Name: סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: למד פרוטוקול סובלימציה לאיתור גנגליוזידים ברקמת מוח עכברוש באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI. שיטה זו מאפשרת הדמיית ליפידים באיכות גבוהה ומסייעת בחקר תפקודם במצבים בריאים ופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לסיוע הטכני של קריסטינה ג'ורצ'יץ' במתקן MALDI MS של אוניברסיטת מערב אונטריו, כמו גם למועצה הלאומית למדעים והנדסה (NSERC) על מימון עבודה זו. המחברים רוצים גם להודות לקבוצת קפריולי (אוניברסיטת ונדרבילט, טנסי) ולקבוצת צ'אורנד (אוניברסיטת מונטריאול, קוויבק) על עצותיהם באופטימיזציה של טכניקת הסובלימציה המוצגת בכתב יד זה.

כל הנהלים טיפול בבעלי חיים כמתואר להלן לדבוק אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים של מערב אונטריו (2016-014). רקמות 1. הכנת חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ רקמת מוח מן החולדה באמצעות תהליך המכונה &quot;הפקה הקפואה&quot; (FFE). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital ולפקח רפלקסים בגפיים. לאחר כל הרפלקסים חדלו, לנתק את הראש של החולדה באמצעות הגיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השרירים ורקמות אחרות מהגולגולת באמצעות אזמל. שימוש במלקחיים חיתוך העצם כדי לשבור את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, החל מבסיס של (מגנום foramen) הגולגולת על החלק הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח חשוף, בזהירות ולשלוף אותו עם מרית כירורגית ומיד מניחים על קרח יבש כתוש להקפאה פלאש. הערה: המוח יהיה מאוד נזיל. לכן, לקחת בזהירות רבה בעת ביצוע המוח עלקרח יבש. אם המוח הוא כתוש או נלחץ משטח, זה ישנה את צורתו ולהקפיא במצב הזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרה של רקמה קפואה (לא perfused עם פורמלדהיד או מוטבע אוקטובר) מ - 80 ° C במקפיא ומניחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של מים על בעל cryostat ומניחים על קרח או יבש או סרגל ההקפאה cryostat. רקמת לחץ קלה על בעל cryostat כפי שהוא מתחיל להקפיא וחזק עד קפיאת מים מסביב לבסיס של הרקמה ומעגן אותה במקום. מוסיף מים נוספים בהמשך לאבטח את הרקמה על הבעל במידת צורך. הערה: מים משמשים במקום מדיה אוקטובר הרכבה רקמה על מנת למנוע זיהום של הרקמה עם תרכובות אשר יכול להשפיע על הגילוי של האות הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת תפקיד cryostat. קטע רקמה עד המיקום האנטומי הרצוי. ודא כי עובי החיתוך הוא בין 8 - 12 מיקרומטר. הערה: כאשר חתך רקמות cryostat הקהילתיתהתקנים, קיים הכרח כי חומרים נפרדים כגון להבים, מברשות, ברים אנטי רול, ומחזיקי לשמש כדי למנוע זיהום עם הטבעה תרכובות. החלק הפנימי של cryostat צריך גם לנקות ביסודיות עם אתנול לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרגל אנטי רול cryostat, לאט סעיף בברוטליות סעיפים רקמות. חורים או סימונים על הרקמה יכולים להתרחש אם המיקום בר רול שגוי או להב הוא משעמם. הזז את הרקמה למרכז חיתוך פלטפורמה בעזרת מכחולים נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַרכָּבָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא שקופיות מוליך או לוחות מתכת על ידי הצבתם cryostat בזמן שחתך. כאשר השקופית היא קפוא לחלוטין, בזהירות להעביר את הרקמה מחולקת על פני שטח המוליך של השקופית באמצעות מכחולים נקיים. לאחר כל קטעי הרקמה ממוקמים בצורה נכונה בשקופית, מניח אצבעות מתחת למגלשה, מול הרקמות, ולחץ עד הקטע מפשיר. הערה: ייתכן שחלקים עשויים לקפל או להתכרבל במהלך תהליך ההפשרה כאשרבשיטת הרכבה זה. זה יכול להיות מופחת על ידי שמירה על שקופית cryostat כאשר מפשיר הרקמה. אם הבעיות אלה להיות בעייתיות, אלטרנטיבה, שיטה חמה-mount היא מפורטת להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לקחת תחמוצת אינדיום-בדיל בטמפרטורת חדר (איטו) שקופיות (או צלחת מתכת) ואת לחץ בעדינות על קטע רקמה קפוא על פני שטח פלטפורמת החיתוך, בצד מוליך למטה. זה יוביל את הפשרת קטע הרקמה באופן אחיד על פני השטח של השקופית עם סלסול קטן או קיפול של הרקמה. הערה: עיבוי עשוי להופיע שמתחת לקטע כאשר גוברים בשיטה זו אשר עלולה להוביל לאובדן של חלבונים ושומנים מסוימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שקופיות עם רקמת ייבוש עבור 5 - 10 דקות. </li></ol> 2. Apparatus Sublimator הגדרה הערה: בצע את השלבים הבאים במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח באמבט חול במכל אלומיניום על פלטה חשמלית, עם הפלטה החשמלית על מעלית מספרי מתכתשל שטח פנים המתאים (כלומר גדול יותר הפלטה החשמלית). הפעל את הצלחת החמה להגדיר את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס. הערה: נקודת ההתכה עבור מטריקס DAN היא בין 187 - 190 ° C. אין לעבור טמפרטורה זו על הפלטה החשמלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלחת החמה מצוידת חללי משוב טמפרטורה, להשתמש בו כדי לעקוב אחר טמפרטורת חול לאורך הניסוי ולהבטיח עקביויות טמפרטורה. תכונה זו יכולה לסייע עם שחזור ניסוי על פני ניסויים סובלימציה שונים. הערה: אמבט החול צריך להיות בתוך מיכל אלומיניום כמכל זכוכית עלולה לנפץ בטמפרטורות גבוהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 300 מ&quot;ג של מטריקס DAN על המשטח התחתון של מנגנון סובלימציה. מניח את המטריצה ​​במרכז המנגנון והתרווח שכבה אחידה של רוחב ואורך המשוער של השקופית להיות מעודן. זהירות: מטריקס DAN הוא רעיל. לכן, כפפות ללבוש חשובה, מסכות, ובטיחותמשקפים בכל העת במהלך הטיפול בו מטריצת האבקה. DAN יש לאחסן בחושך כפי שהוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת לוחית מתכת על פני השטח הפנימיים של המנגנון עם הצלחת ליצור קשר ישיר עם החלק התחתון של הקבל כדי להבטיח חלוקה שווה של טמפרטורת קירור על פני כל השטח של השקופיות במהלך סובלימציה. לחלופין, חול התחתון של הקבל כדי להבטיח משטח שטוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הקלטת לאורך השולים החיצוניים של הצלחת לדבוק צידי הזכוכית הפנימית. אם הסרט ממוקם מתחת הצלחת ואת שומר על החלק התחתון של משטח הזכוכית הפנימי, חלוקת הטמפרטורה לא יכולה להיות אפילו ועלולה להוביל הפצה מטריקס אחידה על פני השטח של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת (מבחן) ריק להחליק באלכסון על פני השטח של צלחת מתכת עם הקלטת להציב שוב על השוליים החיצוניים של השקופית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את החלקים העליונים ותחתונים של המנגנון, wה- i O-Ring גומי באמצע כדי להבטיח חותם שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מתכת U-משותף סביב מרכז המנגנון ודק מידות רעות עד החצי העליון ותחתון של המנגנון נסגר בחוזקה. מניח את אטם המתכת מעל אמבט החול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוקחים חופן קרח כתוש ולמקם אותו הקבל. מלאו קבל ¼ כדי ½ מלא עם מים קרים כדי ליצור רפש קרח. רפש הקרח יקרר את לוחית המתכת על החלק הפנימי של המנגנון ובהמשך השקופית דבק בו. חכו לפחות 5 דקות על הטמפרטורה להגיע למצב יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 300 מ&quot;ל של אתנול בתוך המיכל מלכודת קר ומניחים את כלי הזכוכית לתוך המיכל. זרוק 2 - 3 חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך אתנול בתחתית המיכל מלכודת קר. קלט המלכודת הקר יש שפופרת זכוכית פועלת לתחתית של הגליל, ואילו התפוקה לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את משאבת הוואקום לפלט המלכודת הקר באמצעות צינור גומי. השתמש עוד פיסת גומיצינורות לחבר את הקלט מלכודת הקרה למנגנון סובלימציה. ודא כי הצינורות מהודקים היטב באמצעות מלחצי מתכת אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת ואקום כדי לספק ואקום של 30 - 50 מטרים. אפשר המשאבה לפעול במשך לפחות 5 דקות על איזון לחץ. מידות רעות על U-טבעת של מנגנון סובלימציה ייתכן שתהיינה צורך להדק שוב פעם את משאבת הוואקום מופעלת בגלל לחץ ירד במנגנון. הערה: מומלץ מאוד כי מד ואקום לצרף המשאבה לפקח על הלחץ של ואקום במהלך הניסוי וכדי לבדוק דליפות לחצו על מנת להשיג את השחזור הגבוה ביותר האפשרי בין ניסויים. עם זאת, רוב המשאבות נועדו לשמור על לחץ קבוע, ולכן המד לא יכול להיות חיוני עבור משתמשים מנוסים. בנוסף, גריז ואקום חותם יכול לשמש כדי לעזור לשמור על לחץ ואקום. </li></ol> 3. סובלימציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הטמפרטורה באמבט חול יש stabilized ב 140 מעלות צלזיוס, כי המנגנון מאובטח ב O-Ring המתכת מעל אמבט החול עם כל הצינורות המחוברים ואת הוואקום מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הטיימר עבור 7 דקות אבל לא להתחיל טיימר. לאט להעלות את מי האמבט להרים וחול מספריים למנגנון סובלימציה עד U-משותף של sublimator הוא הרבה מעל טבעת O מתכת. שטח נוסף זה מאפשר התאמה של המנגנון על החול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ללחוץ על sublimator בעדינות על פני השטח בחול על מנת להבטיח כי המנגנון יושב באופן שווה על החול, ולאחר מכן מיד להפעיל את הטיימר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטיימר נשמע, לכבות את משאבת ואקום ובזהירות להנמיך את המעלית מספריים עד sublimator כבר לא נוגע אמבטיה בחול יושב בבטחה המתכת O-Ring. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לשחרר את שסתום מיקרו-vent לשחרר לחץ במנגנון. שחרר את מהדק המתכת סביב צינור הגומי של מנגנון סובלימציה ולאט לאט מתחיל להתרופף הצינור. לאחר ruצינור bber כבר התיר מעט, לכופף את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שיורית לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר חוזר בלחץ הסביבה, להסיר בזהירות את צינורות גומי מן המנגנון סובלימציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המידות הרעות על U-משותף של המנגנון ולהסיר. בזהירות להפריד את שני החצאים של מנגנון סובלימציה לשלוף את השקופית מלמעלה של הזכוכית הפנימית. בדוק שקופיות כדי לאשר חלוקה שווה מטריקס. הערה: אם המטריצה ​​אינה אחידה, מטריצת האבקה התחתונה של sublimator ניתן למקמו מחדש או במנגנון sublimator ניתן למקמו מחדש בחול עבור לשקופית הבאה. תהליך סובלימציה ניתן לחזור מספר פעמים תוך שימוש באותו מטריקס, עם זאת, המטריצה ​​בסופו של הדבר תהפוך כהה מחשיפה חומה חוזרת בכמות האבקה תקטן כך זמן סובלימציה יצטרך להיות מותאם מעט כדי לפצות על כך. מסיבה זו, חשוב לפקח על כמות מטריקס being סובלימציה לאחר כל ניסוי כדי להבטיח עקביות בתצהיר מטריצה ​​בין שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלוקה תהיה וכמות מטריקס סובלימציה מספיקה, קלטת שקופית חדשה עם רקמות על החלק הפנימי של סעיף sublimator וחזור 3. הערה: עבור בקרת איכות (QC) למטרות, בסך של מטריקס סובלימציה ניתן למדוד לאחר כל ניסוי על ידי שקילת השקופיות לפני ואחרי סובלימציה חלוקת המשקל של מטריקס סובלימציה עם שטח הפנים של השקופית 2, יש לציין כי בשל חוסר הדיוק של רוב הכף מעבר ל -4 נקודות עשרוניות ולהבדלים בין סולמות, מדידות אלה צריכים להיות לשמש רק מדריך להפקדה מטריקס אופטימלית בניגוד אמצעי לכימות מלא של QC אלא איזון דיוק גבוה משמש (ראה איור 3). </li></ol> 4. רקמות חפצים / Rehydration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סובלימציה, חנות שקופיות במיכל אטום או קאס קטןette בתיק ניילון אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות או למשך הלילה. הערה: המטרה של תהליך ההקפאה היא לפעול כצעד התייבשות עבור desorption של חומרים רקמה לתוך המטריצה. תהליך ההקפאה גם הוכח כדי למנוע שפלה של אותות שומנים עד 1 שבוע, כאשר הם מאוחסנים ב -80 ° C 12. מסיבה זו, את הכמות זמן הדגימות מאוחסנות במקפיא יכולה להיות מגוונת במידה מסוימת כדי להתאים לצרכימים של הנסיין מבלי לשנות זיהוי אותות משמעותי (כפי שנצפה במעבדה שלנו). עם זאת, יש לנו לב כמה דהוי של מטריקס כאשר דגימות קפואות למשך זמן ארוך יותר מ -24 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. לפיכך, אנו ממליצים הדמית רקמת סובלימציה לפני הזמן או לאחסון רקמות ב -80 מעלות צלזיוס במשך תקופות דגירה כבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית מהמקפיא (מיכל) ומניח ייבוש למשך 5 - 10 דקות. </li></ol> הדמיה 5. ו- Analysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופיות ייבוש וליישם סטנדרטים מכשירים כדי להבטיח דיוק המוני של מכשיר MALDI במהלך הדמיה. הסוג של סטנדרטים ישתנה בהתאם מכשור. התקנים מיושמים בדרך כלל באופן שווה על פני השקופית כולה, לרקמות להיות צילמו (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שקף לתוך מכשיר MALDI אחרי הוראות יצרן עבור ניסויי הדמיה (שיטות מכשיר צריכות להיות מותאמות עבור 1,000 - טווח המוני 2,000). תוצאה נציג (איור 4) נרכשה במצב שלילי reflectron עם רסטר 70 מיקרומטר ו 20 יריות / ספקטרום (רכישת זמן ~ 2 ח). </li></ol>

<ol><li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li>
<li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids%3A+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1%2C5-diaminonapthalene+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li>
<li>Caughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Expression+of+Simple+Ganglioside+Species+GM2+and+GM3+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+a+Combined+Rat+Model+of+A%CE%B2+Toxicity+and+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke.</a> PLoS ONE. 10, 0130364(2015).</li>
<li>Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Anatomical+Expression+of+Ganglioside+GM1+Species+Containing+d18%3A1+or+d20%3A1+Sphingosine+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+Mature+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain.</a> Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).</li>
<li>Whitehead, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Detection+of+Gangliosides+Species+in+the+Mouse+Brain+following+Transient+Focal+Cerebral+Ischemia+and+Long-Term+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20808(2011).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).</li>
<li>Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+coupled+to+imaging+techniques%3A+the+better+the+view+the+greater+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge.</a> Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).</li>
<li>Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+for+high+spatial+resolution+lipid+analysis+by+negative+ion+mode+matrix+assisted+laser+desorption+ionization+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).</li>
<li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+of+lipids+after+matrix+sublimation%2Fdeposition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).</li>
<li>Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+vacuum+sublimed+matrices+and+conventional+dried+droplet+preparation+in+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).</li>
<li>Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+time-dependent+degradation+of+phospholipids+in+sectioned+tissues+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).</li>
<li>Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+desorption%2Fionization+of+sulfatides+by+MALDI-MS+facilitated+using+9-aminoacridine+as+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix.</a> J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).</li>
<li>Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-free+matrix+dry-coating+for+MALDI+imaging+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).</li>
<li>Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level%2C+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+pre-coated+MALDI+MS+targets+for+small+molecule+imaging+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+precoated+targets+for+direct+lipid+analysis+and+imaging+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue.</a> Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).</li>
<li>Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+comparison+of+multiple+MALDI+matrix+application+methods+for+small+molecule+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging.</a> Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו מפרטת פרוטוקול סטנדרטי של סובלימציה מטריקס על רקמות לצורך זיהוי של שומנים טעונים שלילית, כגון gangliosides, בניסויים MALDI IMS. לדוגמא כהכנה MALDI IMS הוא משתנה מאוד וחייב להיות מותאם אישית כדי להתאים את המאפיינים הייחודיים של אנליטי של עניין. היישום של מטריקס על גבי משטח דגימת רקמה היא היבט חיוני של תהליך הכנת המדגם לגבי איכות התוצאות IMS. זהירות מיוחדת יש לנקוט בעת בחירת מטריצות, על מנת להבטיח כי מטריקס תואם אנליטי של עניין והוא ללא ממצאים שמקורם מטריצה ​​בספקטרום. סובל...

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) הופכת מאד מבוקש טכניקה להדמיה של הפריסה המרחבית של שומנים, פפטידים וחלבונים על פני משטחים מדגם שלמים. MALDI IMS היה ידוע בעבר בתור שיטה אנליטית עבור analytes מראש מטוהרים, אך בשנים האחרונות, זה כבר למשוך תשומת לב בתחומים רבים אחרים בגלל היכולת לשלב את הדיוק של ספקטרומטריית מסה עם נקודות התייחסות אנטומית / וידאו ברזולוציה גבוהה ללא צריך עבור כל תיוג חיצוני. כמו הברכה המדעית של חוקרי שימוש בטכניקה זו ממשיכה לגדול, שם הוא גדל צורך סטנדרטי, קלים לעקוב פרוטוקולים כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של ניסויי IMS. Gangliosides, קבוצה של ליפידים קרום בהיקף נרחב ביותר במערכת העצבים המרכזית, הם אידיאליים עבור ניסויים MALDI IMS כמו מיקומם, מוטבע בתוך הממברנה, גורם ספציפי מסויםes בלתי אפשרי לזהות באמצעות תיוג חיסוני קונבנציונלי. בנוסף, הראינו, באמצעות MALDI IMS, כי שומנים אלו, אשר מתפקדים מאפננים של איתות תאית, בין יתר, יש דפוסי תפוצה אנטומי ייחודיים במוח המכרסם הבריא כי הם שינו לאחר פגיעה מוחית 3, 4, 5. Gangliosides ממוקם מגוון מסה גבוה יותר בהשוואה למיני השומנים ביותר, ועל כן הם מתאימים ביותר פלטפורמת הדמית MALDI. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> איור 1: Workflow של ניסוי MALDI IMS. תרשים של זרימת העבודה הכללית של ניסוי IMS MALDI באמצעות סובלימציה. רקמות קפואות ב -80 ° C מחולקות בתוך cryostat ו -10 מיקרומטר חלקים הם הפשרה רכובה על גבי שקופיות איטו מוליך. השקופית ממוקמת אז ייבוש עד סובלימציה. SLIdes מוכנס לתוך מנגנון סובלימציה וכן גם שכבה של מטריקס מוחלת על פני שטח מדגם רקמות. דוגמאות מוקפא לילה במקפיא -20 מעלות צלזיוס ממוקם אז ייבוש במשך 10 דקות. לאחר סטנדרטים יושמו, הדגימות מוכנסות לתוך מכשיר MALDI שבו ליזר מכוון על פני הרקמה גורמת מולקולות desorbed במטריצה ​​כדי ליינן. היונים לנסוע במורד צינור טיסה ונפרד מבוסס על המסה שלהם (זמן של טיסה / TOF) עד שהם מגיעים אל הגלאי. המידע על השפע היוני של analytes בתוך מסה-אל-תשלום קבוע מראש (m / z) טווח מוצג גם תמונה מולקולרית ספקטרום המוני. נתונים אלה יכולים לשמש הם לחזות ולכמת את השפע היוני של אנליטי של עניין בתוך רקמת ההדמיה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> להכנת דגימותעבור MALDI IMS הוא משתנה מאוד כמו כל שלב של התהליך חייב להיות מותאם אישית אל analytes עניין. התכונה המגדירה של ניסויים מבוססים MALDI היא השימוש ציפוי מטריקס מופקד על פני השטח המדגמים לפני הניתוח. בנוסף לתפקיד של קליטה והעברת אנרגית קרינה מהליזר במהלך תהליך אבלציה, המטריצה משמשת גם כדי לבודד analytes השונה מן המדגם, ובכך מקלות על הניתוח של תרכובות של עניין 6, 7. יישום אחיד של המטריצה ​​אל פני שטח המדגם הוא הצעד החיוני ביותר בתהליך הכנת המדגם. בתצהיר מטריצה לא נכון יכול להוביל תצורות גביש מטריקס הטרוגניות גדולה בפיתוח של חפצים, אות-יון נמוך, ו -7 שחזור עניים. בשל הזיקה של מטריצות מסוימות לבודד analytes הספציפי, הסוג של מטריקס נבחר לניסוי יכוללשנות את התוצאה באופן משמעותי. המטריצות המשמשות הדמיה של חלבונים ופפטידים לעתים קרובות שונות מאלה המשמשים שומני הדמיה והתהליך מסתבך עוד יותר על ידי הצורך בהליכים נוספים כגון צעדי כביסה להחזרת נוזלים כדי לזהות אותות בהצלחה מרקמות. למרות צעדי כביסה להתקיים להגברת אותות שומנים 8, הם לא תנאים הכרחיים לצורך זיהוי של רוב מיני שומנים. בעת בחירת מטריקס עבור ניסוי הדמית שומנים, חשוב לשקול את הקוטביות של השומנים של עניין כמו זה יהיה לצמצם את הטווח של מטריצות מתאימות. לדוגמא, gangliosides להכיל שאריות חומצת sialic המקנות להם קוטביות שלילית הכוללת. ישנם מספר של מטריצות שיכולים desorb ביעילות ליינן gangliosides מרקמות; עם זאת, גורמים כגון פסגות הנגזרות מטריקס בספקטרום והיציבות של מטריקס תחת ואקום חייבים יילקחו בחשבון. 1,5-diaminonapthalene (DAN) מטריקס היא יציבה מספיק בתנאי ואקום מכשיר עבור רוב יישומי הדמיה הוכיחה רמה גבוהה של רגישות desorption שומנים ויכולה לשמש לניתוח של שומנים הם מצבי יון חיוביים ושליליים 2. DAN מטריקס, בהשוואה מטריצות זיקה השומנים שליליות אחרות כגון חומצה dihydroxybenzoic (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), ו -5 כלורו-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), הצליח desorb gangliosides ביעילות ביותר מהמוח חולדה רקמות במצב יונים שליליים (כתב יד בהכנה). בחירת השיטה המתאימה של בתצהיר מטריצה ​​היא בעלת חשיבות שווה בחירת המטריצה ​​עצמה. שיטות בתצהיר מטריצה ​​רטובות שבו המטריצה ​​המוצקה מומסת ממס אורגני, ותופקדנה על פנאומטי או אוטומטית מתזים או תצפיתנים, יעילות במיוחד עבור desorption של חלבונים ופפטידים בעוד הנוזל מחלחל המדגם כדי לאפשר תוספתction של תרכובות ושיתוף התגבשות עם מטריקס. למרות ששיטות אלה יכולים לשמש גם עבור יישומי שומנים, delocalization אנליטי ותצורות קריסטל מטריקס אחידה היא תופעה נפוצה בשל שפע המסיסות הגבוה של שומנים ממסים, במיוחד ברקמה 2, 9. בגלל שומנים הופכים להיות מיוננים בקלות מרקמות, טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות, כגון סובלימציה, להציע אלטרנטיבה יעילה פשוטה, עלות מתזים תוך עקיפת רבי החסרון של טכניקות אלה. ההצלחה של סובלימציה בניסויים MALDI IMS מיוחסת תכונות כגון מורפולוגיה מטריקס מיקרו דבר המגדיל את שטח הפנים החשוף-אנליטי מטריצה מחייב, טוהר מטריקס גדל, בתצהיר מטריצה הומוגנית המוביל שחזור מוגברת בהשוואה לטכניקות מטריקס רטוב 1, 10. סובלימציה involves חימום מטריצת אבקה תחת ואקום מייד מתחת לפני שטח מדגם מקורר וכתוצאה מכך מוצק המעבר לשלב גז של מטריקס האבקה ואחריו בתצהיר על פני שטח מדגם רקמות. במהלך סובלימציה, בתצהיר מטריקס יכול להיות נשלט על ידי גורמים שונים כגון זמן, טמפרטורה ולחץ כדי לספק תוצאות מאוד לשחזור. ניסוי סובלימציה יחיד יכול לקחת בין 5 ל 20 דקות, תלוי בסוג של מטריקס נבחרה, אשר ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כמה פעמים לפני סילוק. המנגנון ניתן לרכוש מסחרי בכל חלק של המחיר של מתזים אוטומטיים נלקח בקלות בנפרד לניקוי ותחזוקה. עלות נמוכה הפשטות היחסית של טכניקה בתצהיר מטריצה ​​זו להפוך אותו אידיאלי עבור חוקרים מתחילים או הרחבת על יישומי הדמיה ליפיד MALDI IMS. אף כי מידע המפרט פרוטוקולים סובלימציה של רקמות עבור IMS דווחו 11, כמה פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים which להתמקד העבודה הבסיסית מעורבת עם ביצוע ניסוי סובלימציה הדמית שומני מסה גבוהים במצב יונים שלילי, ולכן קשה לקבוע את הטכניקה ללא ניסוי וטעייה נרחבים. להלן פרוטוקול הניסוי במטרה למלא את החלל עבור סובלימציה של מטריקס DAN על חלקים במוח החולדה הדמיה ברזולוציה גבוהה וזיהוי של gangliosides. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> איור 2: מכשירי סובלימציה. תצלום (א) ו תרשים סכמטי (B) של מנגנון סובלימציה. משאבת הוואקום מחוברת באמצעות צינור גומי ל מלכודת קרה מלאה 300 מיליליטר של אתנול. המלכודת הקרה מחוברת אז על ידי צינורות גומי למנגנון סובלימציה. המנגנון הוא מורכב משני חלקים נפרדים של כלי זכוכית שאינם חתומים יחד עם מתכת U-משותף. המחצית העליונה של sublimatorמכיל הקבל אשר מתמלא רפש קרח. צלחת המדגם היא מודבקת על החלק התחתון של הקבל, בתוך התקן הזכוכית האטום. המחצית התחתונה של מנגנון סובלימציה מכילה מטריצת DAN, פרושים מול צלחת המדגם באופן שווה. במהלך סובלימציה, מנגנון הזכוכית מושם על אמבט חול מחומם ל -140 מעלות צלזיוס על ידי פלטה חשמלית ישירות מתחתיה. חללית הטמפרטורה עוזרת לשמור על טמפרטורה יציבה לאורך ניסוי סובלימציה באמצעות משוב של טמפרטורת חול האמבטיה לעומת הטמפרטורה מראש עבור הניסוי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>סובלימטור</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת 1,5-Diaminonapthalene (DAN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>פלטה חמה עם משוב טמפרטורה</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>שקע נירוסטה</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>מלכודת</td><td></td><td></td> קרה <td>בהתאמה אישית נבנה באתר</td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>פרנקלין אלקטריק</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 דו-שלבי</td></tr><tr><td>אינדיום-תחמוצת פח (ITO) שקופיות</td><td>הדסון משטח</td><td>טכנולוגיה PSI 1111000</td><td>סוג II, 1.1 מ"מ/25 כל אחד</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 מכשיר</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>מייבש שולחן</td></tr></tbody></table>

סובלימציה של dan מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של gangliosides רקמות מוח החולדה עבור maldi הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

להכנת דגימות הוא המפתח לגילוי אופטימלי וויזואליזציה של analytes ב Desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) ניסויים. קביעת הפרוטוקול המתאים לעקוב לאורך כל תהליך הכנת המדגם יכול להיות קשה כמו כל צעד חייב להיות מותאם על מנת לקיים את המאפיינים הייחודיים של analytes עניין. תהליך זה כרוך לא רק במציאת מטריצה ​​תואמת שיכול desorb ו ליינן המולקולות של עניין ביעילות, אלא גם בחירת הטכניקה בתצהיר המטריצה ​​המתאימה. לדוגמא, טכניקה בתצהיר מטריצה ​​רטובה, שמשמעותה המסה מטריצה ​​ממסה, היא מעולה עבור desorption של רוב החלבונים ופפטידים, ואילו טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות יעילות במיוחד יינון של שומנים. סובלימציה דווחה כשיטה היעילה ביותר של בתצהיר מטריצה ​​יבש לצורך זיהוי של שומנים ברקמות ידי MALDI IMS בשל homogeneity של בתצהיר קריסטל מטריקס delocalization אנליטי מזערי בהשוואה לשיטות בתצהיר רטוב רבות 1, 2. באופן כללי, זה מתבצע על ידי צבת מדגם מטריקס אבקה בתא אטום ואקום עם הדגימות נלחצו משטח קר. המנגנון הוא הוריד ואז לתוך אמבט מחומם (חול או שמן), וכתוצאה מכך סובלימציה של מטריקס אבק על שטח מדגם רקמות המקורר. כאן אנו מתארים פרוטוקול סובלימציה באמצעות 1,5-diaminonaphthalene (DAN) מטריקס לאיתור להדמיה של gangliosides במוח החולדה באמצעות MALDI IMS.

עם השלמת ניסוי סובלימציה, שני החצאים של התקן הזכוכית מופרדים ב למכסת המנוע קטר ואת השקופיות, מודבקת הקבל, ניתן להסיר (איור 3 א). בשלב זה, את השקופית יש לבחון להפצה מטריקס אחידה ואת הזמן, טמפרטורה, או מיקום של המנגנון באמבטית החול עשוי להיות מותאם עבור לשקופית הבאה. ניסוי סובלימציה DAN מוצלח יגרום ציפוי אפילו של מטריקס אפור / חום על פני השטח של השקופית שבה התכונות אנטומיות של הרקמה ניתן דמיינו בבירור וכמות מטריקס בשקופית הזכוכית דומ...

מוצג פרוטוקול לסובלימציה של מטריצת DAN על רקמת מוח של חולדה לזיהוי גנגליוזידים באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

המטרה הכללית של פרוטוקול סובלימציה זה היא לספק תהליך מפורט וקל לביצוע להכנת דגימות, לצורך זיהוי גנגליוזידים בניסויי דימות מסה בשיטת MALDI. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כולל ההפצה האנטומית והתפקוד של גנגליוזידים, הן במוח בריא והן בפתולוגיות של המוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה לדימות באיכות גבוהה של מיני ליפידים רבים באמצעות שינויים קלים בפרוטוקול.כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו את רקמת המוח מהחולדה והכינו אותה להקפאה בקריוסטט כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, מקמו את הרקמה בקריוסטט. בצעו חיתוך של הרקמה עד להגעה למיקום האנטומי הרצוי.יש לוודא שעובי החיתוך הוא בין 8 ל-12 מיקרון. בעזרת מוט מניעת הגלגול של הקריוסטט, חתכו לאט חיתוכים של רקמה שטוחה. חורים או סימנים על הרקמה עלולים להיווצר אם מיקום מוט מניעת הגלגול אינו נכון או אם הלהב קהה.העבירו את הרקמה למרכז פלטפורמת החיתוך באמצעות מברשות צבע נקיות. כדי למפות את הרקמה, הקפיאו שקופיות מוליכות או לוחות מתכת על ידי הנחתן בתוך הקריוסטט בזמן החיתוך. כאשר השקופית קפואה לחלוטין, העבירו בזהירות את נתח הרקמה אל פני השטח המוליכים של השקופית באמצעות מברשות צבע נקיות.לאחר שכל חיתוכי הרקמה ממוקמים כראוי על השקופית, הניחו אצבע מתחת לשקופית מול הרקמה ולחצו עד שהחיתוך מפשיר. לאחר מכן, הניחו את השקופיות עם הרקמה בדסיקטור למשך חמש עד 10 דקות. לחלופין, ניתן להשתמש בשקופית חמה וללחוץ אותה קלות, כאשר הצד המוליך פונה כלפי מטה, כנגד חיתוכי הרקמה המשטחים.בעבודה תחת מ 빠르게 מ hút (מכסות אידוי), מקמו אמבט חול בתוך מיכל אלומיניום על גבי פלטה מחממת. על הפלטה המחממת להיות מונחת על מעלית מספריים ממתכת בעלת שטח פנים מתאים. הפעילו את הפלטה המחממת וכווןו את הטמפרטורה ל-140 °C.השתמשו בגשש למשוב טמפרטורה כדי לנטר את טמפרטורת החול לאורך כל הניסוי, ולהבטיח עקביות בטמפרטורה. לאחר מכן, הניחו 300 milligrams של מטריצת DAN על פני השטח התחתונים של מכשיר הסובלימציה. פרסו את המטריצה בשכבה אחידה במרכז המכשיר, ברוחב ובאורך המקורבים לאלו של השريחה שעוברת סובלימציה.הנח לוחית מתכת על פני השטח הפנימיים של המכשיר, כך שהלוחית תהיה במגע ישיר עם תחתית המעבה. הדבק בעזרת סרט הדבקה תגית בדיקה ריקה באלכסון על פני שטח לוחית המתכת, כאשר הסרט מודבק על הקצוות החיצוניים של התגית. חבר את החלקים העליון והתחתון של המכשיר באמצעות טבעת גומי (O-ring) במרכז כדי להבטיח איטום מלא.הניחו מחבר U מתכתי סביב מרכז המכשיר, והדקו את הסגרים עד שהחלקים העליון והתחתון של המכשיר אטומים היטב זה לזה. לאחר מכן, הניחו את המכשיר בתוך טבעת O המתכתית סביב אמבט החול. לבסוף, הניחו חופן של קרח גרוס במעבה.מלאו את המעבה ברבע עד חצי מכמותו במים קרים כדי ליצור עיסת קרח. עיסת הקרח תקרר את לוח המתכת בתוך המכשיר, ובעקבותיו את הזריחה המודבקת אליו. המתינו לפחות חמש דקות עד שהטמפרטורה תגיע למצב יציב.לאחר מכן, שפכו 300 mL של methanol למכל מלכודת הקור והניחו את כלי הזכוכית בתוך המכל. חברו את משאבת הוואקום למוצא של מלכודת הקור באמצעות צינור גומי. השתמשו בחתיכת צינור גומי נוספת כדי לחבר את כניסת מלכודת הקור למכשיר הסובלימציה.יש לוודא שהצינורות מהודקים היטב באמצעות תסמיכי מתכת. השתמש במשאבת ואקום כדי להגיע ללחץ של 30 עד 50 millitorr. אפשר למשאבות לפעול למשך חמש דקות לפחות לצורך השוואת לחצים.הניחו שתי עד שלוש חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך האתנול, בתחתית של מיכל מלכודת הקור. מלכודת הקור מסייעת למנוע הצטברות של חלקיקי מטריצה במשאבת הוואקום. ייתכן שיהיה צורך להדק את הבורגים בטבעת ה-U של מכשיר הסובלימציה לאחר הפעלת משאבת הוואקום, עקב הירידה בלחץ בתוך המכשיר.וודאו שטמפרטורת אמבט החול התייצבה על 140 degrees Celsius. כמו כן, בדקו שהוואקום פועל ושהמכשיר מקובע בטבעת ה-O ממתכת שמעל אמבט החול, כשכל הפצויות מחוברות. כווןו את הטיימר לשבע דקות, אך אל תפעילו אותו.העלו לאט את מעלית המספריים ואת אמבט החול עד למכשיר הסובלימציה, כך שה-U-joint של הסובלימטור יהיה גבוה במידה מספקת מעל טבעת ה-O ממתכת. מרווח זה מאפשר כיוון של המכשיר על החול. לחצו במהירות ובעדינות את הסובלימטור על פני החול כדי להבטיח שהמכשיר יושב באופן מאוזן על החול.לאחר מכן, הפעילו מיד את הטיימר. כאשר הטיימר יצליל, כבו את משאבת הוואקום והורידו בזהירות את מעלית המספריים עד שהסובלימטור לא י touches יותר את אמבט החול ויושב באופן מאובטח בטבעת ה-O ממתכת. שחררו באיטיות את שסתום המיקרו-וונט כדי לשחרר את הלחץ במכשיר.שחררו את תפס המתכת סביב צינור הגומי של מכשיר הסובלימציה, והתחילו לשחרר את הצינור באיטיות. לאחר שצינור הגומי שוחרר מעט, כופפו את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שאריות להישחרר. כאשר הלחץ הסביבתי חוזר, הסירו בזהירות את צינור הגומי ממכשיר הסובלימציה.בשלב הבא, שחררו את תופסני המלחצין במחבר ה-U של המכשיר והסירו אותם. הפרידו בזהירות בין שני חצאי מכשיר הסבלימציה ומשכו את השקף מחלקו העליון של כלי הזכוכית הפנימי. בחנו את השקף כדי לוודא שהמטריצה מפוזרת באופן אחיד.אם הפצה וכמות המטריקס שעברו סובלימציה הן מספיקות, הדביקו שקופית חדשה עם רקמה בחלק הפנימי של הסובלימטור וחזרו על תהליך הסובלימציה. המשיכו לביצוע הדמיה ואנליזה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ספקטרום המסות מציג שפע יוני של אנוליטים בטווח מסות של 1000 עד 2000.הגנגליוזידים העיקריים מסדרת A מסומנים לאורך הספקטרום. מוצגת כאן התמונה המולקולרית התואמת של גנגליוזידים במוח של חולדה. התמונה המולקולרית מראה את ההפצה האנטומית של מספר מיני גנגליוזידים באמצעות קידוד צבעים, אשר הונחו זה על זה ועברו צביעה מדומה (pseudocolored) באמצעות תוכנת ImageJ.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עשויים להתקשות, שכן תהליך הכנת הדגימות כולל משתנים רבים העשויים להשפיע על איכות תוצאות ה-IMS, אשר לעיתים קרובות מושמטים מפרוטוקולים מדווחים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנטר את כמות המטריקס שעוברת סובלימציה לאחר כל ניסוי, ולהתאים בהתאם את זמן הסובלימציה עבור השקף. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים לבחון את תפקידם של ליפידים ממברנה, כגון gangliosides, לאחר פגיעה מוחית, מחלות עצביות ותהליך ההזדקנות הטבעי.בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השמימות וההפצה האנטומית של ליפידים במוח, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כולל רקמות מחוץ למוח, ואפילו על מודלים של צמחים וחרקים. עבודה עם שורשים פגומים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, מסכות והגנה על העיניים בעת ביצוע הליך זה.

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טיפול תרופתי חלופי באמצעות דופמין L-DOPA הוא טיפול סימפטומטי הנפוץ ביותר של מחלת פרקינסון, אך מלווה תופעות לוואי, כולל תנועות לא רצוניות חריגות, dyskinesia...

MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמה של מולקולות קטנות; פרוטוקולים לשימושם של DT להדמית MALDI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות על ידי חיובי יון MALDI-MS במכשיר quadrupole-FTICR רזולוציה ultrahigh מסופקים כאן.

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

מקור הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) המופעל בלחץ אטמוספרי פותח על ידי צימוד ספיגת לייזר אינפרא אדום בינוני ופוסט-יינון אלקטרוספריי. מטריצת קרח אקסוגנית שימשה כמטריצה סופגת אנרגיה כדי להקל על ספיגה תהודה של חומר הקשור לרקמות. כתב יד זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע IR-MALDESI MSI של עכבר יילוד בכל הגוף.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

גנגליוסידים הם גליקוספינגוליפידים נושאי חומצה סיאלית הנמצאים בשפע במיוחד במוח. טבעם האמפיפתי דורש טכניקות מיצוי וטיהור אורגניות/מימיות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית וניתוחים מדויקים. מאמר זה מספק סקירות כלליות של מיצוי גנגליוסיד בקנה מידה אנליטי ומכין, טיהור, וניתוח כרומטוגרפיה שכבה דקה.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

פותחה שיטה מתקדמת להדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) של אורגנואידים במוח המאפשרת מיפוי התפלגות מטבוליט בתוך מודלים אלה. טכנולוגיה זו מציעה תובנות לגבי מסלולים מטבוליים במוח וחתימות מטבוליטים במהלך התפתחות מוקדמת ובמחלות, ומבטיחה הבנה מעמיקה יותר של תפקוד המוח האנושי.

הדמיה מולקולרית של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ספקטרומטריית מסה 

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוMS לספקטרומטריית מסה MALDI-2 חד-תאית מונחית פלואורסצנטית, המאפשרת פרופיל מולקולרי משופר של תאי עצב ראשוניים של חולדות.

ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה

פרוטוקול זה מפרט את השלבים המרכזיים לאפשר מדידה קפדנית וניתנת לשחזור של גליקנים מקושרי גליקוגן ו-N באמצעות דימות ספקטרומטריית מסה.

הדמיה מולקולרית מרחבית של הגליקום באמצעות ספקטרומטריית מסה

למד פרוטוקול סובלימציה לאיתור גנגליוזידים ברקמת מוח עכברוש באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI. שיטה זו מאפשרת הדמיית ליפידים באיכות גבוהה ומסייעת בחקר תפקודם במצבים בריאים ופתולוגיים.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים