Name: רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: למד שיטה לרבייה בקנה מידה קטנה של תאי גזע iPSCs אנושיים ללא סרום, המאפשרת אפיון Immunocytochemical שגרתי. טכניקה זו חוסכת זמן ועלויות בתהליך הגידול והאפיון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מקורות מימון: אוניברסיטת אריזונה, קרן ג'ים הימליק, ומרכז אריזונה לביולוגיה של מחלות מורכבות.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Hallett, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+function+of+autologous+iPSC-derived+dopamine+neurons+following+transplantation+in+a+non-human+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease.</a> Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).</li>
<li>Haston, K. M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Trials+in+a+Dish%3A+The+Potential+of+Pluripotent+Stem+Cells+to+Develop+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+pharm+toxicol%22%5BJournal%5D)">Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+heart+fail%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).</li>
<li>Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+subpopulation+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts.</a> PloS one. 4, 7118(2009).</li>
<li>Sivapatham, R., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+for+Disease+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling.</a> Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול השיטתי שהוצג כאן מציע timesaving ושיטה חסכונית, בצורת טכניקת תרבות מוקטנת, שתוכנן במיוחד כדי לתמוך ניתוח pluripotency יעיל באמצעות immunocytochemistry. היתרונות העיקריים של המתודולוגיה שתוארה הם כדלקמן. באופן מסורתי יותר 3 עד 4 קטעים נדרשים לעבור iPSCs משכבות מזין מזין ללא תנאי התרבות כדי לחסל iMEFs שיורי שנותר לאחר השימוש בטכניקות דיסוציאציה בתפזורת עבור מורפולוגיה בשכבה טיפוסית להופיע <sup class="xref...

תכנות מחדש תאים סומטיים אדם בוגרים לתאי גזע מושרים (iPSCs) מספק דרך להשיג אספקה פוטנציאלית בלתי מוגבלת של תאים ספציפיים למטופל ללמוד המחלה 1, 2. משחזר פנוטיפ מחלה במבחנה תעשה את זה מתקבל על דעת לבחון מנגנונים תאיים ומולקולריים הקשורים במחלה, ולשפר גילוי סמי רפואה מותאם אישית 3. בנוסף, iPSCs האדם (hiPSCs) להציע את היכולת להפיק סוגי תאים מסוימים אשר ניתן להשתמש בהם כמשאב ייחודי להחליף תאים מתים או לא מתפקדת ולשחזר פונקציה בהקשר של מספר הפרעות 4, 5. תנאי חשוב לשימוש iPSCs שמוצג ביישומים לעיל הוא להבטיח כי מדינת pluripotent ו המובחנת שלהם נשמרת במהלך התרחבות בתרבות. בדרך כלל, techniqUES כגון cytometry זרימה, סופג מערבי, תגובת שרשרת פולימראז מבחנים תפקודיים, אשר דורש כמויות גדולות של תאים וציוד מיוחד, משמש לניתוח המפורט של pluripotency 6 iPSC, 7, 8, 9, 10. עם זאת, הערכה שיגרתית של המדינה המובחנת &#39;iPSCs עשויה להיות מושגת בצורה יעילה באמצעות ההתפשטות המוגבלת של תאים אלה במיוחד עבור immunocytochemistry (ICC), ובכך מעורבים זמן נמוך ומשאבים. התקדמות שחלה באחרונה לאפשר לצמיחת iPSCs בתנאי סרום ללא מוגדר, וזה שיפור משמעותי על פני מערכות התרבות קונבנציונליות שדורשות שכבות מזין פיברובלסטים murine ומדיה המכיל סרום. אולם, הספרות הנוכחית אינה כוללת פרוטוקולים בשלבים ברורים המתארים כיצד מעבר iPSCs מזיןשכבה למערכות מזינות חינם. בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מפרט באופן שיטתי כיצד hiPSCs גדל על פיברובלסטים מוקרן עכבר עוברי (iMEF) שכבות מזין יכול להיות (1) מותאמת להפיץ במדיום סרום ללא, ו (2) בתרבית על בקנה מידה קטנה במיוחד לתמוך חזק ניתוח immunocytochemical. בסך הכל, מתודולוגיה זו מייצגת הליך בזמן וחסכוני עבור הפצת iPSCs האנושי בתנאים סרום ללא לצורך וידוא pluripotency שלהם על בסיס שגרתי באמצעות immunocytochemistry.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td></td> 10828028-L-Glutamine <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td></td> 25030081-MEM-NEAA <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td></td> 11140050-2-מרקפטואתנול <td></td></tr><tr><td></td><td>Life</td><td>Technologies 21985023</td><td></td></tr><tr><td>מדעי התא הבסיסיים של FGF אנושי רקומביננטי</td><td></td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK מעכב</td><td>מו"פ D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC מוסמך מטריקס</td><td>קורנינג</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 בזאלי בינוני</td><td>StemCell</td><td>Technologies 05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x תוסף</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td><td>Technologies StemCell</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0.1 מ' PO4 מאגר</td><td>פנימי</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, prill</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x פוספט חוצץ מלח</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat</td><td>Serum Life Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>לחלופין, ניתן לרכוש שילוב של 6 נוגדנים ראשוניים פלוריפוטנטיים יחד כערכה בקטלוג #9656</td></tr><tr><td>עז אנטי-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים מרובות בארות</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>0720080 / 0720081</td><td>זמין ב 6, 12, 24, 48, 96 גדלים</td></tr><tr><td>היטב מגלשות קאמריות</td><td>פישר מדעי&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>זמין בזכוכית או פלסטיק פרמנוקס בגדלים 1, 2, 4, 8, 16 באר</td></tr><tr><td>Coverglass לצמיחה</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>זמין בגדלים של 12, 15, 18, 22 ו- 25 מ"מ</td></tr></tbody></table>

רבייה בקנה מידה קטנה של ipscs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון immunocytochemical שיגרתי

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

יש עניין רב בשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) למידול מחלות וטיפולים בתאים בשל הספציפיות של המטופל והגזע האופייני להם. עם זאת, יש לאשר את הפלוריפוטנטיות של iPSCs, שהיא חיונית לפונקציונליות שלהם, לפני שניתן יהיה להשתמש בתאים אלה ביישומים כאלה. בעוד שאפיון קפדני של iPSCs, באמצעות מבחנים תאיים ותפקודיים שונים הכרחי כדי לבסס את הפלוריפוטנטיות שלהם, ניתן להשיג הערכה שגרתית של תחזוקת פלוריפוטנטיות בצורה פשוטה ויעילה יותר באמצעות טכניקות אימונוציטוכימיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטתי לתרבית hiPSCs, באופן מוקטן, כדי להקל במיוחד על אימות מצבם הפלוריפוטנטי באמצעות אימונוציטוכימיה. ליתר דיוק, מתודולוגיה זו כוללת אמצעי יעיל וחסכוני לגידול iPSCs בתנאים נטולי סרום וציפוי שלהם על שקופיות תא קטנות או כיסויי זכוכית אידיאליים לאימונוציטוכימיה.

פרוטוקול זה מספק תיאור צעד חכם של איך iPSCs אדם ניתן להעביר שכבת מזין מזין ללא תנאים, ולאחר מכן מופץ באופן מוגבל כדי לאפשר במיוחד immunocytochemistry החסכונית לצורך וידוא תחזוקת pluripotency. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של פרוטוקול זה. איור 2 א מראה מושבות hiPSC גוברת על iMEFs 6 צלחות היטב. מושבות אלה מפגינים מורפולוגיה טיפוסית בעלת גבולות מוגדרים ומרכזיים בהירים בשלב צפוף. כפי שניתן לראות בתרשים 2B, ל...

אפיון קבוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כדי לוודא שמירה על מצבם הפלוריפוטנטי, הוא צעד חשוב לפני שתאים אלה משמשים ליישומים אחרים. כאן אנו מתארים שיטה להתפשטות בקנה מידה קטן של iPSCs אנושיים שתוכננה במיוחד כדי לאפשר אפיון קל ושגרתי שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

המטרה הכללית של שיטת תרבית זו היא להנחית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים, או human iPSCs, בקנה מידה קטן כדי לאפשר באופן ספציפי את אפיון השגרה שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה. פרוטוקול זה מהמעבדה שלי מציג טכניקה של צמצום קנה מידה כדי להעביר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים משכבת העוובר הבסיסית לתשתית המתאימה יותר לזיהוי אנטיגנים באמצעות נוגדנים ספציפיים לפלוריפוטנטיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת אמצעי יעיל מבחינת זמן ועלות לגידול תאים פלוריפוטנטיים בפתליות עם תאי תרבית קטנים או על לוחות כיסוי, האידיאליים לאימונוציטוכימיה.ביום ההעברה, הוצא את הפלטה המצופה במטריקס מטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והשאר את הפלטה להסתגל לטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בתוך מנדף תרביות רקמה. לאחר מכן, שאב את המצע מבאר אחת של פלטה בעלת שש בארות של תרבית iPSC אנושית הגדלה על iMEFs והחלף אותו ב-500 microliters של ריאגנט פירוק קולגנאז. לאחר מכן, דגור את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות, עד ששולי המושבות של ה-iPSC נראים כמורמים מעט כפי שנצפה תחת המיקרוסקופ; לאחר מכן, שאב בזהירות את ריאגנט הפירוק ושטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.מכיוון שפרופיל הדיסוסיאציה של כל קו iPSC ספציפי עשוי להיות שונה, חשוב לעקוב אחר התנתקות המושבות תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את תקופת האינקובציה האופטימלית הנדרשת עם ריאגנט הדיסוסיאציה. הוסיפו לבאר מיליליטר אחד של מצע mTeSR complete בטמפרטורת החדר עם 10 nanograms per milliliter של ROCK inhibitor. באמצעות מיקרוסקופ פאזה קטן הממוקם בחלקו בתוך המנדף, סמנו ובחרו ידנית אחת עד שתיים ממושבות iPSC אנושיות.דחפו את חלקי המושבה החרוצים לתוך המדיום באמצעות טיפ של פפית P200. לאחר מכן, שאבו את המטריקס מהבארים החדשות המיועדות לזריעה, תוך זהירות שלא להפריע לציפוי. העבירו מיליליטר אחד של תרחיף התאים מהבאר הישנה המכילה את ה-iPSCs החרוצים אל הבאר החדשה המצופה במטריקס.הניחו את הפלטה באינקובטור ונערו אותה בכמה תנועות מהירות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. לאחר העברת ה-human iPSCs מ-iMEF למטריצה חוץ-תאית (extracellular matrix), העבירו אותם לפלטה בעלת 12 בארות באופן דומה לשלבי הפסאז' הקודמים.מעבר זה מאפשר את סילוקן של כל ה-iMEFs שנותרו בתרבית ומבטיח שהתאים יסתגלו לתנאים ללא תאי הזנה (feeder free). דחפו את מספר המושבות הרצוי אל תוך המדיום באמצעות טיפ P200, ובצעו טיטרציה עדינה של תרחיף התאים פעמיים כנגד פינה אחת של הבאר כדי לפרק את מושבות ה-iPSC האנושיות לגושים בגודל של כ-50 עד 200 מיקרומטרים. עבור פלטה של 12 בארות, דחפו מושבה אחת עד שתיים אל תוך המדיום, ולאחר מכן העבירו את תרחיף התאים מהבאר הישנה לבאר חדשה אחת בפלטה של 12 בארות.נערה את הפלטה במספר תנועות מהירות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפרוס את התאים באופן אחיד, והניחו לפלטה לנוח למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. חלק זה כולל מעבר של ה-iPSCs מפלטות בעלות 12 בארות והעמדתם על שקופיות עם תא קטן ועל כיסויי זכוכית המתאימים לאימונוציטוכימיה. בהליך זה, שאבו את המצע מבערה אחת בפלטה בעלת 12 בארות של iPSCs אנושיים והחליפו אותו ב-500 microliters של בופר דיסוציאציה.דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך כသုံး עד שבע דקות, עד ששולי המושבות של ה-iPSC נראים כמי שהורמו מעט. לאחר מכן, שאבו בזהירות את בופר הדיסוציאציה והוסיפו לבאר מיליליטר אחד של מצע mTeSR complete בטמפרטורת הח adikום, עם 10 nanograms per milliliter של ROCK inhibitor. בעזרת מיקרוסקופ פאזה קטן המונח בתוך מנשפת תרביות הרקמה, דחפו את המושבות שהשתחררו ממשטח הפיתח אל תוך המצע, ולאחר מכן שאבו את המטריקס מפיתח 24 בארות חדש עם כיסויים ושמעתית (chamber slide), תוך הקפדה לא להפריע לציפוי.בצעו טיטרציה עדינה של תרחיף התאים פעמיים כנגד אחת מפינות הבאר כדי לפרק את מושבות ה-iPSC האנושיות לצברים בגודל של כ-50 עד 200 מיקרומטרים. העבירו 250 מיקרוליטרים של תרחיף התאים מהבאר הישנה לכל אחת מהבארים החדשות של שקופית עם תא בעל ארבע בארות. בעת הזריעה על לבישי הכסות, דחפו מושבה אחת מהבאר המקורית, תוך ביצוע טיטרציה, והעבירו את תרחיף התאים עליהן בבארים החדשות של פלטה בעלת 24 בארות.לאחר מכן, הגבירו את הנפח בכל באר חדשה ל-500 microliters באמצעות mTeSR1 המכיל 10 nanograms per milliliter של מעכב ROCK Y27632. לאחר מכן, הכניסו את שקופית התא (chamber slide) ואת כיסויי הזכוכית (cover slips) לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כאשר תאי ה-iPSCs האנושיים מגיעים למצב של התלכדות (confluence), התאים מוכנים לביצוע אימונוציטוכימיה באמצעות קיבוע סטנדרטי ב-paraformaldehyde וחסימה לפני דגירה עם הנוגדן הראשוני.כעת, הכינו ריכוז קבוע מראש של הנוגדן לפני-השטח, SSEA4 או TRA-1-60, על ידי דילולו בתמיסות חסימה ללא Triton X-100. עבור למשטיות תאיים (chamber slides), הכינו כמות מספקת של תמיסת נוגדנים על ידי ערבוב של 298.5 microliters של תמיסת חסימה ו-1.5 microliters של נוגדן ראשוני anti-SSEA4 או TRA-160, כך שכל באר תקבל 300 microliters של תמיסת נוגדנים. שאבו את תמיסת החסימה מلامשטיות התאים והעבירו את הנוגדן הראשוני לבארי המתאימים.עבור לוחות כיסוי, מקריו 40 µL מתמיסת נוגדנים אל תוך צלחית מצופה ב-Parafilm. הפוך בזהירות את לוח הכיסוי כך שצד התאים יפנה כלפי מטה אל תוך התמיסה, והדגר את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת בבוקר, הסר את תמיסת הנוגדנים מהשקפיות בעלות ארבעת התאים ושטוף את התאים שלוש פעמים, למשך 5 עד 10 דקות בכל פעם, עם PBS.עבור כיסיי הזריכה, החזירו אותם אל בארות של פלטת 24 בארות ושטפו אותם ב-PBS, ולאחר מכן המשיכו באופן דומה לדגירה של הנוגדן הראשוני גם עבור דגירת הנוגדן המשני, לפני הכנת התאים הצבועיים אימונולוגית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן מוצגת מושבת iPSC צפופה שגדלה על תאי מאכלס iMEF. לאחר המעבר הראשוני לפלטת 12 בארות מצופה במטריקס במצע ללא סרום, ייתכן שעדיין ייראו מספר תאי iMEF בתרבית.תמונה זו מציגה מורפולוגיה טיפוסית של מושבת iPSC בשכבה אחת שגודלה ללא תאי מאכילה, ובשלב זה אין iMEFs שנותרו בתרבית. תמונות אימונופלואורסצנציה מייצגות של iPSCs שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי, המראות ביטוי חיובי של סמני פלוריפוטנציה Oct-4 ו-SSEA4 עם צביעת הגרעין DAPI, וכן Sox2 ו-TRA-1-60 עם DAPI. שתי התמונות הללו הן תמונות חפיפה (overlay).במידה ושולטים בטכניקה זו, היא מספקת דרך חסכונית להעביר iPSCs משכבות הזנה של iMEF למשטחי מטריצה ולבצע אימונוציטוכימיה, ובכך לחסוך זמן וריאגנטים יקרים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שכל קו ראשוני של iPSC מתנהג באופן שונה בתרבית ויש לנטר אותו במהלך תהליכי ההעברה והזריעה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה כיצד לגדל ולהעביר human iPSCs באופן חסכוני בקנה מידה קטן לצורך אפיון אימונוציטוכימי שגרתי.

small-scale-propagation-human-ipscs-serum-free-conditions-for-routine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים נטולי הזנה באמצעות שילוב של וקטורים של וירוס מטריג'ל וסנדאי המכילים גורמי תכנות מחדש.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

פרוטוקול מוצג להכין hydrogels אסיד פוליוויניל אלכוהול-co-itaconic עם נוקשות בדרגות שונות, אשר היו הושתל עם ובלי oligopeptides, לחקור את השפעת הנוקשות של biomaterials על בידול והתפשטות תאי גזע. הנוקשות של hydrogels היה בשליטת הזמן crosslinking.

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

אנו מציגים כאן עבור הבידול בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי לתוך כל נגזרת somite (myotome, sclerotome, פלסטיים ו syndetome) פרוטוקול בתנאים מוגדרים כימי, אשר יש יישומים בדוגמנות מחלות בעתיד, טיפולים מבוססי תא לכירורגיה אורטופדית.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

מטרת הפרוטוקול היא להשוות בין תנאי ציפוי שונים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי להעריך כיצד ציפוי דיפרנציאלי משפיע על קצב הצמיחה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). בפרט, אנו שואפים ליצור תנאים להשגת צמיחה אופטימלית של תרביות iPSC.

מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאסטרוציטים פונקציונליים ספציפיים למוח הקדמי. זה מאפשר לחקור את תפקידם של תאי גליה בפתוגנזה של הפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון תסמונת ה-X השביר, ומודלים של הפרעות מוח אחרות.

יצירה ואפיון של אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וחסרים ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר

למד שיטה לרבייה בקנה מידה קטנה של תאי גזע iPSCs אנושיים ללא סרום, המאפשרת אפיון Immunocytochemical שגרתי. טכניקה זו חוסכת זמן ועלויות בתהליך הגידול והאפיון.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

גלה סרטונים נוספים