סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של פרוטוקול סובלימציה זה היא לספק תהליך הכנת דגימה מפורט וקל לביצוע, לאיתור גנגליוזידים בניסויי ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כולל ההתפלגות האנטומית והתפקוד של גנגליוזידים, הן במוח הבריא והן בפתולוגיה של המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים אותה להדמיה באיכות גבוהה של מיני שומנים רבים, מעט שינויים בפרוטוקול.

כדי להתחיל בהליך זה, חלץ רקמת מוח מהחולדה והתכונן לקריוסטט כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן מקם את הרקמה בקריוסטט. חתכו את הרקמה עד למיקום האנטומי הרצוי.

ודא שעובי החיתוך הוא בין שמונה ל-12 מיקרון. בעזרת המוט נגד גלגול קריוסטט, חתכו לאט את קטע הרקמה השטוח. חורים או סימונים על הרקמה יכולים להתרחש אם מיקום מוט הגלילה שגוי או אם הלהב עמום.

העבר את הרקמה למרכז משטח החיתוך בעזרת מברשות צבע נקיות. כדי למפות את הרקמה, הקפיאו שקופיות מוליכות או לוחות מתכת על ידי הנחתם בקריוסטט בזמן החיתוך. כאשר המגלשה קפואה לחלוטין, העבר בזהירות את רקמת החתך אל השירות המוליך של המגלשה באמצעות מברשות צבע נקיות.

לאחר שכל חלקי הרקמה ממוקמים נכון על המגלשה, הניחו אצבע מתחת לשקופית מול הרקמה ולחצו עד שהחלק מפשיר. לאחר מכן הניחו את השקופיות עם טישו בחומר ייבוש למשך חמש עד 10 דקות. לחלופין, השתמש בשקופית חמה ולחץ עליה קלות, כשהצד המוליך כלפי מטה, כנגד חלקי הרקמה המשוטחים.

עובדים במכסה האדים, מניחים אמבט חול במיכל אלומיניום על פלטה חשמלית. משטח החימום צריך להיות על מעלית מספריים ממתכת בשטח הפנים המתאים. הפעל את משטח החימום והגדר את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס.

השתמש בבדיקת משוב הטמפרטורה כדי לנטר את טמפרטורת החול לאורך כל הניסוי, ולהבטיח עקביות טמפרטורה. לאחר מכן, הנח 300 מיליגרם של מטריצת DAN על המשטח התחתון של מכשיר הסובלימציה. מורחים את המטריצה בשכבה אחידה במרכז המכשיר לרוחב ואורך השקופית המשוערים.

הנח לוחית מתכת על המשטח הפנימי של המנגנון כאשר הצלחת יוצרת מגע ישיר עם תחתית הקבל. הדביקו שקופית בדיקה ריקה באלכסון על פני לוחית המתכת, בעזרת סרט המונח על הקצוות החיצוניים של המגלשה. חבר את החלקים העליונים והתחתונים של המכשיר עם טבעת O מגומי באמצע כדי להבטיח איטום מלא.

הנח מפרק U מתכתי סביב מרכז המנגנון, והדק את הסגנים עד שהמחצית העליונה והתחתונה של המכשיר אטומים היטב זה לזה. לאחר מכן הנח את המכשיר לתוך טבעת ה- O המתכתית סביב אמבט החול. לאחר מכן, הניחו חופן קרח כתוש במעבה.

מלאו את המעבה ברבע עד חצי מלא במים קרים ליצירת רפש קרח. רפש הקרח יקרר את לוחית המתכת בחלק הפנימי של המנגנון, ובהמשך השקופית נדבקה אליו. המתן לפחות חמש דקות עד שהטמפרטורה תגיע למצב יציב.

לאחר מכן, שפכו 300 מ"ל מתנול במיכל המלכודת הקרה והניחו את כלי הזכוכית במיכל. חבר את משאבת הוואקום ליציאת המלכודת הקרה באמצעות צינורות גומי. השתמש בחתיכה נוספת של צינור גומי כדי לחבר את כניסת המלכודת הקרה למנגנון הסובלימציה.

ודא שהצינור מאובטח היטב באמצעות מתכת clamps. השתמש במשאבת הוואקום כדי לספק ואקום של 30 עד 50 מיליטור. אפשר למשאבות לפעול לפחות חמש דקות לאיזון לחץ.

זרוק שתיים עד שלוש חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך האתנול, בתחתית מיכל המלכודת הקרה. מלכודת הקור מסייעת במניעת הצטברות חלקיקי מטריצה במשאבת הוואקום. ייתכן שיהיה צורך להידוק פגמים בטבעת ה-U של מנגנון הסובלימציה לאחר הפעלת משאבת הוואקום בגלל ירידה בלחץ במכשיר.

ודא שטמפרטורת אמבט החול התייצבה על 140 מעלות צלזיוס. בדוק גם שהוואקום פועל ושהמכשיר מאובטח בטבעת ה-O המתכתית מעל אמבט החול כשכל הצינורות מחוברים. הגדר את הטיימר לשבע דקות אך אל תפעיל את הטיימר.

הרם לאט את הרמת המספריים ואמבט החול עד למנגנון הסובלימציה עד שמפרק ה- U של הסובלימטור נמצא הרבה מעל טבעת ה- O המתכתית. שטח נוסף זה מאפשר התאמה של המנגנון על החול. לחץ במהירות על הסובלימטור בעדינות על משטח החול כדי להבטיח שהמנגנון יושב באופן שווה על החול.

ואז, הפעל מיד את הטיימר. כאשר הטיימר נשמע, כבה את משאבת הוואקום והורד בזהירות את מעלית המספריים עד שהסובלימטור כבר לא נוגע באמבט החול ויושב היטב בטבעת ה-O המתכתית. שחרר לאט את שסתום המיקרו-ונט כדי לשחרר לחץ במכשיר.

שחרר את המתכת clamp סביב צינור הגומי של מנגנון הסובלימציה, והתחל לאט לאט לשחרר את הצינור. לאחר שצינור הגומי השתחרר מעט, כופפו את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שיורי לברוח. כאשר לחץ הסביבה חוזר, הסר בזהירות את צינור הגומי ממנגנון הסובלימציה.

לאחר מכן, שחרר את הסגנים על מפרק ה- U של המנגנון והסר אותם. הפרד בזהירות את שני חצאי מנגנון הסובלימציה ומשוך את השקופית מהחלק העליון של כלי הזכוכית הפנימיים. בדוק את השקופית כדי לאשר התפלגות מטריצה אחידה.

אם ההתפלגות והכמות של המטריצה הסובלימציה מספיקים, הדביקו שקופית חדשה עם רקמה על החלק הפנימי של הסובלימטור וחזרו על תהליך הסובלימציה. המשך לבצע הדמיה וניתוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ספקטרום המסה מציג שפע יוני של אנוליטים בטווח מסה של 1000 עד 2000.

הגנגליוזידים העיקריים מסדרת A מסומנים לאורך הספקטרום. מוצגת כאן התמונה המולקולרית המתאימה של גנגליוזידים במוח של חולדה. התמונה המולקולרית מציגה את ההתפלגות האנטומית של מספר מינים של גנגליוזידים באמצעות קידוד צבע, שכוסו ופסאודו-צבעוניים באמצעות תוכנת ImageJ.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק, מכיוון שישנם משתנים רבים בתהליך הכנת הדגימה שיכולים להשפיע על איכות תוצאות IMS שלעתים קרובות נותרות מחוץ לפרוטוקולים המדווחים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר כמות המטריצה שעוברת סובלימציה לאחר כל ניסוי, ולשנות את זמן הסובלימציה בהתאם לשקופית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את תפקידם של שומני ממברנה כמו גנגליוזידים, לאחר פגיעה מוחית, מחלת נר-ג'ון ותהליך ההזדקנות הטבעי.

אלה שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי השפע וההתפלגות האנטומית של שומנים במוח, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כולל רקמות מחוץ למוח, ואפילו מודלים של צמחים וחרקים. עבודה עם שורשים פגומים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון כפפות, מסכות והגנה על העיניים בעת ביצוע הליך זה.