תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

המטרה הכללית של הליך זה היא להרחיב תאי אפיתל של הוושט המופקים מחולה, מביופסיות אנדוסקופיות, כדי לחקור מחלות של הוושט, או כדי ליצור פיגום (scaffold) תלת-ממדי של הוושט לצורך מידול בהמשך או להחלפת רקמת הוושט. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבין טוב יותר את תפקידם של תאי אפיתל הוושט במחלות של הוושט. ניתן להשתמש בהם גם כדי ליצור פיגומים תלת-ממדיים למידול או להשתלה.

היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להפיק תאי אפיתל ספציפיים למטופל מפיסת רקמה קטנה מאוד, ללא צורך בשינויים גנטיים או קבועים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנת הפתוגנזה של דלקת ושט של נאפילים (eosinophilic esophagitis), כמו גם פיתוח טיפולים עבור אטרזיה של הוושט ודלקת ושט של נאפילים. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקשו להסיר לחלוטין את תאי המזינה (feeder cells) לפני איסוף תאי אפיתל של הוושט אנושי, וזאת כדי לשמור על טוהר התרבית.

את הטכניקה הזו ידגים כריסטופר פוסטר, טכנאי מהמעבדה שלנו. לפחות שלושה ימים לפני קבלת דגימות המטופל, זרעו את תאי ה-3T3 במצע גידול 3T3 בבלילי T75 שעברו טיפול לרקמות. ביום הניסוי, רגע לפני קבלת הדגימות,נתקו את תאי ה-3T3 באמצעות 5 milliliters של 0.25% Trypsin-EDTA לכל בליל למשך כחמש דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

כאשר רוב התאים צפים, הוסיפו 5 milliliters של מצע 3T3 כדי לעצור את התגובה, והעבירו את תרחיף התאים לפקתול קוני של 15 milliliters לצורך צנטריפוגה. השעיו מחדש את המשקע במצע לצורך ספירה. לאחר מכן, העבירו את מספר התאים המתאים לזריעה לפקתול קוני של 15 milliliters.

בשלב הבא, הוסיפו 25 milliliters של מצע 3T3 טרי לתאים לצורך הקרנה ב-3000 rads. לאחר מכן, אספו את התאים באמצעות צנטריפוגה, והשביו את המשקע במצע תכנות מותנה בנפח של five milliliters לכל צלחת 100 millimeter. לאחר קבלת כשיש שש ביופסיות של ושט במהלך האנדוסקופיה, העבירו שש ביופסיות למבחנה קונית של 15 milliliter המכילה מצע קרטינוציטים מלא ללא סרום, בתוספת Primocin, על קרח רטוב.

הניחו ביופסיה אחת בחמישה מיליליטר של פורמלין בבופר על קרח רטוב, והניחו ביופסיה אחת בתבנית קריו (cryomold) קטנה לביופסיה המכילה חומר הטמעה. טבלו מיד את התבנית בכלי עם קרח או פנטאן בתוך מיכל של חנקן נוזלי. לאחר שהרקמה קפאה, הניחו את תבנית הקריו בשקית דגימה על קרח יבש, בתוך מיכל קלקר (פוליסטירן).

לאחר מכן, הניחו את מבחנות הביופסיות בתוך שק הניתן לאטימה בתוך קופסת משלוח עם סימון סיכון ביולוגי המכילה קרח רטוב, ואטמו וסמנו את שני המכלים במדבקת סיכון ביולוגי לצורך ההובלה למעבדה. עם ההגעה למעבדה, העבירו מיד את הביופסיה הקפואה לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך חיתוך בהמשך או הפקת RNA. הניחו את הדגימה בפורמלין במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקיבוע למשך הלילה, והניחו את שאר הביופסיות בצנטריפוגה.

החליפו את המצע בכל מבחנה ב-10 milliliters של תמיסת dispase, ואטמו את המבחנות לדגירה של 15 דקות בטמפרטורה של 37 degree Celsius באמבט מים. בסיום הדגירה, סובבו שוב את הביופסיות בצנטריפוגה (spin down), ותלו את הדגימות מחדש ב-five milliliters של 0.25%Trypsin-EDTA. העבירו את הביופסיות לפתחית סטרילית אחת בנפח 100 milliliter, והשתמשו בשני תערים סטריליים כדי לקצוץ את הרקמות באופן דק ככל האפשר.

לאחר שכל הרקמה נחתכה, העבירו את שברי הרקמה למבחנה חדשה בנפח 15 מיליליטר, ושטפו את הפלטה פעמיים עם חמישה מיליליטר של 0.05%Trypsin-EDTA. איספו את שטיפות הרקמה למבחנה, והחזירו את הדגימות לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, סנטריפוגו את חלקי הדגימה שעברו עיכול ואת תאי ההזנה (feeder cells), ותלו את המשקעים בנפח של חמישה מיליליטר של מדיום לתכנות מחדש מותנה (conditional reprogramming medium) כל אחד.

לאחר מכן, שלבו את דגימות התאיים המזינים (feeder cells) ואת דגימות הביופסיה מהוושה לשפופרת אחת, והוסיפו לתאים מעכב rho kinase, או מעכב ROCK, לצורך תרבית משותפת (co-culture) על צלחת תרבית רקמות מצופה ג'לטין. לאחר כחמישה ימים, הסירו את המצע ואת חלקי הביופסיה הקצוצים באמצעות שאיבה, ושטפו את הצלחת שתיים עד שלוש פעמים עם 5 milliliters של PBS סטרילי. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו לצלחת 10 milliliters של מצע טרי בתוספת מעכב ROCK, והחזירו את התרבית המשותפת לאינקובטור עד שהתאים יגיעו ל-70% confluency.

להרחבת התאים, הסיר את תאי המזינה באמצעות חמישה מיליליטרים של 0.05%Trypsin-EDTA בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך לא יותר משתי דקות וחצי. שטוף את הצלחת עם חמישה מיליליטרים של PBS טרי כדי להסיר את תאי המזינה הצפים, והוסף חמישה מיליליטרים של 0.25%Trypsin-EDTA לדגירה של חמש עד 10 דקות עד שתאי דגימת הביופסיה ישתחררו מהקרקעית של הצלחת. לאחר מכן, עצור את התגובה עם 10 מיליליטרים של מצע טרי, והעבר את התאים לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר לצורך סנטריפוגציה.

שששוב את המשקע במצע תכנון מחדש מותנה (conditional reprogramming medium) טרי לצורך ספירה, ולאחר מכן, העבר 1×10⁶ תאי ושט של בני אדם לשפופרת קונית חדשה. הוסף 1.2×10⁶ תאי 3T3 מקרינים לתאי הושט, והשלם את הנפח הכולל בשפופרת ל-15 מיליליטרים באמצעות מצע תכנון מחדש מותנה טרי. לאחר מכן, הוסף מעכב ROCK טרי לתאים, והעבר את התרבית המשולבת (co-culture) לצלחון בן 150 מילימטרים מצופה ג'לטין.

כדי להקפיא את תאי הוושא לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, הסירו את תאי המזינים (feeders) ונתקו את תאי הוושא כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה קונית חדשה בנפח של 50 מיליליטר לצורך סנטריפוגציה, והשבילו מחדש את המשקע בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-2 מיליליטר של תמיסת הקפאה. לאחר מכן, העבירו 2 מיליליטר של תאים לכל מבחנה להקפאה (cryovial) המסומנת מראש, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לפני העברתן לאחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי.

מושבות של תאים אפיתליאליים ייווצרו בערך תוך ארבעה עד חמישה ימים, ויהיו מוקפות בתאי מאכילה מסוג פיברובלסט. ככל שמושבות אלו יתרחבו, הן יתמזגו עם מושבות אחרות כדי ליצור מושבות גדולות יותר. ברגע שהתרבית תגיע ל-70% confluence, יהיה צורך להרחיב אותה.

לאחר הסרת תאי המזינים (feeder cells), ניתן לבצע טריפסינציה לתאי האפיתל הדבקים ולהעבירם לתרבית חדשה על תאי מזינים מקרינים. אפיון פנוטיפי של תאים אלו באמצעות qRT-PCR מגלה רמות ביטוי גבוהות יותר של P63, סמן של תאי פרוגניטור, בסיום המעבר הראשון בהשוואה לדגימת הביופסיה הראשונית, מה שמעיד על כך שהתאים עברו תכנות מחדש למצב דמוי גזע פרוגניטורי יותר. כאשר תאים אלו מועברים לצלחות תרבית רקמה רגילות, ביטוי ה-P63 פוחת, בעוד שביטוי חלבון צומת הדוק אחד, או TJP1, וביטוי E-cadherin עולים, מה שמעיד על שינוי פנוטיפי מתא פרוגניטור לתא אפיתלי מובחן יותר.

ניתוח פלוו-ציטומטרי של התאים לאחר מעבר ראשון מעיד כי יותר מ-90% מהתאים הם חיוביים גם ל-EpCAM. צביעה אימונופלואורסצנטית מראה כי התאים שומרים על ביטוי של סמן אפיתליאלי, סמן פרוגניטורי, סמן פרוליפרציה וחלבון צמיות (tight junction) אפיתליאלי. זמן הכפיל של תאי וריד מהווה ממטופל ללא מחלה חושב להיות כ-36 עד 40 שעות, אם כי סביר שזמן הכפיל של תאים חולים יהיה איטי יותר.

לאחר רכישת מיומנות, יש להשלים טכניקה זו בתוך כשעה אחת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, הקפידו להשתמש בטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום, ועבדו במהירות כדי לשמור על חיות התאים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע בדיקות אחרות, כגון תרבית transwell, כדי להעריך אילו אנטיגנים גורמים לדלקת בוושט או לפתוגנזה.

לאחר פיתוחו, בדיקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים לזיהוי אנטיגנים מעוררים הגורמים לאוזינופיליה של הוושט, וכן לאפשרויות טיפול חדשות עבור מטופלים אלו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידולם והתרבתו של תאי אפיתליום של הוושט מביופסיות אנדוסקופיות לשימוש במחקר של מחלות הוושט, או ליצירת מודלים תלת-ממדיים. אל תשכחו כי עבודה עם מכשירים חדים ורקמות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת.

הקפידו להשליך מכשירים חדים בצורה נכונה, ולהשתמש בשיטות עבודה בטוחות לבטיחות ביולוגית.