תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להרחיב את תאי האפיתל של הוושט שמקורם בחולה מביופסיות אנדוסקופיות כדי לחקור מחלות וושט, או ליצור פיגום וושט תלת מימדי למידול במורד הזרם או החלפת רקמת הוושט. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבין טוב יותר את תפקידם של תאי אפיתל בוושט במחלת הוושט. הם יכולים לשמש גם כדי לראות פיגומים תלת מימדיים לדוגמנות או השתלה.

היתרון בטכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו ליצור תאי אפיתל ספציפיים למטופל מפיסת הרקמה הקטנה מאוד ללא צורך בשינויים גנטיים או קבועים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנת הפתוגנזה של דלקת הוושט האאוזינופילית, כמו גם פיתוח טיפולים לאטרזיה של הוושט ודלקת הוושט האאוזינופילית. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו ביכולת להסיר לחלוטין את תאי ההזנה לפני קצירת תאי אפיתל הוושט האנושיים על מנת לשמור על טוהר.

מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה כריסטופר פוסטר, טכנאי מהמעבדה שלנו. לפחות שלושה ימים לפני קבלת דגימות המטופל, יש להצמיד את תאי 3T3 למדיום תרבית 3T3 בצלוחיות T75 שטופלו ברקמות. ביום הניסוי, רגע לפני קבלת הדגימות, יש לנתק את תאי ה-3T3 עם 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוק למשך כחמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר רוב התאים צפים, הוסף 5 מיליליטר של מדיום 3T3 כדי לעצור את התגובה, והעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במדיום לספירה. לאחר מכן, העבירו את מספר התאים המתאים לזריעה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של מדיום 3T3 טרי לתאים להקרנה ב-3000 רד. לאחר מכן, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה במדיום תכנות מותנה בחמישה מיליליטר לצלחת של 100 מילימטר. לאחר קבלת כשש ביופסיות של הוושט בזמן האנדוסקופיה, יש להניח שש ביופסיות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מדיום קרטינוציטים שלם ללא סרום, בתוספת פרימוצין על קרח רטוב.

הנח ביופסיה אחת בחמישה מיליליטר של פורמלין חוצץ על קרח רטוב, והנח ביופסיה אחת בקריומולד ביופסיה קטנה המכילה מדיום הטבעה. טבלו מיד את התבנית בכוס קרח או פנטן בתוך מיכל חנקן נוזלי. לאחר הקפאת הרקמה, הניחו את הקריומולד בשקית דגימה על קרח יבש, במיכל קצף פוליסטירן.

לאחר מכן, הניחו את צינורות הביופסיות בתוך שקית אטומה בתוך קופסת משלוח עם תווית הסיכון הביולוגי המכילה קרח רטוב, ואטמו ותייגו את שני המיכלים במדבקת ביו-סכנה להובלה למעבדה. עם הכניסה למעבדה יש להעביר מיד את הביופסיה הקפואה לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס לצורך חתך במורד הזרם או מיצוי RNA. מניחים את הדגימה בפורמלין במקרר של ארבע מעלות צלזיוס לקיבוע לילה ומניחים את הביופסיות הנותרות בצנטריפוגה.

החלף את המדיום בכל צינור ב -10 מיליליטר של תמיסת דיספאז, ואטום את הצינורות למשך 15 דקות דגירה ב -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בתום הדגירה יש לסובב שוב את הביופסיות, ולהשעות מחדש את הדגימות בחמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA. העבירו את הביופסיות לצלחת סטרילית אחת של 100 מיליליטר, והשתמשו בשני סכיני גילוח מעוקרים כדי לטחון את הרקמות דק ככל האפשר.

לאחר שכל הרקמה נחתכה, העבירו את שברי הרקמה לצינור חדש של 15 מיליליטר, ושטפו את הצלחת פעמיים עם חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA. אסוף את השטיפות בצינור, והחזיר את הדגימות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את חתיכות הדגימה המעוכלות ואת תאי ההזנה, ותלה מחדש את הכדורים בחמישה מיליליטר של מדיום תכנות מחדש מותנה, כל אחד.

לאחר מכן, שלבו את דגימות הביופסיה המזינה והוושט לצינור אחד, והוסיפו rho kinase, או מעכב ROCK, לתאים לתרבית המשותפת שלהם על צלחת תרבית רקמה מצופה ג'לטין. לאחר כחמישה ימים, הסר את חתיכות הביופסיה הבינונית והטחונה על ידי שאיפה, ושטוף את המנה פעמיים-שלוש עם חמישה מיליליטר PBS סטרילי. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו לצלחת 10 מיליליטר של מדיום טרי בתוספת מעכב ROCK, והחזירו את התרבות המשותפת לחממה עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%.

כדי להרחיב את התאים, הסר את המזינים עם חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משתי דקות וחצי. שטפו את הצלחת בחמישה מיליליטר PBS טרי כדי להסיר את תאי ההזנה הצפים, והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA למשך חמש עד 10 דקות עד שתאי דגימת הביופסיה משתחררים מתחתית הצלחת. לאחר מכן, עצרו את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום טרי, והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה במדיום תכנות מחדש מותנה טרי לספירה, ועכשיו, קחו בחשבון 10 פעמים עד 6 תאי הוושט האנושיים לתוך צינור חרוטי חדש. הוסף 1.2 כפול 10 לתאי 3T3 המוקרנים השישי לתאי הוושט, והביא את הנפח הכולל בצינור ל-15 מיליליטר עם מדיום תכנות מחדש מותנה טרי. לאחר מכן, הוסיפו מעכב ROCK טרי לתאים, וצלחו את התרבות המשותפת על צלחת מצופה ג'לטין בקוטר 150 מילימטר.

כדי להקפיא את תאי הוושט לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס, הסר את המזינים ונתק את תאי הוושט כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר לצנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה בתא אחד כפול 10 עד שישי לכל שני מיליליטר של ריכוז מדיום קפוא. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטר של תאים לכל קריוביאל מסומן מראש, ואחסנו את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לפני העברתן לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך.

מושבות תאי אפיתל ייווצרו תוך כארבעה עד חמישה ימים, ויהיו מוקפות בתאי הזנה פיברובלסטים. ככל שהמושבות הללו יתרחבו, הן יתמזגו עם מושבות אחרות ויצרו מושבות גדולות יותר. ברגע שהתרבית הפכה ל-70%, יש להרחיב אותן.

לאחר הסרת תאי ההזנה, ניתן לטריפסון את תאי האפיתל הדבקים ולצפות אותם מחדש על תאי הזנה מוקרנים חדשים. אפיון פנוטיפי של תאים אלה באמצעות qRT-PCR חושף ויסות מוגבר של P63, סמן תאי אב בסוף המעבר הראשון, בהשוואה לדגימת הביו-ספי הראשונית, מה שמצביע על כך שהתאים תוכנתו מחדש למצב דמוי גזע אב יותר. כאשר תאים אלה מועברים ללוחות תרבית רקמה רגילים, ביטוי P63 פוחת וביטויי חלבון צומת הדוק אחד, או TJP1, וביטויי E-cadherin גדלים, מה שמדגים מעבר פנוטיפ מתא אב לתא אפיתל מובחן יותר.

ניתוח זרימה ציטומטרי של התאים לאחר המעבר הראשון מצביע על כך שיותר מ-90% מהתאים חיוביים גם ל-EpCAM. צביעה אימונופלואורסצנטית מדגימה כי התאים שומרים על סמן האפיתל, סמן האב, סמן ההתפשטות וביטוי חלבון הצומת ההדוק של האפיתל. זמן ההכפלה של תאי הוושט מחולה שאינו חולה חושב כ-36 עד 40 שעות, אם כי סביר להניח שזמן ההכפלה של תאים חולים יהיה איטי יותר.

לאחר השליטה, יש להשלים טכניקה זו תוך כשעה. בעת ניסיון הליך זה, הקפד להשתמש בטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום, והקפד לעבוד במהירות כדי לשמור על כדאיות התאים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות, כגון תרבית טרנסוול, על מנת להעריך אילו אנטיגנים גורמים לדלקת בוושט, או פתוגנזה.

לאחר הפיתוח, בדיקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לזהות אנטיגנים מעוררים הגורמים לדלקת הוושט האאוזינופילית, כמו גם אפשרויות טיפול חדשות לטיפול בחולים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהרחיב תאי אפיתל של הוושט מביופסיות אנדוסקופיות לשימוש בחקר מחלות הוושט, או יצירת מודלים תלת מימדיים. אל תשכח שעבודה עם מכשירים חדים ורקמות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת.

הקפד להשליך מכשירים חדים כראוי, והשתמש בשיטות בטיחות ביולוגיות טובות.