Name: Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למד איסוף, הערכה והקפאה קריוגנית של זרע דולפינים Tursiops truncatus, והשתמש בביציות בקר להפריה הטרולוגית in vitro. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד הזרע המוקפא לשימור מינים ימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודתו מומן על ידי משרד ספרדית של הכלכלה ואת התחרותיות (AGL2015-70140-R ל ד Rizos), AGL2015-66145R א גוטיירז-אדן, ג'יי פ פרז-גוטיירז. סנקה קרן מורסיה (גרנט 20040/נבט/16 ל פ גארסיה-ואסקז)

<ol><li>Montano, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+motility%2C+membrane+status+and+DNA+integrity+of+frozen-thawed+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa+after+sex-sorting+and+recryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation.</a> Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+field+based+chromatin+dispersion+assay+to+assess+sperm+DNA+fragmentation+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+murine+and+bovine+IVF+using+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).</li>
<li>Keller, K. V. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Training_Atlantic_Bottlenose_Dolphins_Tu.html?id=RKstOAAACAAJ">Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination.</a> IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).</li>
<li>Robeck, T. R., O'brien, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+methods+and+precryopreservation+storage+on+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).</li>
<li>Coy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardening+of+the+zona+pellucida+of+unfertilized+eggs+can+reduce+polyspermic+fertilization+in+the+pig+and+cow%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow.</a> Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).</li>
<li>Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Sánchez-Calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+the+sperm+DNA+fragmentation+dynamics+of+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+characterisation+and+artificial+insemination+using+frozen-thawed+spermatozoa+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+deep+intra-uterine+artificial+insemination+using+cryopreserved+sexed+spermatozoa+in+bottlenose+dolphins+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus).</a> Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Madeddu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cooling+rate+on+the+survival+of+cryopreserved+rooster+sperm%3A+Comparison+of+different+distances+in+the+vapor+above+the+surface+of+the+liquid+nitrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen.</a> Anim Reprod Sci. , (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עבור מינים רבים יונקים שונים, ישנם יתרונות מגוונים לשימוש זרע קפוא-הקרת. אלה כוללים את היכולת להעביר חומר גנטי בעל ערך, את הפוטנציאל להפצה ברחבי העולם, הסיכון נמוך של זיהום, את היכולת לשמר את זכר גמטות במשך עשרות שנים. השימוש cryopreserved הזרע חיוני דולפינן, כי מין זה מוגן תחת נספח ב- CITES, אשר מגביל את התחבורה ואת חילופי בעלי חיים בין פארקים ימיים שונים. דולפינים תחבורה היא פעילות היוצרת בעיות לוגיסטיות והסיכונים מסוכן. עם זאת, הימנעות המסיעה אותם יש גם השלכות, כגון הסיכון של החדרת וקרבת הדם אוכלוסיה בשבי של בעלי חיים...

בסיוע טכנולוגיות פריון הן מפותחות חיות בר, כולל יונקים ימיים. העדר רגיש שיטות להערכת ההצלחה המפרה זרע תורם להתפתחות איטית של טכנולוגיות פריון במינים כמו דולפין. זה לא היה עד לאחרונה כי הפרמטרים הבסיסיים החלוצי של דולפינן (והוולדות truncatus) היו שדווחה1,2. עם זאת, משתנים כגון תנועתיות, מורפולוגיה, למרות בשימוש נרחב, לתת מידע מוגבל על יעילות הרבייה. הסימן הכי טוב של איכות הזרע הוא הערכת פוטנציאל המפרה.
לאחרונה, הקבוצה שלנו להשתמש בשיטה כדי להעריך דולפין הזרע להפרות את הפוטנציאל על-ידי הערכת היווצרות pronuclear זכר ו/או היברידית היווצרות העובר לאחר IVF heterologous באמצעות zona oocytes שור שלם3. השימוש של דולפין-שור heterologous IVF יש יתרונות חשובים מעל הומולוגי להפריה חוץ גופית, כמו זה מתגבר על הקושי בהשגת דולפין oocytes ואסטמה ומקילה על השימוש נבדק היטב במבחנה oocyte שור ההבשלה במערכות. כדי למנוע ירידה לפרטים מינים, heterologous ההפריה מבוצעת בדרך כלל בהעדר מסוג ZP. למרות שהיא מתירה על ההערכה ליכולת של spermatozoa acrosome הגיב להתמזג עם קרום vitelline, זה מחליש את ההערכה של תכונות אחרות הקשורות הפריה. ההליך המתואר משתמשת zona oocytes ללא פגע, מאפשר הערכת הפרמטרים הבאים: איגוד zona הזרע מצורף, חדירה, polyspermy, היווצרות pronuclear ואני היברידית העובר המחשוף.
כאן, אנו מציגים מספר פרוטוקולים עבור איסוף זרע, זרע בסיסית ניתוח, spermatozoa קפוא, כמו גם הערכת הפונקציונליות זרע דולפין על-ידי הערכת זכר pronuclear ו/או היברידית העובר היווצרות לאחר heterologous IVF באמצעות zona ללא פגע oocytes שור.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP בינוני</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>4 בארות כלים</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע צפיפות BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>פתרון כביסה Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tris Borate EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB agarose</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq flexi buffer</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB</td><td>agarose Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>טאק פולימראז</td><td>פרומגה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS ביולוגית בע"מ</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה מקלר</td><td>תא ספי רפואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תומא</td><td>הכט-עוזר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmeter MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר מיקרו אוסמומטר מתקדם 3300</td><td>נורווד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב</td><td>Projectes y Serveis R+D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אופטיקה אפיפלואורסצנטית Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal assistant 4.02 תוכנה</td><td>Bio-Rad</td><td>תוכנת ניתוח</td><td></td>תלת מימד</tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה של גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV תאורה</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR תרמי מחזורי פרימוס 96 פלוס</td><td>MWG AG ביוטק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו heterologous הפריה

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

השימוש של דולפין cryopreserved spermatozoa מקל על חילופי חומר גנטי בין פארקים ימיים והופך spermatozoa נגיש למעבדות ללימודים לקדם את ההבנה שלנו של יונקים ימיים רבייה. Heterologous להפריה חוץ גופית, תחליף הומולוגי להפריה חוץ גופית, יכול לספק אמצעי כדי לבדוק הזרע פוריות אפשריות; ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם; כדי למנוע את השימוש oocytes דולפין בעל ערך, אשר קשה להשיג. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה כדי לאסוף cryopreserve spermatozoa דולפין. איסוף זרע מתבצע על ידי גירוי ידני על דולפינים מיומן. הקפאה קריוגנית מושגת באמצעות הרחבה מבוסס חלמון ביצה של טריס גליצרול. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול זה מתאר heterologous חוץ-גופית בשיטת דולפין spermatozoa, oocytes שור ומוודא כי מהות היברידית וכתוצאה מכך העובר באמצעות PCR. הפריה heterologous מעלה שאלות על הפריה והוא יכול לשמש ככלי ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם. בנוסף, ההצלחה של הפריה חוץ גופית heterologous מדגימה את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי לבדוק הזרע דולפין הורס את ביצועיו, שווה בדיקה נוספת.

כל תוצאות, טבלאות או איורים (1 ו 2) המובאת כאן שוחזר עם הרשאה3.
דולפין spermatozoa יש תנועתיות גבוה לאחר הקפאה והפשרה
שופך הדולפין קפוא-הקרת הראה באחוזים (% ± SD) של 84.5 ± 5.3 הכוללת תאי ואין 69.1 ± 5.1 spermatozoa תאי מתקדמת. במונחים של תנועתיות, המספרים האלה הם נציג של spermatozoa cryopreserved באיכות גבוהה.
<p class="jove_step" fo:keep-toge...

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה עבור אוסף spermatozoa דולפין, הקפאה קריוגנית וביצועים heterologous IVF באמצעות oocytes שור.

Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להעריך את התפקוד של זרע דולפין שנשמר בהקפאה באמצעות הפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) הטרולוגית, תוך שימוש בתאי זרע של דולפין שנשמרו בהקפאה וביציות של בקר עם zona pellucida שלמה. בסרטון זה, נראה כיצד לאסוף, להעריך ולשמר בהקפאה תאי זרע של דולפין. לאחר מכן, נעריך את האינטראקציה של הזרע ואת החדירה שלו עד לרמה של ה-zona pellucida.היווצרות פרו-גרעין זכרי וחילוק עוברים היברידיים. סוגיה קריטית בפיתוח טכנולוגיות רבייה מסייעות היא הערכת תפקוד הזרע, אשר מובאת בצורה הטובה ביותר על ידי יכולתו להפריה. טכניקות IVF הומולוגיות משמשות בדרך כלל להערכת תפקוד הזרע, אך השגת ציטות של דולפין היא קשה מאוד.היתרון העיקרי של הפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) הטרולוגית הוא פשטותה. ניתן להשיג ביצי בקר בקלות, וניתן לעבדן בתנאי מעבדה (in vitro) באמצעות פרוטוקולים שנבחנו היטב. כמו כן, נדגים כיצד לשמר בהקפאה זרע של דולפין באמצעות אדי חנקן נוזלי.טכניקה פשוטה שאינה דורשת ציוד הקפאה מתמחה. לצורך הליך זה, יש לאמן את הדולפין הזכר מראש במשך שישה חודשים באמצעות חיזוקים חיוביים. הרשו לבעל החיים לשכב במנח גב (dorsal recumbency) סמוך לשפת הבריכה.בשלב זה בצעו גירויים מגעים שונים על ידי לחיצה עדינה על האזור הקרניאלי של התלם הגניטלי כדי לעודד פליטה רצונית של הפין. לאחר השגת זקפה מלאה, כוונו את קצה הפין לכלי סטרילי. שמרו את הזרע בטמפרטורה של 37 degree Celsius עד לביצוע האנליזה.במידת הצורך, חזור על הגירוי המישושי לאיסוף פליטות עוקבות, תוך שימוש בכוס פוליפרופילן חדשה בכל פעם. מיד לאחר האיסוף, העריך את הפליטות תוך שמירתן בטמפרטורה של 37 °C לאורך כל התהליך. קבע את הנפח, הצבע, ה-pH והאוסמולריות של הפליטות.לאחר מכן, מתוך מנה של 10 µL, קבע את ריכוז התבويضות (spermatozoa) באמצעות תא ספירה. הנח את הזרע על עלית זכוכית אחת על במה של מיקרוסקופ מחוממת בטמפרטורה של 37 °C. השתמש במערכת ניתוח ממוחשבת כדי להעריך את ניידות התבويضות.במידת הצורך, יש לדלל את הזרע עם תוצר מדיום הפריה (fert medium) כדי להקל על הצפייה. לאחר מכן, באמצעות מנה של 20 µl של השכבה, יש להעריך את חיוניות ומורפולוגיית הזרע באמצעות צביעה קונבנציונלית ב-Eosin Nigrosin ו-Spermac. לצורך הקפאה (cryopreservation), העבירו תחילה את דגימת הזרע לשפופרת צנטריפוגה.לאחר מכן, השקיעו את תאי הזרע ב-250 G למשך חמש דקות. כעת, במהלך חמש דקות, בצעו בדילול איטי של 1:1 של דגימת הזרע עם באפר מבוסס חלמון ביצה (trace egg yolk based buffer) המכיל 1.5% glycerol. לאחר מכן, קררו את הדגימה ב-5°C למשך 1.5 שעות.שעה לאחר מכן, חזור על הדילול ביחס של 1:1 עם אותו בופר, ולאחר מכן שמור את תרחיף הזרע בטמפרטורה של 5 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבר את התרחיף לקשים בנפח של 0.25 ml ואטום אותם באמצעות חום. הנח את הקשים במעמד ותלה את המעמד בגובה של 4.5 cm מעל חנקן נוזלי למשך 10 דקות.לאחר מכן, טבלו את הקשים בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בשחלות בקר שנשמרו בתמיסת מלח חמה ונאספו בשלוש השעות האחרונות. התחילו בשטיפת השחלות שלוש פעמים בתמיסת מלח.שמר אותם תמיד בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, שאב את כל הזקיקים בגודל 2 mm עד 8 mm באמצעות מחט במידה 18 ומזרק. העבר למבחנה של 50 mL והמת 15 דקות לשקיעת הביציות.לאחר מכן, הסר את העליון (supernatant) ותלה את הזקיקים מחדש ב-PBS. אסוף את ה-COCs תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בצלחות של 90 מילימטר. בחר אוקיציטים מדרגה אחת ושתיים בעלי ציטופלזמה הומוגנית שמוקפים בלפחות שלוש שכבות של תאי קומולוס.העבירו את התאים אלו ל-PBS בצלחת של 35 מילימטר. לאחר מכן, שטפו את ה-COCs שלוש פעמים ב-PBS ופעם אחת במצע הבשלה. לאחר מכן, העמיסו את ה-COCs לתוך צלחות בעלות ארבעה בארות, בקצב של 50 COCs ו-500 milliliters של מצע הבשלה לכל בארה, ואז דגרו את ה-COCs למשך 24 שעות.ברגע שתאי העמולוס (cumulous cells) של הביציות מתחילים להתרחב, הן נחשבות לבשלות. לאחר מכן, שטפו אותן פעמיים במדיום הפרייה (fert medium) והעבירו אותן למנות של 50 ביציות לצלוחית בעלת ארבעה בארות, עם 250 milliliters של מדיום הפרייה לכל באר. כעת, החזירו את ה-COCs לאינקובטור והכינו את הזרע להפרייה.הפשיר בבן-מריה בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 50 שניות קש קפוא המכיל זרע של דולפין וקש המכיל זרע של בקר. לאחר מכן, העריך את תנועתיותם באופן סובייקטיבי באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast). לאחר מכן, העבר את דגימת הזרע לשפופרת עם מדרג צפיפות וסבב אותה בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-250 G. הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant).הוסיפו בחזרה 3 mL של תמיסת השטיפה. לאחר מכן, השביו את הזרע למצב של סספנזיה באמצעות ערבוב עדין. כעת צנטריפוגו את המבחנה שוב והסירו את רוב הנוזל העליון (supernatant), כך שהזרע יישאר ב-300 µL.כעת ספרו את התבويضות והתאימו את הריכוז לשני מיליון למילליטר בדילול עם תווך הפרייה (fert medium). הוסיפו 250 microliters מהתמיסה לכל באער של ציותים (oocytes) כדי להגיע לריכוז סופי של מיליון תבويضות למילליטר. תחת מיקרוסקופ סטריאו, צפו בציותים הבשלים והמורחבים המוקפים בתבويضות ניידות של בקר או של דולפין, כאשר אלו קטנות יותר מתבويضות בקר.דגרו את הגמטות יחד למשך 18 שעות. כדי להעריך את האינטראקציה של תאי הזרע עם ה-zona pellucida, הוציאו 20 ציטות (oocytes) מהצלחת כ-2.5 שעות לאחר תחילת הדגירה המשותפת. הסירו את תאי הזרע שהינם קשורים באופן רופף על ידי פיפטור נמרץ באמצעות פיפט פסטור בעל פתח צר.בשלב הבא, קבעו וצבעו את התאי הביציים עם ווים ל-3342. העבירו את התאי הביציים הצבועים באופן פרטני לטיפות של 2 µL של מדיום קיבוע וספרו את מספר תאי הזרע ההנצמדים לתאי הביציים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. החל מ-18 שעות של אינקובציה משותפת, העבירו את 10 הזיגוטים המשוערים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL המכילה 2 mL של PBS, ובצעו ערבול עדין בוורטקס למשך שלוש דקות כדי להסיר את תאי הקומולוס.שטוף פעמיים ב-PBS, קבע וצבע כפי שתיארנו בעבר. בנוסף, לאחר 18 שעות של אינקובציה משותפת, אסוף 50 זיגוטים לתרבית. ערבב אותם בוורטקס ב-PBS למשך שלוש דקות ולאחר מכן שטוף אותם פעמיים ב-PBS.לאחר השטיפה, בחרו זיגוטים בעלי ציטופלזמה הומוגנית לצורך תרבית. העבירו אותם בקבוצות של 25 לתוך טיפות של 25 µL של נוזל חצוצרה סינתטי (synthetic oviductal fluid) המועשר ב-5% fetal calf serum. לאחר מכן, דגרו את הזיגוטים המשוערים למשך 48 שעות והעריכו את שיעור ההחלוקה שלהם באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.בהמשך, הערך את הרכבם הגנטי באמצעות PCR בהתאם לפרוטוקול הכתוב. תאי הזרה של פליטות דולפינים שהופשרו לאחר הקפאה היו בעלי מוביליות של כ-85% ומוביליות פרוגרסיבית של 70%. מספרים אלו מאפיינים תאי זרה איכותיים שנשמרו בקריו-שימור.זרע של דולפינים נצמד לאזור הפלוקידה (zona pellucida) של בקר לאחר 2.5 שעות של אינקובציה משותפת באחוז גבוה יותר מאשר זרע של בקר. זרע הדולפינים היה מסוגל לחדור את אזור הפלוקידה של ציטות בקר שלמות, מה שהוביל להיווצרות פרו-גרעינים ולהחלוקה תאית. בקבוצת ההפריה ההטרו-לוגית חוץ-גופית (in vitro) לא נצפתה פוליספרמיה.ההגעה לשיא באחוז ההיווצרות של הפרונוקלאוס (גרעין קדמי) התרחשה לאחר 24 שעות. היווצרות הפרונוקלאוס הייתה מהירה יותר בקבוצה ההומולוגית. שיעור הביתול (cleavage) לאחר 48 שעות היה נמוך יותר בהפריות הטרולוגיות מאשר בהפריות הומולוגיות.בדיקת PCR אישרה את נוכחותו של חומר גנטי של דולפין בעוברים ההיברידיים. נבדקו פריימרים לגן הריבוזום 18 s של הדולפין, אשר הניבו תוצר של 190 base pair. נתיבים 1 עד 30 הם היברידים של דולפין ובקר.הביקרים היו DNA של דולפין בנתיבי S, ושני עוברי בקר בנתיבי C. הפרוטוקול המוצג להפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) אוטולוגית הראה כי דולפיני אף-בקבוק מסוגלים להפריה של ציטות בקר שלמות, מה שמוביל ליצירת עוברי היבריד.פיתוח ואופטימיזציה נוספים של טכניקה זו יקלו על הערכת התפקודיות של זרע דולפינים. הקפאה (Cryopreservation) של תאי זרע של דולפינים באמצעות אדי חנקן נוזלי היא שיטה זולה, מהירה ופשוטה, המניבה פרמטרים טובים של מוטיליות עמוקה ומאפשרת הפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) הטרולוגית מוצלחת. התצפית לפיה זרע של דולפינים מסוגל להפריה של ציטות בקר פותחת מרחב חדש למחקר על הרבייה של הדולפין ושל בעלי חיים ימיים אחרים.כמו כן, הדבר מעלה שאלות לגבי מנגנוני ההפריה שנותרו במידה רבה ללא מענה.

bottlenose-dolphin-tursiops-truncatus-spermatozoa-collection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

פרוטוקול זה מתאר מסלול אוטומטי למחצה לשיפור היעילות והיכולת של עיבוד ושימור בהקפאה של זרע ממיני אלמוגים מאוימים, במטרה להבטיח מגוון גנטי ולתמוך במאמצי שיקום שוניות.

זרימת עבודה חצי-אוטומטית לשימור בהקפאה של זרע אלמוגים לתמיכה בביו-בנקאות ובחקלאות ימית

פרוטוקול זה מציג טכניקת מיקרו-שאיירה פשוטה לבידוד תאים סומטיים (SCs) חיוניים מזרע סוסי מוקפיא. בניגוד לגישות המסורתיות, טכניקה זו מונעת תרביות ממושכות במבחנה ומתגברת על זיהום זרע, ומאפשרת שימוש מיידי בשכפול תאים סומטיים.

טכניקת מיקרואספירציה פשוטה לבידוד תאים סומטיים מזרע סוסי משומר כתורמים גרעיניים לשכפול

למד איסוף, הערכה והקפאה קריוגנית של זרע דולפינים Tursiops truncatus, והשתמש בביציות בקר להפריה הטרולוגית in vitro. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד הזרע המוקפא לשימור מינים ימיים.

Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה

גלה סרטונים נוספים