ממוקד באתרו גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מוטציות ספציפיות בגנים של היסטון במיקומים הכרומוזומיים האנדוגניים שלהם בתאי שמרים ניצנים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את התרומה של שאריות היסטון ספציפיות במגוון תהליכים המשתמשים בכרומטין כמצע, כגון שעתוק DNA, כל שילוב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למקד גנים ספציפיים של היסטון למוטגנזה למרות העובדה שבשמרים, כל חלבון היסטון מקודד על ידי שני גנים הומולוגיים מאוד שאינם אלליים.

לאחר יצירת זן שמרים עם גן היסטון המטרה שהוחלף ב-URA3, צור תוצרי PCR עבור שני מקטעים חופפים חלקית של גן היסטון המטרה על ידי הגדרת התגובה הבאה למחצית הראשונה של הגן. עבור המחצית השנייה של הגן, הגדר תגובת PCR דומה באמצעות פריימרים שונים. הנח את התגובות בתרמו-סייקלר והגדר את התוכנית הבאה.

הפעל 20 עד 50 מיקרוליטר מתגובות ה-PCR על ג'ל אגרוז עם נקודת התכה נמוכה של 0.9% במאגר TBE. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את מוצרי ה-PCR מהג'ל ולהעביר כל חלק לצינור של 1.5 מיליליטר. אחסן את נתחי האגרוז בחום של 20 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש.

כדי להכין תבנית DNA לתגובות ה-PCR ליצירת מוצרי PCR בגודל מלא, ממיסים את קטעי האגרוז בגוש חום ב-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מערבולת הצינורות כל דקה עד שתיים כדי לעזור בהמסה. העבירו כמות מוגדרת של אגרוז מומס מכל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד וערבבו את הצינור על ידי מערבולת.

השתמש בזה כתבנית ל-PCR היתוך ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להגביר כמות גדולה של מוצר PCR בגודל מלא, הגדר שש תגובות PCR כל אחת עם הריאגנטים הבאים. הנח את הצינורות בתרמו-סייקלר והפעל את התגובות עם ההגדרות הבאות.

רכז את מוצרי ה-PCR באמצעות משקעים והשתמש בהם לטרנספורמציה משותפת עם פלסמיד עמוד השדרה על פי פרוטוקול הטקסט. כדי לסנן את אובדן הגן URA3 כתוצאה משילוב מוצר PCR, העתק תאי צלחת מלוחות 1 עד 20 על ידי הסרת מכסה הצלחת ולחיצה על הצלחת המכילה מושבות על קטיפה סטרילית. העבירו את התאים מהקטיפה לצלחת 5-FOA על ידי לחיצה על הצלחת על הקטיפה.

דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לאחר מכן בדוק בזהירות את הצלחות לצמיחה. לאחר פסים ודגירה של מושבות מועמדות על לוחות YPD על פי פרוטוקול הטקסט, העתק כל צלחת טיהור YPD לצלחת YPD טרייה, לצלחת נשירה חסרת אורציל כדי לבדוק את אובדן הגן URA3, וצלחת נשירה שנייה כדי לנטר נוכחות או היעדר פלסמיד עמוד השדרה.

לאחר הדגירה, זהה מושבה מכל דגימה מועמדת שגדלה על צלחת ה-YPD אך לא גדלה על אף אחת מצלחות הנשירה. החזירו את המושבות הללו על צלחות YPD טריות. כאמור לשילוב נכון של האלל המוטנטי באמצעות PCR על פי פרוטוקול הטקסט.

איור זה מציג את תוצאות ה-PCR ליצירת שני מקטעי HHT2 חופפים חלקית עם המוטציות הרצויות שבסופו של דבר מביאות לשינוי קודון AGA ל-GAA המייצר מוטציה R53E. התוצאה של תגובת PCR היתוך שיצרה את מוצרי ה-PCR בגודל מלא מודגמת כאן. מוצרי ה-PCR בגודל מלא הכילו 195 ו-220 אזורי זוגות בסיסים הומולוגיים לאזורים במעלה הזרם ובמורד הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה HHT2 בהתאמה כדי להניע רקומבינציה הומולוגית.

בטרנספורמציה לדוגמה זו, מוצרי ה-PCR בגודל מלא הומרו יחד עם הפלסמיד המסומן HIS-3 ונבחרו טרנספורמטורים על צלחות חסרות היסטידין. המושבות החיוביות שלו נבדקו לאחר מכן לעמידות ל-5-FOA. מוצגות דוגמאות של מועמדים וכן דוגמאות שסביר להניח שלא ייצגו את אירועי האינטגרציה הרצויים.

12 דגימות מועמדות זוהו ועברו ניתוח PCR להחלפת הגן URA3 בתוצרי PCR מוטנטיים. ארבעה מועמדים הראו שילוב של מוצר PCR במיקום הנכון. אחד מהמועמדים הללו מוצג בנתיב ארבע.

מכיוון שהמוטציה AG2GA יוצרת אתר הגבלה חדש של EcoR1, העיכול עם EcoR1 בוצע באחת מדגימות ה-PCR המוצלחות כדי להוכיח שהרצף המוטנטי אכן שולב בגנום. ברגע שכל הריאגנטים זמינים, אמור להיות אפשרי להשיג תאי שמרים המכילים את מוטציות ההיסטון הרצויות במסגרת הזמן או 15 עד 20 יום. לאחר שנוצרה המוטציה הרצויה בזן המארח, ניתן להשיג תאים המבטאים את חלבון ההיסטון המטרה אך ורק מהגן המוטגניזציה באמצעות הצלבות גנטיות מתאימות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ייתכן שיהיה צורך להתאים את ההיקפים לתגובות ה-PCR על סמך אופי הפריימרים הספציפיים המשמשים בניסויים והגדלים הצפויים של מוצרי ה-PCR. למרות שהליך זה מתאים היטב למוטגנזה של גן היסטון מכיוון שהוא מאפשר להתמקד בגן היסטון ספציפי למרות נוכחותו של גן הומולוגי מאוד, שאינו אללי, ניתן להשתמש בו גם ליצירת מוטציות במיקומים גנומיים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מוטציות היסטון NC2 ממוקדות בשמרים ניצנים באמצעות שילוב של גישות PCR וטכניקות גנטיקה של שמרים.

אל תשכח שחשיפה לאור UV עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש להשתמש במשקפי מגן, מגנים וביגוד בזמן עבודה עם משקפי מגן. כמו כן, יש ללבוש כפפות, משקפי מגן וביגוד מגן לאורך רוב שלבי ההליך.