Name: טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למד שיטת טיהור זיקה טנדם לבידוד קומפלקסי חלבונים ממתאים איקריוטיים באמצעות תגיות STREP ו-FLAG. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקטורים חדשים ומודיפיקציות לאחר תרגום המווסתות פעילות חלבונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של ה-NIH תחת פרס מספר R01AI114362 ומענק קרן וולש I-1782 לאיוואן ד'אורסו.

1. תאי ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני transfection, צלחת 3.5 x 10 6 תאים HEK293T ב 10 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יח &#39;/ מ&quot;ל ​​המניות) לכל צלחת 100 מ&quot;מ. פלייט 3 - 5 100 מנות מ&quot;מ לכל ניסוי / מצב כדי להבטיח התאוששות מספיק חלבון. הערה: מספר הצלחות יש לקבוע עבור כל ניסוי / מצב, אשר יסתמך על רמות הביטוי המסיס של מתחם החלבון של עניין. לחלופין, אם טיהור בקנה מידה גדול יותר יש צורך, שורות תאים ניתן להתאים לגדול השעיות צלוחיות טווה 2, אך שיטה זו לא תעבוד עבור transfections חולף. </li></ol> 2. Transfecting תאים או גרימת שורות תאים יציבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. התאים חייבים להיות 70 - 80% ומחוברות לפני proceeding. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם תערובת הכוללת 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ו -21 μl של מגיב transfection לכל צלחת 100 מ&quot;מ. תאים Transfect עם GFP להביע וקטור (טבלה 1) כביקורת על יעילות transfection. הערה: אם אתה משתמש HEK293-T-Rex או שורת תאים יציבה דומה התופעה אשר עלול לגרום הביטוי של שתיים או יותר מורכבי יחידות משנה בתגובת דוקסיציקלין 14, 15, inducer יצטרך להתווסף התאים וטופח במשך 48 שעות. בדומה לכך, שורת תאים יציבה תופעה אשר עלולה לגרום ביטוי GFP על תוספת של inducer יהיה דרוש גם ולאמת אותם. עבור לשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת transfection לכל צלחת 100 מ&quot;מ. בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, לערבב 500 μl של DMEM unsupplemented עם 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד הכולל (המקביל ל שניים או יותר פלסמידים). בתוך צינור microcentrifuge נפרד, לערבב 500 μl של wi unsupplemented DMEM21 μl ה של מגיב transfection. חזור על הפעולה עבור כל תגובה transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הפתרון מגיב transfection לתוך פתרון ה- DNA פלסמיד (לא לערבב פתרונות בסדר הפוך). מערבבים על ידי pipetting לפחות 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 - 15 דקות, אך לא יותר מ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת ליצור מאגר תקשורת ובזהירות פיפטה תערובת transfection ירידה מבחינת על הצד הפנימי של הצלחת מבלי להפריע את התאים. מחזירים את המנה למצב שטוח המקורי ו מערבולת בעדינות כדי לפזר את התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאי humidified עם 2 5% CO (תנאי זה להלן המכונה &quot;חממה בתרבית רקמה&quot;). החזר את שלאחר transfection hr תקשורת 5 (אופציונאלי). </li></ol> 3. Transfection סימון או יעילות אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 24 שעות שלאחר transfection, לדמיין את התאים תחת שפעתמיקרוסקופ orescent כדי לבדוק יעילות transfection (או אינדוקציה של שורת תאים יציבים השליטה HEK293T-REX להביע GFP). דגירה של 24 שעות אחרות. </li></ol> 4. סטרפטוקוקוס טיהור זיקה (סטרפטוקוקוס AP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה ולהוסיף 8 מ&quot;ל של 1x קר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק תאים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ&quot;ל ומסובב את התאים למטה ב 800 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant PBS. חזור על ספין למטה (800 XG דקות 1 ב 4 ° C) כדי לחסל כל PBS שיורית. אחסן את התא גלולה ב -80 ° C לשימוש עתידי או פעל לפי הנוהל שלהלן כדי להמשיך טיהור חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysing התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי התא באמצעות 5 × נפח תא גלולה (~ 250 μl לכל צלחת) של הצפת תמוגה פסיבי(PLB: 20 mM Tris-HCl 7.5 pH, 150 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 1 מ&quot;מ DTT, לוח קוקטייל מעכב פרוטאז, 5% v / גליצרול נ, ו -1.0% NP-40) ולהעביר את ההשעיה התא 1.5 מ&quot;ל צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת ההשעיה nutate למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השעית תא XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את lysates המסיס לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש וזורק כדורי התא. חסוך 10% של הנפח הסופי של lysate המסיס כמו &quot;קלט AP סטרפטוקוקוס.&quot; חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Equilibrating חרוזי סטרפטוקוקוס הערה: השתמש סטרפטוקוקוס חרוזים עבור שלב AP הראשון! המכלולים הורידו עם חרוזי סטרפטוקוקוס לשחזר חלבון גבוה יותר מאשר אלו משכו מטה עם חרוזי FLAG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא (n × 40 μl) + n μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. הערה: השתמש רחב-מ &#39;טיפים outhed חרוזים פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של PLB על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. Resuspend את החרוזים PLB לנפח סופי של n × 40 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס לטעום כל lysate התא nutate עבור שעה 2 ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרפטוקוקוס AP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה פתרון ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant וחנות בשם &quot;סטרפטוקוקוס AP זרימת הדרך (FT)&quot; על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של סטרפטוקוקוס AP הצפת לשטוף לי (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 1 מ&quot;מ DTT, גליצרול 5% ו -0.2% NP-40) על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. בטל supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף. <br/&gt; הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את הפתרון החרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את רקע החלבון. צעד זה חיוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl לשטוף הצפת השנייה (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, ו 1 mM EDTA) לאזן את החרוזים על ידי היפוך הצינורות. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון של עניין עם 50 μl של סטרפטוקוקוס הצפת elution (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -2.5 מ&quot;מ Desthiobiotin). וורטקס ב 800 סל&quot;ד במשך 15 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים ב 1500 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant. חלק זה תואם המדגם &quot;סטרפטוקוקוס AP Elution&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החלק יחסי חרוז על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת elution שני, אשר יכול להניב עד מחצית כמות החלבון שהושגה עם elution הראשון. Aliquot 10% של סטרפטוקוקוס AP Elution עבור צביעת כסף ו / או המערבי סופג16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Equilibrating חרוזי FLAG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא (NX 16 μl) + n μl של פתרון חרוזים FLAG (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. הערה: השתמש בעצות פעורות פה חרוז פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.1% NP-40) על חרוזים. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים חיץ לשטוף FLAG לנפח סופי של μl 16 NX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 μl של slurry חרוז הדגל elution סטרפטוקוקוס AP הנותרים ולינה nutate על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השעית חרוזי FLAG ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וחנות בשם &quot;הדגל IP הזרימה דרך&quot; (FT) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 50081; l של חיץ FLAG לשטוף לפתרון. Nutate במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף ולהסיר את supernatant לאחר כל שטיפה. הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את פתרון חלבון-חרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את הרקע. צעד זה חיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מן הסיבוב האחרון ולהוסיף 30 μL של חיץ לשטוף FLAG המכיל 200 ng / μl של פפטיד FLAG לתוך חרוזים. וורטקס ב 800 סל&quot;ד במשך שעה 2 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ההשעיה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. קציר supernatant וחנות ב 4 ° C כמו &quot;FLAG IP Elution.&quot; הערה: דגימות elution יכולות להיות מאושרות על ידי כתם כסף ו / או כתם מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 16, והם מוכנים מבחני חלבון נוספים. בעת הגדרת כתם מערבי, להפעיל את כל הדגימות הבאות: (1) קלט AP סטרפטוקוקוס, (2) סטרפטוקוקוס AP FT, (3) סטרפטוקוקוס AP Elutiעל, (4) דגל IP FT, ו (5) דגל IP Elution. כרכים הטעונים יצטרכו להיקבע עבור כל ניסוי. כל הדגימות וחרוזים שנאספו ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. דגימות TAP יכולות להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לאמת את הזהות ומרכיביהן, לזהות שינויים שלאחר translational רומן (PTMs), ו / או לגלות כל אינטראקצית חלבון רומן עם המורכבות המטוהרות 2, 17. לשם כך, אחרי ריצת כתם ג&#39;ל או כסף coomassie, להקות ניתן ניכרו מן ג&#39;ל באמצעות אזמל נקי. ביקורות מצוינות כמה דנים בשיטות ספקטרומטריית מסה פורסמו בעבר 18, 19. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן לביטוי והבידוד של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים אינו מוגבל באפיון ביוכימי של מכלולים מולקולריים כזה, אבל יכול גם להיות מנוצל לצורך זיהוי של interactors רומן שלאחר translational שינויים שיכולים לווסת את תפקידם. הניצול של תגי קרבה אינו מוגבל למה מוזכר בפרוטוקול זה; אבל מניסיוננו עולה כי באמצעות סטרפטוקוקוס כצעד AP הראשון משפר באופן משמעותי את התשואה של מתחם החלבונים הסופי. הן המדרגות מחייבות elution וממנה החרוזים סטרפטוקוקוס הן מאוד יעילות בהשוואת תגי epitop...

<html> אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן קריטיות להסדרה המדויקת של תהליכים ביולוגיים 1, ומחקרים נוספים על PPIs אלה יכולים להודיע על תפקידם 2. גישות כמה כבר המציאו לחקר ואפיון של PPI כמו גם לזיהוי דה נובו של רכיבי חלבון הרגולציה הרומן. בשנת 1989, סטנלי פילדס ועמיתיו דיווחו על השנייה היברידי השמרים (Y2H) assay 3. גישה זו מאפשרת זיהוי המשוחדת ומקיפה של interactors (פושט) עבור חלבון מוגדר של עניין (פיתיון) ב שמר אפייה. בנוסף השירות המדהים שלה לגילוי PPIs, assay Y2H יכול לשמש לאפיון זוגות חלבון בתאי שמרים, הגדרה מינימאלי תחומי אינטראקציה, וזיהוי מוטציות לבטל אינטראקציות כאלה. על ידי שינוי assay Y2H, PPIs יכול להיות גם למד בתאי יונקיםclass = &quot;Xref&quot;&gt; 4. וריאציות של assay Y2H (למשל, מערכת תלת-היברידית שמרים) יכול להיות מיושם גם ללמוד חלבון-רנ&quot;א אינטראקציות ליגנד אורגני-קטן חלבונים בתאים. כלי נוסף נפוץ ללמוד PPIs במערכת הומולוגית הוא immunoprecipitation שיתוף (שיתוף IP) assay 5. באמצעות נוגדן כדי immunoprecipitate חלבון של עניין, assay שיתוף IP מאפשר לחוקרים לעקוב אחר PPIs בתאים עבור תנאים סביבתיים שונים ומצבים ניסיוניים. השימוש-tagged חלבונים epitope (למשל, דגל, Myc, סטרפטוקוקוס, ו HA, בין היתר) טיהור זיקה (AP) שיטות יש להקל את הבידוד של חלבונים מתערובות חלבון מורכב במשך כמה מבחני במורד הזרם, כולל כתם המערבי, כתם כסף , וניתוח האנזימטית. עם זאת, אף אחד הגישות הקודמות אלה מאפשרים הבידוד של כמויות גדולות של קומפלקסי חלבונים עבור אפיון נוסף כולל במבחנהssays, גילוי יחידות משנת רגולציה על ידי ספקטרומטריית מסה, וזיהוי שלאחר translational שינויים. גרסה משופרת של שיטת AP נקראת טנדם AP (TAP), שהיא טכניקת טיהור ללימוד PPIs על ידי יצירת חלבון היתוך עם שני אפיטופים כי הוא מטוהר באמצעות שתי נקודות גישה עוקבות 6, 7. במאמר זה, אנו מציגים וריאציה של שיטת TAP עבור קומפלקסי חלבוני טיהור שבו שתי תת יחידות מתויגות עם אפיטופים שונים וטהרו מכן דרך שתי נקודות גישה סדרתית (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAG IP). אנחנו ראשונים לספק סקירה מינימליסטי של TAP (איור 1) ולאחר מכן תיאור מפורט של כל שלבי הניסוי (איור 2), כך חוקרים יכולים ליישם אותם על מורכבות עניין החלבון שלהם. כדי להדגים את תחולתה של שיטת TAP, בחרנו היטב מאופיין cyclin-CDK מורכב (המכונה PTEFB קינאז), אשר מורכב של T1 cyclin למקטע רגולטוריות (CycT1) ו קינאז (CDK9), והוא מעורב בוויסות שעתוק על ידי RNA פולימראז II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphorylates תחום מסוף-C של Pol II וגורם ההתארכות השלילית הקשורות אליו, ובכך יקל שהשהיה תעתיק בבית האמרגן ובכך מקלת התארכות שעתוק 11, 12, 13. עם אינטראקציה ידועה זה בחשבון, סטרפטוקוקוס-מתויג CycT1 ו CDK9 מתויג FLAG היה מעל לידי ביטוי בתאי HEK293T. ניסוי TAP גומלין בוצע עם FLAG-מתויג CDK9 ו מתויג סטרפטוקוקוס CycT1 לאמת נוסף שאינטראקצית החלבון היא עצמאית של אפיטופים מנוצלים. תאים נאספו lysed 48 transfection שעות שלאחר. את lysate המסיס היה מטוהר על ידי TAP (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAGIP). קלט חלבונים מטוהרים נותחו על ידי כתם המערבי כתם כסף (איור 3).

<table><tbody><tr><td>מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco</td> GE <td>Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז&nbsp;</td><td>רוש&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11836153001 STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פליטת תג STREP</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 מ"מ ופעמים; תרבית תאי צלחת בסגנון 20 מ"מ מטופלת בפוליסטירן לא פירוגני 20/שרוול</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>430167 חלבון Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת דיגיטלית מיקסר</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>מתלה קצף מיקרו צינור 48 חורים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>רוטיסרי שייקר Labquake&nbsp;</td><td>תרמו&nbsp;</td><td>ברקוד 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור חלבונים פעילים ומכלולים חומצות גרעין חלבון חיוני לאפיון של פעילות אנזימטית ו דה נובו זיהוי של יחידות משנה רומן שלאחר translational שינויים. מערכות בקטריאלי לאפשר ביטוי וטיהור של מגוון רחב של פוליפפטידים יחיד קומפלקסי חלבונים. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת טיהור של יחידות משנה חלבון המכילים שלאחר translational שינויים (למשל, זירחון acetylation), ואת ההזדהות של יחידות משנה הרגולציה רומן כי הם רק בהווה / הביעו במערכת איקריוטיים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של רומן, חזק, וטיהור זיקת טנדם יעילה (TAP) שיטה באמצעות STREP- וחלבונים מתויג FLAG המאפשר הטיהור של קומפלקסי חלבונים עם זמני או ביציבות הביע-tagged חלבוני epitope מתאי איקריוטיים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לאפיין protein פונקציונליות מורכבות, לגלות שלאחר translational שינויים על יחידות משנה מורכבות, ולזהות רכיבים מורכבים רגולטוריות רומן על ידי ספקטרומטריית מסה. יש לציין, שיטת TAP זה ניתן להחיל ללמוד קומפלקסי חלבונים שהוקמו על ידי איקריוטיים או פתוגניים (נגיפיים וחיידקיים) רכיבים, ובכך מניב מגוון רחב של הזדמנויות ניסיון במורד זרם. אנו מציעים כי חוקרי עובדים עם קומפלקסי חלבונים יכולים לנצל גישה זו בדרכים רבות ושונות.

במאמר זה, אנחנו מדגימים את תחולתה של שיטת TAP למתחם CycT1-CDK9 היטב מאופיין (הידוע גם בשם קינאז P-TEFb). פלסמידים קידוד Cyclin T1-סטרפטוקוקוס (CycT1: S) ו-FLAG CDK9 (CDK9: F), או CDK9-סטרפטוקוקוס (CDK9: S) ו Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (טבלה 1), היו transfected לתאי HEK293T . בקרות שליליות כללו transfections עם וקטור ריק ואת CDK9: F ...

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

המטרה הכללית של שיטת טיהור זיקה מקושרת (tandem affinity purification) זו היא לבודד קומפלקסים של חלבונים המבוטאים בתאים אוקריוטיים לצורך אפיון ביוכימי ומבנים מולקולריים, וכן לזיהוי אינטראקטורים חדשים ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות המסדירות את תפקודם. שיטה זו מאפשרת טיהור של קומפלקסי חלבונים שלמים מתאים אוקריוטיים, כדי לזהות אינטראקטורים חדשים ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות רגולטוריות המכווננות את תפקודם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רמת טוהר ותפוקה גבוהה של קומפלקסי חלבונים עבור יישומים המשכיים במבחנה (in vitro) לחקר תפקודם ופעילותם.התאים נאספים מניקוי זיקה של STREP כ-48 שעות לאחר הטרנספקציה. יש להסיר את המצע ולהוסיף שמונה מיליליטר של PBS קר. יש לבצע פיפוט מעלה ומטה כדי לנתק את התאים מהפלטה.אספו והעבירו את תרחיף התאים לשפופרת של 15 מיליליטר וסובבו את התאים במהירות של 800 ×g למשך ארבע דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו את עליית ה-PBS. סובבב שוב ב-800 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות של PBS.כדי להתחיל בהליך זה, השביה מחדש כל משק осаח של תאים בנפח של פי חמישה מנפח משק התאים של בופר לזיזה פסיבית, או PLB. העבר את תרחיף התאים לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ערבב את התרחיף קצרות באמצעות וורטקס (vortex), והנח למערבב (nutate) למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.סבבו את תרחיף התאים ב-10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הליזאט המסיס לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה בנפח של 1.5 מיליליטר והשליכו את משקע התאים. שמרו 10% מהנפח הסופי של הליזאט המסיס כ-STREP-AP input ואחסנו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.חשוב להשתמש בחרוזי STREP בשלב הראשון של טיהור באמצעות זיקה (affinity purification), כיוון שקומפלקסים שהופרדו באמצעות חרוזי STREP משחזרים כמות גדולה משמעותית של חלבון מאשר אלו שהופרדו באמצעות חרוזי FLAG. בעזרת טיפ פפית רחב, הסירו את הכמות המתאימה של תרחפת חרוזי STREP בריכוז 50% לצורך טיהור הזיקה. סבבו במ centri-fuge במהירות של 1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסר את הנוזל העליון והוסף 500 µL של PLB לחרו지를. ערבב את תערובת החרוזים במכשיר Nutator למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. סבב שוב בצנטריפוגה להורדת המשקע.לאחר השטיפה השלישית, הסר את הנוזל העליון ותלה את החרו지를 מחדש ב-PLB לנפח סופי של n כפול 40 microliters, כאשר n הוא מספר הדגימות. הוסף 40 microliters של תרחיף חרוזי 50%STREP לכל דגימת ליזאט של תאים והנח לנער בתנועת סיבוב (nutate) למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. במהלך ייצור והשבה של חלבון זה, ניתן להשתמש במספר פלטות של תאים, וניתן לאחד דגימות חלבון זהות שהופקו מליזיס של פלטות שונות עם מנה אחת של חרוזים במהלך טיהור האפיניות של STREP.לאחר שדגימות תמיסות הליזט של התאים ותערובת חרוזי ה-STREP עברו אינקובציה למשך שעתיים, סובב אותן בצנטריפוגה ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שמור את supernatant כ-STREP AP flow through ואחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוסף 500 µL של STREP AP wash buffer one לחרוזים.סבבו את החרוזיים בתמיסת הבאפר במשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס וסבבו במערכת צנטריפוגה ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העליון (supernatant) ושטפו שנית עם 500 µL של STREP AP wash buffer one. לאחר השטיפה השלישית, העבירו את תמיסת החרוזיים לפספרוס של 1.5 mL חדש כדי להפחית את הרקע החלבוני.שטפו פעם רביעית עם STREP AP wash buffer one. לאחר הסבוב, הסירו את הנוזל העליון והוסיפו 500 µL של wash butter two. השגו שיווי משקל של החרו지를 על ידי היפוך המבחנות, ולאחר מכן סובבו במהירות של 1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C.שפכו את הנוזל העליון. אלוטו את החלבון המבוקש באמצעות 50 µL של STREP elution buffer. ערבבו במערבל Vortex במהירות 800 rpm למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.סבבו את החרוזים בצנטריפוגה במהירות של 1,500 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אספו את עלון המערכת (supernatant). פרקציה זו תואמת לדגימת בלידה של STREP AP.שמרו את פראקציית החרו지를 בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לצורך אלוציה שנייה. חלקו 10% מאלוציית ה-STREP AP לצביעת כסף ו/או Western blotting. כדי להגדיל את כמות חומר המוצא עבור immunoprecipitation של FLAG שיתבצע בהמשך, ניתן לאחד את האלוציות הראשונה והשנייה של STREP לצורך התאוששות יעילה יותר של אלוציית ה-FLAG.התחילו את הפרוצדורה באמצעות טיפ פחית רחב כדי להעביר את הכמות המתאימה של תמיסת חרוזי FLAG לשפופרת מיקרוצנטריפוגה. סובבו במהירות של 1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את העלייה והוסיפו 500 µL של בופר שטיפה FLAG לחרוזים.סבבו בצנטריפוגה ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו שוב עם FLAG wash buffer. לאחר השטיפה השלישית, הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את החרוזים ב-FLAG wash buffer לנפח סופי של n כפול 16 µL, כאשר n הוא מספר הדגימות.הוסיפו 16 µL של תרחיף חרוזי FLAG לשארית של אלואציית STREP AP והניחו בנתיגציה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר דגירה של תרחיף חרוזי FLAG ואלואציית STREP AP למשך לילה, המשיכו להמשך immunoprecipitation של FLAG. סובבו את תרחיף חרוזי FLAG ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C.שמור את הנוזל העליון כזרימה דרך (flow through) של FLAG IP ואחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוסף 500 µL של בופר שטיפה FLAG לחרו지를. בצע ערבוב בנטציה (nutation) למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס וסבב במרכזפוגה ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שפוך את עלומת הנוזל (supernatant) ושטוף שוב עם 500 µL של FLAG wash buffer. לאחר השטיפה השלישית, העבר את תמיסת חרוזי החלבון למבחנה חדשה בנפח 1.5 mL (microcentrifuge tube) כדי להפחית את הרקע. שטוף פעם רביעית עם FLAG wash buffer.הסיר את העל-נוזל (supernatant) מהסבב האחרון והוסף לחרוזי הניקוי 30 µL של בופר שטיפה FLAG המכיל 200 ng/µL של פפטיד FLAG. ערבב ב-Vortex במהירות של 800 rpm למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שעתיים, סבב את התרחוף ב-1,500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C.אספו את העלייה (supernatant) ואחסנו אותה בטמפרטורה של four degrees Celsius כאלואציית ה-FLAG IP. בסרטון זה, שיטת ה-Tandem affinity purification, או שיטת TAP, יושמה על קומפלקס ה-Cyclin-T1 CDK9. ביטוי יתר של Cyclin-T1 עם תג STREP ושל CKD9 עם תג FLAG בוצע בתאי HEK293 T.ניסוי הדדי בוצע גם עם CDK9 המסומן ב-STREP ו-Cyclin-T1 המסומן ב-FLAG. ניתוח Western blot מראה כי CDK9 המסומן ב-FLAG התעלה יחד עם Cyclin-T1 המסומן ב-STREP מהחרוזי STREP, אך לא בביקורת השלילית, AP שחסר בו Cyclin-T1 המסומן ב-STREP. שני החלבונים זוהו באלוציה של FLAG, מה שאישר עוד יותר את היווצרות הקומפלקס.תוצאות ה-TAP ההדדיות מראות כי Cyclin-T1 המסומן ב-FLAG הקיא-אלואט (coeluted) יחד עם CDK9 המסומן ב-STREP, דבר המאשש עוד יותר כי האינטראקציה בין Cyclin-T1 ל-CDK9 אינה תלויה באפיטופים שבהם נעשה שימוש. תוצאות ה-TAP וה-TAP ההדדי נותחו גם באמצעות צביעת כסף. הכוכביות מציינות זיהומים שהקיאו-אלואטו יחד.CDK9 מתויג ב-FLAG התמיס יחד עם Cyclin-T1 מתויג ב-STREP מחרוזי STREP, אך לא מה-AP של הביקורת. באלוציה של FLAG שבאחר כך, Cyclin-T1 מתויג ב-STREP התמיס יחד עם CDK9 מתויג ב-FLAG מחרוזי FLAG. באופן דומה, Cyclin-T1 מתויג ב-FLAG התמיס יחד עם CDK9 מתויג ב-STREP מחרוזי STREP, אך לא מה-AP של הביקורת. והקומפלקס של חלבון-חלבון שוחזר ביעילות לאחר שלב ה-FLAG IP השני. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביומיים, החל מהזמן שבו התאים מוכנים לאיסוף, במידה והיא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיל את מספר צלחות התאים לכל ניסוי בהתאם, כדי להבטיח שניתן יהיה להפיק ולגלות כמות מספקת של חלבון. לדוגמה, לצורך זיהוי תתי-יחידות רגולטוריות חדשות ו/או חקר של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות בתתי-יחידות של קומפלקסים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים המחקרים אינטראקציות בין חלבונים לחקור אינטרקטורים חדשים ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות בתאים אוקריוטיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידודם ואפיון של חלבונים באמצעות תגי STREP ו-FLAG.

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

למד שיטת טיהור זיקה טנדם לבידוד קומפלקסי חלבונים ממתאים איקריוטיים באמצעות תגיות STREP ו-FLAG. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקטורים חדשים ומודיפיקציות לאחר תרגום המווסתות פעילות חלבונית.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

גלה סרטונים נוספים