מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לתאר את השיטה לריצוף של הכלאות קשורות ונבחרות של פסורלן או SPLASH שבה אינטראקציות RNA-RNA in vivo ממופות באופן גנומי. טכניקה זו היא שיטה פשוטה עם תפוקה גבוהה למיפוי אינטראקציית ה-RNA in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה של RNA כגון כיצד אזורים שונים לאורך גדיל אחד של RNA או בין גדילי RNA שונים מתקשרים זה עם זה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שמרים ותאים אנושיים, ניתן ליישם אותה גם במחקרים באורגניזמים מודרניים אחרים, כולל חיידקים וממברנות בתאים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשרצינו לחשוב על דרך למפות אינטראקציה מולקולרית. שים לב שההליך הבא מכיל מספר נקודות עצירה.

בזמנים אלה, ניתן להשהות את הניסוי לזמן קצר או ללא הגבלת זמן. פרטים ניתן למצוא בטקסט הנלווה. התחל הליך זה על ידי שטיפת תאי HeLa פעמיים עם חמישה מיליליטר PBS.

מניחים את המנה אנכית למשך דקה אחת כדי לנקז לחלוטין את עודפי ה-PBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PBS המכיל 200 פסורלן ביוטיניל מיקרו-מולרי ו-0.01% דיגיטונין המגביר את חדירות התאים. הקפידו להוסיף את התמיסה באופן שווה על פני התאים.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, הסר את מכסה הכלי והניח אותו על קרח בתוך קרוסלינקר UV שלושה סנטימטרים מנורת ה- UV. הקרנה עם 365 ננומטר UV למשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, הוציאו את המנה מהקרוסלינקר ולאחר מכן בודדו את השבר וזרזו את ה-RNA מתאי HeLa בהתאם להוראות במסמך הנלווה. טען דגימות סולם ו-RNA מפוגל על ג'ל אוריאה בגודל 8.6 ס"מ רבוע 6%TBE. הגודל מחולק על ידי אלקטרופורזה ב -180 וולט למשך 40 דקות.

צבעו את הג'ל ב-10 מיליליטר של מאגר TBE המכיל דילול של 1:10, 000 של כתם ג'ל חומצת גרעין למשך חמש דקות בחושך. בזמן שהג'ל מכתים, השתמש במחט בגודל 24 כדי לנקב צינור מיקרופוגה נקי של 0.6 מיליליטר בתחתית. הניחו אותו בצינור מיקרופוגה של שני מיליליטר.

בעזרת טרנס-מאייר, דמיינו את הרצועות על הג'ל המוכתם לאחר הכתמים וחתכו פרוסת ג'ל המתאימה ל-90 עד 110 נוקלאוטידים. העבירו את פרוסת הג'ל לתוך צינור המיקרופוגה המנוקב של 0.6 מיליליטר בצינור המיקרופוגה של שני מיליליטר. בחירת הגודל מאפשרת לנו לקבוע את האורך המינימלי של השברים הכימריים ולהבחין בין מוצרים קשורים למוצרים לא קשורים בהמשך.

צנטריפוגה את פרוסות הג'ל ב -12, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות כדי לגרוס את פרוסת הג'ל ולאסוף אותה בצינור המיקרופוגה של שני מיליליטר. לאחר הסיבוב, השליכו את צינור המיקרופוגה הריק של 0.6 מיליליטר. לפרוסת הג'ל הגרוסה, הוסיפו 700 מיקרוליטר של מאגר פליטה.

דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם סיבוב קבוע כדי לאפשר דיפוזיה של הדגימות לתוך המאגר. מעבירים את פרוסות הג'ל ואת מאגר הפליטה לפילטר צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב -20, 000 פעמים גרם למשך 20 דקות. לאחר הסיבוב, פרוסות הג'ל יילכדו בתא העליון של המסנן שעלול להיזרק.

לזרז ולכמת את ה-RNA כמתואר במסמך הנלווה. הקפיא בזק ואחסן את ה-RNA במינוס 80 מעלות צלזיוס בחנקן נוזלי עד לשימוש. כדי להעשיר אזורי קישור צולבים של RNA, התחל בהוספת 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל מעכב RNase כדי לשטוף חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין בצינור מיקרופוגה.

לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר, הוסף שני מיליליטר של מאגר הכלאה שהוכן טרי, מיליליטר אחד של מאגר ליזה משלים, 1.5 מיקרוגרם של RNA מפוצל בגודל ו-100 מיקרוליטר של חרוזים תלויים. מערבל את הצינור בעדינות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב מקצה לקצה.

לאחר הדגירה יש לשטוף את החרוזים חמש פעמים עם מאגר כביסה שחומם מראש. בתום הכביסה החמישית, הנח את צינור המיקרופוגה המכיל את החרוזים על מעמד המגנט למשך דקה אחת ולאחר מכן הסר את מאגר הכביסה. הוסף מיליליטר אחד של מאגר T4 פולינוקלאוטיד קינאז קר לחרוזים השטופים.

דגרו את החרוזים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה. הנח את צינור המיקרופוגה המכיל את החרוזים על הפס המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר בעדינות את המאגר.

חזור על שלב זה בסך הכל שתי כביסות והסר את המאגר לאחר הכביסה האחרונה. לאחר מכן, עקוב אחר ההוראות במסמך הנלווה כדי להמיר את חמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשיים להיות תואמים לקשירה ולבצע את קשירת הקרבה. לאחר הכביסה, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר RNA PK לחרוזים והשעה אותם מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על גוש חום. לאחר מכן, צננו את הדגימה על קרח למשך דקה. הוסף לדגימה 500 מיקרוליטר של גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם.

מערבבים על ידי מערבולת נמרצת במשך 10 שניות. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בערכה כדי לזרז, לנקות ולשחזר את ה-RNA, וודא שאפילו RNA קטן נשמר.

יש לסלק את ה-RNA ב-100 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. מעבירים 100 מיקרוליטר מהדגימות המוחלפות לבאר של צלחת של 24 בארות על ניס. שמירה על הדגימה על קרח, UV מקרין אותה ב-254 ננומטר למשך חמש דקות.

העבר את הדגימה הצולבת ההפוכה לצינור מיקרופוגה נקי. הוסף 10 מיקרוליטר נתרן אצטט, מיקרוליטר אחד של גליקוגן ו -300 מיקרוליטר של 100% אתנול. זרז את ה-RNA במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

כדי לשחזר את ה-RNA, צנטריפוגה את ה-RNA המשקע ב-20,000 פעמים גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של אתנול קר 70% כדי לשטוף את כדור ה-RNA. צנטריפוגה את הגלולה השטופה ב 20, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את מאגר הכביסה והוסף 4.25 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז כדי להשעות מחדש את ה-RNA. העבירו את ה-RNA לצינור PCR של 0.2 מיליליטר. לבסוף, תמלל הפוך, מעגל והגביר את ה-cDNA בהתאם להוראות במסמך הנלווה.

סכימה זו מתארת את זרימת העבודה של SPLASH. עם הוספת פסורלן ביוטיניל בנוכחות 0.01% דיגיטונין וקישור צולב UV, מופק סך ה-RNA מהתאים ומבוצע כתם נקודות כדי להבטיח שהקישור הצולב היה יעיל. לאחר מכן משתמשים ב-20 אוליגוס בסיס ביוטיניליים כבקרות חיוביות כדי לטטר את כמות הפסורלן הביוטיני שיש להוסיף לתאים כך שבערך אחד מכל 150 בסיסים מקושר.

לאחר מכן, הגברת PCR בקנה מידה קטן מתבצעת באמצעות מספר הולך וגדל של מחזורי PCR כדי לקבוע את מספר המחזורים המינימלי הנדרש לריצוף עמוק. בתהליך הכנת ספרייה יעיל, ניתן להגביר ספריית ריצוף cDNA מכניסת RNA נבחרת בגודל של 1.5 מיקרוגרם בפחות מ-15 מחזורים של הגברת PCR. לאחר מכן הספרייה מרוצפת באמצעות שתי קריאות של 150 זוגות בסיסים במכונת ריצוף גבוהה.

קריאות הרצף מעובדות לאחר מכן בהתאם לצינור החישוב. התוצאה הסופית היא רשימה של אינטראקציות כימריות, הכוללת אינטראקציות RNA-RNA תוך-מולקולריות ובין-מולקולריות בטרנסקריפטום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק אם יש שילוב של פסורלן ביוטיניל בעת שימוש ב-SPLASH על אורגניזמים חדשים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור אינטראקציות RNA באורגניזמים מגוונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריית ריצוף הלוכדת אינטראקציות RNA זוגיות באופן גלובלי בתא.