיסת הצבע והאתנול. דגור את השפרוירים המכילים אתנול וזבובים למשך חמש שעות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח הסרה מלאה של הצבע מהזבוב אל תוך התמיסה.

לאחר חמישה שעות, ערבלו קצרה כל מבחנה ב-vortex למשך שתי שניות כדי להבטיח את סלקרה הצבעים מהזבובים. העבירו מנה של 50 µL ממבחנת הניסוי בנפח 1.5 mL לבאר בלוחית של 96 בארות, תוך רישום מיקום כל דגימה בלוחית. הוסיפו 200 µL של ethanol כדי לדלל את הדגימה פי חמישה, במטרה למנוע השפעות של חסימה (sealing effects) הנובעות מזבובים מכוסים באבקה רבה או מפגמים משמעותיים בטיפוח (grooming defects).

השתמשו בקורא לוחות (plate reader) כדי לנתח כל דגימה באורך גל של 397 ננומטר. תיעדו את הדגימה באמצעות קורא הלוחות ושמרו את גיליון הנתונים עם רישום הדגימות שעל הלוח. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור את DopR על ידי השוואת ביצועי הטיפוח של מוטנטים היפומורפיים חזקים ומוטנטים מסוג null של DopR למאב Strain מסוג פרא (wild type).

המוטנטים של DopR שימרו כמות גדולה משמעותית יותר של צבע מאשר מקביליהם מסוג הפרא או אלו שעברו הצלה (rescued), מה שמעיד על כך שהמוטנטים של DopR היו פחות יעילים בהתנהגות הטיפוח (grooming). בניסוי מקבילי של זבובים מסוג Rutabaga, המוטנטים הראו רמות גבוהות יותר של הצטברות צבע מאשר מוטנטים של DopR, מה שמרמז על תפקיד משמעותי של DopR בהתנהגות הטיפוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו מטפלים בזבובים עבור בדיקות התנהגותיות וכן כיצד למדוד את התנהגות הטיפוח.