Name: ממוקד באתרו גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד שיטה ליצירת מוטציות ספציפיות בגני היסטון במיקומים כרומוזומיים אנדוגניים ב-Saccharomyces cerevisiae. טכניקה זו מאפשרת לחקור תפקידי שיירי היסטון בתהליכי כרומטין כמו שעתוק DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ל-Reine Protacio על ההערות המועילות במהלך הכנת כתב היד הזה. אנו מביעים את תודתנו לקרן הלאומית למדע (מענקים מס' 1243680 ו-1613754) ולתוכנית האודיסיאה של מכללת הנדריקס על התמיכה במימון.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Rando, O. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin and transcription in yeast.</a> Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delitto+perfetto+targeted+mutagenesis+in+yeast+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides.</a> Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).</li>
<li>Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+genomic+%28SSG%29+and+random+domain-localized+%28RDL%29+mutagenesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast.</a> BMC Biotechnol. 4, 7(2004).</li>
<li>Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+PCR-based+allele+replacement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cloning-free PCR-based allele replacement methods.</a> Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
<li>Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265094">Manipulation of cloned yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Treco, D. A., Lundblad, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265093">Preparation of yeast media.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mutational+analysis+of+a+histone+H3+residue+in+budding+yeast+provides+insights+into+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics.</a> G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Cross, S. L., Smith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+structure+and+cell+cycle+expression+of+mRNAs+encoded+by+two+histone+H3-H4+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).</li>
<li>Libuda, D. E., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+histone+genes+by+circular+chromosome+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הרמה הגבוהה של הומולוגיה ברצף בין שני גנים שאינם אללים שקוד לכל אחד החלבונים היסטון ארבע ליבות בתאים הפלואידים cerevisiae ס יכול לייצג אתגר עבור חוקרים המבקשים למקד ספציפית אחת משני הגנים עבור mutagenesis. שתואר לעיל מתודולוגיות mutagenesis שמרים, כולל Perfetto Delitto, אתר ספציפי גנומי (SSG) mutagenesis, ושיטות החלפת אלל ללא שיבוט מבוסס PCR 5, 6, 7, כמו גם שמרים האחרוני...

ארבעת החלבונים היסטון הליבה H2A, H2B, H3, ו- H4 ממלאים תפקידים מרכזיים הדחיסה, ארגון ותפקוד של כרומוזומים איקריוטיים. שני סטים של כל אחד היסטונים אלה יוצרים את octamer היסטון, סליל מולקולרי שמנתב את העטיפה של זוגות בסיסים ~ 147 של DNA סביב עצמו, בסופו של דבר וכתוצאה מכך ההיווצרות של הנוקלאוזום 1. נוקלאוזום הם משתתפים פעילים במגוון תהליכים מבוסס כרומוזום, כגון הסדרת שעתוק גנים לבין ההיווצרות של euchromatin ו heterochromatin פני הכרומוזומים, וככזה הוא העיקר של מחקר אינטנסיבי במהלך העשורים האחרונים. מספר המנגנונים תואר שבאמצעותו נוקלאוזום ניתן להשפיע בדרכים שיכולים להקל על ביצוע של תהליכים ספציפיים - מנגנונים אלה כוללים שינוי posttranslational של שאריות היסטון, שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP, וארגון מחדש הנוקלאוזום ATP-עצמאיוהרכבה / פירוק 2, 3. השמרים ניצני שמר האפייה הוא אורגניזם מודל חזק במיוחד להבנת תפקוד היסטון אאוקריוטים. זו ניתן לייחס במידה רבה את הרמה הגבוהה של שימור אבולוציוני של חלבונים היסטון ברחבי eukarya תחום רמת המוכנות של שמרים למגוון ניסיוני גנטיים ביוכימיים מתקרב 4. גישות Reverse-גנטיות בשמרים היו בשימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעות של מוטציות ספציפיות היסטון על היבטים שונים של ביולוגיה הכרומטין. עבור אלו סוגים של ניסויים הוא לעתים קרובות עדיף להשתמש בתאים בם ההיסטונים המוטציה באים לידי ביטוי מן הלוקוסים הגנומי מולדתם, כמו ביטוי מן פלסמידים אוטונומיים יכול להוביל לרמות תאיים החריגות של חלבונים היסטון (עקב מספרים שונים של פלסמידים בתאים) ו שינוי מקביל של הכרומטין environments, אשר בסופו של דבר יכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות. כאן אנו מתארים טכניקה PCR מבוססת המאפשרת mutagenesis הממוקד של גני היסטון במקומות גנומי מולדתם שאינו דורשים צעד שיבוט ותוצאות בדור של המוטציה הרצויה (ים) ללא רצפי DNA אקסוגני שאריות בגנום. טכניקה זו מנצלת את המערכה ההומולוגית היעילה שמרים ויש לו כמה תכונות משותפות עם בטכניקות דומות אחרות שפותחו על ידי קבוצות אחרות - בעיקר Delitto Perfetto, אתר ספציפי גנומי (SSG) mutagenesis, שיבוט ללא אלל מבוסס PCR שיטות החלפה 5, 6, 7. עם זאת, הטכניקה נתאר יש היבט זה עושה את זה במיוחד מתאים היטב mutagenesis של גני היסטון. בתאי שמרים הפלואידים, כל אחד ההיסטונים הליבה ארבעה מקודד על ידי שתי שאינוגני llelic ו הומולוגיים מאוד: למשל, H3 היסטון מקודדים על ידי גני HHT1 ו HHT2, ואת מסגרות הקריאה הפתוחות (ORFs) משני הגנים הן מעל 90% זהות ברצף. רמה גבוהה זו של הומולוגיה יכולה לסבך ניסויים שנועדו למקד ספציפי אחד הגנים שני קידוד-היסטון עבור mutagenesis. בעוד השיטות הנ&quot;ל לעתים קרובות דורשים שימוש לפחות כמה רצפים בתוך ORF של גן המטרה לנהוג הומולוגיים, הטכניקה שאנו מתארים כאן עושה שימוש רצפים איגוף ORFs של גנים היסטון (אשר חולקים הרבה פחות הומולוגיה ברצף) עבור צעד רקומבינציה, ובכך להגדיל את הסבירות של מיקוד המוצלח של mutagenesis אל המוקד הרצוי. יתר על כן, באזורים ההומולוגיים שמניעים רקומבינציה יכולים להיות מאוד נרחבים, ובכך תורמים עוד יותר הומולוגי ממוקדים ויעיל.

<table><tbody><tr><td>סולם DNA 1 kb (תקני DNA)</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד)</td> <td>תמיסת ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 מ', pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (200 הוכחה)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידראט</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polymerase (פולימראז DNA בנאמנות גבוהה)&nbsp; ומאגר 5x</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DNA של זרע סלמון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (בסיס Tris, צורת אבקה)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט טריהידרט</td><td>סיגמא</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (אגרוז בטמפרטורת מטלינג נמוכה)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase ו-10x Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>קיסמים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>A-D(+)-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>למדיה שמרים</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>למדיה שמרים</td></tr><tr><td>פפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0118-07-2</td><td>עבור</td></tr><tr><td>YPD בינוני תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0127-17-9</td><td>עבור YPD בינוני</td></tr><tr><td>4-חומצה אמינו-בנזואית</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>אדנין</td><td>סיגמא</td><td>A8626-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>G2879-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-אלנין</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ארגינין מונוהידרוכלוריד</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-אספרגין מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה L-אספרטית נתרן מלח מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית הידרוכלוריד</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>למינימום נשירה מלאה&nbsp;</td></tr><tr><td>L-היסטידין מונוהידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-איזולאוצין</td><td>סיגמא</td><td>I2752-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>סיגמא</td><td>L8000-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>ל-ליזין מונוהידרוכלוריד</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-מתיונין</td><td>סיגמא</td><td>M9625-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-סרין</td><td>סיגמא</td><td>S4500-100G</td><td>לנשירה מינימלית מלאה של המדיום&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-טריפטופן</td><td>סיגמא</td><td>T0254-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-טירוזין</td><td>סיגמא</td><td>T3754-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>אינוזיטול</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A702-500</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים</td><td>פישר מדעי</td><td>DF0919-07-3</td><td>למדיום נשירה מינימלי מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>5-חומצה פלואורורוטית (5-FOA)</td> <td>אמריקן ביו</td><td>AB04067-00005</td><td>עבור&nbsp; 5-FOA בינוני</td></tr></tbody></table>

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

אנו מתארים מערכת מבוססת PCR ורקומבינציה הומולוגית ליצירת מוטציות ממוקדות בגנים היסטונים בתאי שמרים ניצנים. האללים המוטנטיים המתקבלים שוכנים באתרים הגנומיים האנדוגניים שלהם ולא נותרו רצפי DNA אקסוגניים בגנום לאחר ההליך. מכיוון שבתאי שמרים הפלואידים כל אחד מארבעת חלבוני הליבה של ההיסטון מקודד על ידי שני גנים לא אלליים עם מסגרות קריאה פתוחות הומולוגיות מאוד (ORFs), מיקוד מוטגנזה ספציפית לאחד משני גנים המקודדים חלבון היסטון מסוים יכול להיות בעייתי. האסטרטגיה שאנו מתארים כאן עוקפת בעיה זו על ידי שימוש ברצפים מחוץ ל-ORF של גני המטרה ולא בתוכם לשלב הרקומבינציה ההומולוגית. מאפיין נוסף של מערכת זו הוא שאזורי ה-DNA המניעים את שלבי הרקומבינציה ההומולוגית יכולים להיות נרחבים מאוד, ובכך להגדיל את הסבירות לאירועי אינטגרציה מוצלחים. תכונות אלה הופכות את האסטרטגיה הזו למתאימה במיוחד למוטגנזה של גנים היסטונים, אך ניתן להתאים אותה גם למוטגנזה של גנים אחרים בגנום השמרים.

אנו מתארים את הדור של אלל hht2 לבטא חלבון מוטנטי H3 היסטון מחסה חילוף במיקום 53 מתוך ארגינין חומצת גלוטמית (H3-R53E מוטציה) בתור דוגמה מייצגת של ממוקדת באסטרטגיה mutagenesis באתרו. יצרנו זן שבו ORF כולו של HHT2 מוחלף גן URA3 (ראה שלב 1 של הפרוטוקול). זן זה, yAAD156, גם אוצרים בתוכם אלל his3Δ200,...

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור מוטציות ספציפיות בגנים של היסטונים במיקומם הכרומוזומלי האנדוגני בתאי שמרים פורחים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את תרומתם של שאריות היסטון ספציפיות במגוון תהליכים המשתמשים בכרומטין כתסריט, כגון שעתוק DNA, בכל שילוב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לכוון גנים ספציפיים של היסטון למוטגנזה, למרות העובדה שבשמרים, כל חלבון היסטון מקודד על ידי שני גנים שאינם אלליים בעלי הומולוגיה גבוהה.לאחר יצירת זן שמרים שבו שומש基因 ההיסטון המטרה הושבת והוחלף על ידי URA3, ייצרו תוצרי PCR עבור שני מקטעים החופפים חלקית של גן ההיסטון המטרה, על ידי ביצוע התגובה הבאה עבור המחצית הראשונה של הגן. עבור המחצית השנייה של הגן, בצעו תגובת PCR דומה תוך שימוש בפריימרים שונים. הכניסו את התגובות לטרמוציקלר והגדירו את התוכנית הבאה.הריצו 20 עד 50 µL של תגובות ה-PCR על ג'ל אגרוז ב-%0.9 עם נקודת התכה נמוכה בבופר TBE. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער נקי כדי לחתוך את תוצרי ה-PCR מהג'ל והעבירו כל קטע למבחנה של 1.5 mL. אחסנו את חתיכות האגרוז ב-20 °C עד למועד השימוש.כדי להכין DNA תבנית לתגובות ה-PCR ליצירת תוצרי PCR מלאים, המסו את מקטעי האגרוז בבלוק חימום בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות. השתמשו בוורטקס (Vortex) למבחנות מדי דקה עד שתי דקות כדי לסייע בהמסה. העבירו כמות קבועה של אגרוז מומס מכל דגי

targeted-in-situ-mutagenesis-of-histone-genes-in-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מחקרים גנטיים שמרים יכול להיות מועסק לחקור את הפונקציות מולקולרית תאית של הגנים האנושיים במטבוליזם DNA התאי. מתוארות שיטות לאפיון הגנטי של...

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Assay HO-מגורה טרנסלוקציה מפקחת גדיל יחיד חישול בעקבות הקמתה של גדיל הדנ"א הכפול הפסקות בבית לוקוסים מספר...

Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae</em

מקור: Bennett, S. A., et al.,  אפיון שינויים בשינוי פוסט-תרגומי של היסטון במודלים של חלבונים ניווניים של שמרים. J. Vis. Exp. (2019). סרטון זה מדגים את ההליך של הערכת שינויים בהיסטון בתאי שמרים המבטאים יתר על המידה חלבונים ניווניים. השלבים כוללים ליזיס תאים, צנטריפוגה, אלקטרופורזה, העברת ממברנה וזיהוי מבוסס נוגדנים של היסטונים ששונו.

איתור שינויים בהיסטון בתאי שמרים עם ביטוי יתר של חלבון ניווני

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

למד שיטה ליצירת מוטציות ספציפיות בגני היסטון במיקומים כרומוזומיים אנדוגניים ב-Saccharomyces cerevisiae. טכניקה זו מאפשרת לחקור תפקידי שיירי היסטון בתהליכי כרומטין כמו שעתוק DNA.

ממוקד

גלה סרטונים נוספים