טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים
26 בינואר 2017
אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.
המטרה הכוללת של שיטת טיהור זיקה טנדם זו היא לבודד קומפלקסים חלבונים המתבטאים מתאים אוקריוטיים לצורך אפיון ביוכימי ומכלולים מולקולריים וזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם. שיטה זו מאפשרת טיהור של קומפלקסים חלבונים שלמים מתאים אוקריוטיים, כדי לזהות אינטראקטורים חדשים ושינויים רגולטוריים לאחר תרגום המכווננים את תפקודם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת טוהר ותפוקה גבוהים של קומפלקסי חלבון ליישומי מבחנה במורד הזרם כדי לחקור את תפקודם ופעילותם.
תאים נאספים מטיהור זיקה STREP 48 שעות לאחר הטרנספקציה. הסר את המדיה והוסף שמונה מיליליטר PBS קר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים מהצלחת.
אסוף והעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר וסובב את התאים כלפי מטה ב-800 פעמים גרם למשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את ה-PBS supernatant. סובב ב-800 פעמים גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסל שאריות PBS.
כדי להתחיל בהליך זה, השעו מחדש כל כדור תא פי חמישה מנפח גלולת התא של מאגר ליזה פסיבי, או PLB. העבר את מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מערבב לזמן קצר את המתלה, ואגוז במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
סובב את תרחיף התא ב -10, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הליזט המסיס לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר והשליכו את גלולת התא. חסוך 10% מהנפח הסופי של הליזט המסיס כקלט STREP-AP ואחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.
חשוב להשתמש בחרוזי STREP לשלב הראשון של טיהור הזיקה מכיוון שקומפלקסים שנמשכו כלפי מטה עם חרוזי STREP מחזירים הרבה יותר חלבון מאלה שנמשכו כלפי מטה עם חרוזי FLAG. בעזרת קצה פיפטה רחב פה הסר את הכמות המתאימה של 50% תמיסת חרוזי STREP לטיהור הזיקה. סובב ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר PLB לחרוזים. אגוזים את תערובת החרוזים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. תסתובב שוב.
לאחר הכביסה השלישית, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החרוזים ב- PLB לנפח סופי של n כפול 40 מיקרוליטר, כאשר n הוא מספר הדגימות. הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי 50% STREP לכל דגימת ליזאט תא ואגוז למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. במהלך ייצור והתאוששות חלבון זה ניתן להשתמש במספר צלחות של תאים, וניתן לשלב את אותן דגימות חלבון שנלקחו מצלחות שונות עם מנה אחת של חרוזים במהלך טיהור הזיקה של STREP.
לאחר שתערובות תמיסת חרוזי התא ו-STREP דגרו במשך שעתיים, סובבו אותן ב-1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמור את הסופרנטנט כאשר STREP AP זורם ומאוחסן בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה STREP AP אחד לחרוזים.
אגוזים את החרוזים בתערובת חיץ במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה STREP AP. לאחר הכביסה השלישית, העבירו את תמיסת החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר כדי להפחית את רקע החלבון.
שטפו פעם רביעית עם מאגר הכביסה STREP AP אחד. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר חמאת שטיפה שתיים. מאזנים את החרוזים על ידי היפוך הצינורות ואז מסתובבים כלפי מטה ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנטנט. מסלק את החלבון המעניין עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה STREP. מערבולת ב-800 סל"ד למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
סובב את החרוזים ב -1, 500 פעמים גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט. שבר זה תואם את דגימת הפליטה של STREP AP.
שמור את שבר החרוזים בארבע מעלות צלזיוס לפליטה שנייה. מביא 10% מפליטת STREP AP לצביעת כסף ו/או כתמים מערביים. כדי להגדיל את כמות החומר ההתחלתי עבור המשקעים החיסוניים של FLAG שלאחר מכן, ניתן לאגד יחד את פליטות ה-STREP הראשון והשני לשחזור יעיל יותר של פליטת ה-FLAG.
התחל הליך זה על ידי שימוש בקצה פיפטה רחב פה כדי להעביר את הכמות המתאימה של תמיסת חרוז FLAG לצינור מיקרוצנטריפוגה. סובב ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG לחרוזים.
סובב ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם מאגר כביסה FLAG. לאחר הכביסה השלישית, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החרוזים במאגר הכביסה של FLAG לנפח סופי של n כפול 16 מיקרוליטר, כאשר n הוא מספר הדגימות.
הוסף 16 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי FLAG לפליטת ה-STREP AP הנותרת ואגוז למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של לילה של תמיסת חרוזי FLAG ופליטת STREP AP, המשך עם משקעים חיסוניים של FLAG. סובב את מתלה חרוזי ה-FLAG ב-1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שמור את ה-supernatant כאשר ה-FLAG IP זורם ומאוחסן בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG לחרוזים. אגוזים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG. לאחר הכביסה השלישית, העבירו את תמיסת חרוזי החלבון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר כדי להפחית את הרקע. שטפו פעם רביעית עם מאגר כביסה FLAG.
הסר את הסופרנטנט מהסיבוב הסופי והוסף לחרוזים 30 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG המכיל 200 ננוגרם למיקרוליטר של פפטיד FLAG. מערבולת ב-800 סל"ד למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, סובב את המתלה ב -1, 500 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
קצרו את הסופרנטנט ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס כפליטת ה-IP של FLAG. בסרטון זה, טיהור הזיקה של טנדם, או שיטת TAP, יושם על קומפלקס Cyclin-T1 CDK9. STREP מתויג Cyclin-T1 ו-FLAG מתויג CKD9 היו ביטוי יתר בתאי HEK293 T.
ניסוי הדדי בוצע גם עם STREP המתויג CDK9 ו-FLAG המתויג Cyclin-T1. ניתוח כתמים מערביים מראה ש-FLAG תייג את CKD9 עם STREP מתויג Cyclin-T1 מחרוזי STREP, אך לא בביקורת שלילית, AP חסר STREP מתויג Cyclin-T1. שני החלבונים זוהו בפליטת FLAG, מה שאישר עוד יותר את היווצרות המורכבת.
תוצאות ה-TAP ההדדיות מראות כי FLAG תייג את Cyclin-T1 עם STREP המתויג CDK9, מה שמאמת עוד יותר כי האינטראקציה של Cyclin-T1 CDK9 אינה תלויה באפיטופים המשמשים. תוצאות ה-TAP וה-TAP ההדדי נותחו גם על ידי צביעת כסף. הכוכביות מצביעות על זיהומים מכוסים.
FLAG מתויג CKD9 מתויג עם STREP מתויג Cyclin-T1 מחוץ לחרוזי ה-STREP, אך לא מהבקרה AP.In פליטת ה-FLAG שלאחר מכן, STREP מתויג Cyclin-T1 מתויג עם FLAG מתויג CDK9 מחוץ לחרוזי FLAG. באופן דומה, FLAG תייג את Cyclin-T1 עם STREP מתויג CDK9 מחוץ לחרוזי ה-STREP, אך לא מ-AP הבקרה. וקומפלקס החלבון-חלבון התאושש ביעילות לאחר שלב ה-FLAG IP השני. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים, החל מרגע שהתאים מוכנים לאיסוף אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור להגדיל את מספר לוחות התאים לכל ניסוי בהתאם כדי להבטיח שניתן יהיה לשחזר ולזהות מספיק חלבון. לדוגמה, זיהוי יחידות המשנה הרגולטוריות החדשות ו/או לימוד השינויים שלאחר התרגום ביחידות משנה מורכבות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים החוקרים אינטראקציות חלבון-חלבון לחקור אינטראקציות חדשות ושינויים לאחר תרגום בתאים אוקריוטיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולאפיין חלבונים באמצעות תגי STREP ו-FLAG.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטת טיהור אפיניטי טנדם (TAP) חדשה המתוכננת לבידוד יעיל ואופיון של מתחמי חלבון מתאים אוקריוטיים. השיטה מאפשרת זיהוי של אינטראקטורים חדשים ושינויים פוסט-תרגומיים המשפיעים על תפקוד החלבון.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיית תאים
- אינטראקציות חלבונים
רקע
- טיהור אפיניטי טנדם היא טכניקה המשמשת לבידוד מתחמי חלבון.
- הבנת אינטראקציות חלבונים חיונית להבהרת תפקודים תאיים.
- שינויים פוסט-תרגומיים ממלאים תפקיד משמעותי בוויסות פעילות החלבונים.
- שיטה זו משפרת את הטוהר והתשואה של מתחמי חלבון לניתוח נוסף.
מטרת המחקר
- לפתח שיטת TAP חזקה לבידוד מתחמי חלבון.
- להקל על אופיון ביוכימי של מתחמי חלבון.
- לזהות אינטראקטורים חדשים ושינויים רגולטוריים.
שיטות ששימשו
- בידוד מתחמי חלבון מתאים אוקריוטיים.
- שימוש בטיהור אפיניטי STREP 48 שעות לאחר טרנספקציה.
- יישום PBS קר להתנתקות תאים.
- יישומים אחוריים in vitro לחקר תפקוד החלבון.
תוצאות עיקריות
- הושגה טוהר ותשואה גבוהים של מתחמי חלבון מבודדים.
- זיהוי אינטראקטורים חדשים היה מסוגל.
- אפיינו שינויים פוסט-תרגומיים המסדירים את תפקוד החלבון.
- השיטה הוכחה כיעילה לאופיון ביוכימי.
מסקנות
- שיטת ה-TAP היא כלי חשוב לחקר מתחמי חלבון.
- היא מאפשרת זיהוי של אינטראקציות רגולטוריות מרכזיות.
- גישה זו יכולה לשפר את הבנתנו את תפקוד החלבון והפעילות שלו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
