Name: בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1 + אבות הלבלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד פרוטוקול בידול ארבע שלבים ליצירת תאי אב לבלב מבטאי NKX6.1 מתאי גזע עובריים אנושיים pluripotent. שיטה זו מספקת מודל לחקר התפתחות הלבלב וטיפול בסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כתב היד זו נתמכה על ידי מימון כללי בטורונטו קרן המערבי בנטינג &amp; Best סוכרת מרכז-אוניברסיטת בריאות רשת בוגר פרס.

1. הכנת פתרונות ומדיה הערה: הכן את כל התקשורת עבור תרבית תאים בסביבה סטרילית. יש מדיה להתבצע ומשומשים מיד. פרטים מגיבים ניתנים לוח החומרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יום 0 בידול מדיה: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 2 מיקרומטר CHIR 99,021, 100 ng / ml Activin א &#39;, 10 4 M MTG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיה בידול יום 1-2: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 100 ng / ml Activin א &#39;, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל חומצה אסקורבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיה בידול יום 3-5: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 1% B27, 10 4 M MTG, 0.75 מיקרומטר Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיה בידול יום 6-7: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml FGF10, 0.25 SANT-1 מיקרומטר, 2 מיקרומטר החומצה הרטינואית, 50 ng / ml noggin. הערה: רטינואיתחומצה יש להוסיף התקשורת אחרונה ומדיה צריכה להיות מוגנת מפני אור כדי למנוע חמצוני שפלה 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יום 8-12 בידול מדיה: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 מ&quot;מ Nicotinamide. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ FACS: 10% FBS ב PBS, מינוס סידן ומגנזיום. </li></ol> 2. בידול hESC הערה: hESC הם הפשירו, passaged והרחיב על פיברובלסטים עובריים בעכבר מוקרן בנוכחות מדיה מבוססת KOSR בתוספת bFGF 16. HESCs מוכן בידול כאשר התאים מגיעים 80-95% confluency. בשלב זה המושבות צריכות להיות גדולות עם גבולות מוגדרים וכן (איור 1 א) &#39;domelike&#39; מבנה. כל תרבית התאים מתבצעת שטוח תחתון, צלחות שטופלו בתרבית רקמה מצופית 0.1% ג&#39;לטין. בדרך כלל, התאים גדלים ב 6 או12-גם צלחות, במחזורי התקשורת של 2 מ&quot;ל או 1 מ&quot;ל, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, להתחיל בידול על ידי החלפת מדיה המבוססת KOSR עם מדיה בידול 0 יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים 1 ו -2, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 1-2 בידול מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, תאי קציר עבור cytometry זרימה. אם התאים לבטא יותר מ -90% CXCR4 + / CD117 +, המשך לשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים 3 ו -5, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 3-5 בידול מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים 6 ו -7, להחליף עם מדיה בידול יום 6-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים 8, 10 ו -12, להחליף עם יום 8-12 מדיה בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 13, תאי קציר עבור cytometry זרימה כדי לקבוע PDX1 וביטוי NKX6-1. </li></ol> 3. תאי קציר עבור ניתוח cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק תאים עםפתרון טריפסין מסחרי 1x על פי הפרוטוקול של היצרן ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון טריפסין מסחרי ו resuspend תאים בודדים 1,000 μl FACS חוצץ עם 30 μl DNase I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מסננים באמצעות מסננת תא רשת ניילון 35 מיקרומטר ולהעביר צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 455 XG במשך 5 דקות. כן תאים עבור מכתים או לחיות או קבוע. </li></ol> 4. מכתים עבור cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה לקראת מכתים חי ביום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1,000 μl FACS חוצץ. העברת 200 μl (כ 1-3 x 10 5 תאים) לשתי בארות של צלחת 96-היטב (הן דוגמאות בלא כתם ומוכתמת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם נוגדנים ראשוניים מצומדות, CXCR4: APC ו CD117: PE (ראה M aterials טבלה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות גלולות ב 100 μl חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ&quot;ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ&quot;ל מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ על זרימת cytometer 17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה לקראת מכתים קבוע ביום 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בפתרון קיבעון / permeabilization מסחרי למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 455 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 400 μl פתרון פרם / Wash. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 μl של המדגם (כ 0.5-1 x 10 6 תאים) כדי two בארות צלחת 96-היטב (לשליטה IgG ו PDX1 / NKX6-1 מכתים). צנטריפוגה ב 931 XG למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא 100 μl פתרון פרם / לשטוף המכיל נוגדני שליטה אנטי PDX1 ואנטי NKX6-1 ראשוני או אלוטיפ (ראה לוח חומרים). דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. דגימות גלולות ב 100 μl פתרון פרם / Wash. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות 100 μl פרם / Wash המכילה נוגדנים משני בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות גלולות ב 100 μl פרמו / לשטוף פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נציגלאכול צעד 4.2.9 ו 4.2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ&quot;ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ&quot;ל מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ על זרימת cytometer 17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

יצירה בהצלחה NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs במבחנה מסתמכת על השימוש של תרבויות באיכות גבוהות של hPSCs והבחנה מכוון מעורבות בוויסות המדויקת של מסלולי איתות ספציפיים ששולטים שלבי התפתחות מפתח במהלך התפתחות לבלב. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום ביטוי חזק של NKX6-1 פני מגוון רחב של קווי hPSC כמו בעבר הראו 3, על מנת להבטיח דור NKX6-1 יעיל השיקולים הבאים צריכים להתבצע. חשוב שכל הכנות תרבות ומדיה תא מבוצעות בסביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום. ...

השכיחות של סוכרת היא הגדילה על פי איגוד הסוכרת הקנדי, ההערכה היא כי למעלה מ -11 מיליון בני אדם בקנדה הוא סוכרת או prediabetic, עם 5-10% של אנשים אלה שיש סוכרת סוג 1 (T1D) 1. T1D היא מחלה אוטואימונית אשר נגרמת על ידי הרס של תאי β לייצר אינסולין אשר ממוקמים בתוך איי לנגרהנס. נכון לעכשיו, אנשים החיים עם T1D דורשים מקורות חיצוניים של אינסולין 2. למרות ההתקדמות בטיפול אינסולין, חולי T1D ממשיכים מתקשים לווסת את רמות הסוכר בדם שלהם ממשיכים לסבול הן חָסֵר ו היפרגליקמיה. טופס מבטיח טיפול לשחזר normoglycemia ב T1D הוא השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר יכול לשמש כדי ליצור אספקה בלתי מוגבלת של תאים המייצרים אינסולין β הוא in vivo ו במבחנה 3, <sעד class = &quot;Xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7. ההתמיינות hESCs כדי בטא דמויי תאים יכול לעשות את זה ניתן ללמוד סוכרת במבחנה, המאפשר זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול בסוכרת מסוג 2 ולספק תאים להשתלה לחולים T1D. הניסיון המוצלח ביותר ביצירת תאים מייצרי אינסולין hESCs במבחנה היא לשחזר את האירועים עובריים המתרחשות במהלך התפתחות הלבלב 4, 5. זה כרוך המניפולציה של מסלולי איתות מובהקים מודל שלבי מפתח מדויק של הלבלב מתפתח. פיתוח לבלב מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מאופיין על ידי הביטוי של CXCR4 ו CD117 (c-KIT) 8, 9. תקנה מדויקת של definitארגון endoderm ive נדרש להקמת צינור הבטן, אשר לאחר מכן עובר קדמי אל אחוריים ואת גחון-הגבה דפוסים. הגבה וניצני לבלב גחון לצאת מהאזור במעי הקדמי האחורי המבטא את גן homeobox לבלב תריסריון (Pdx1), אשר הוא הכרחי עבור התפתחות לבלב 10. הגבה וניצני גחון פתיל כדי ליצור את הלבלב, אשר לאחר מכן עובר שיפוץ נרחב אפיתל והרחבה 11. מחויבות השושלת האנדוקרינית אקסוקרינית מלווה דור ובתאים מולטיפוטנטיים (MPCs) המבטאים, בין היתר, את שעתוק גורמי Pdx1, Nkx6.1 ו Ptf1a 12, 13. MPCs שיהפכו תאי האנדוקרינית ductal ממשיך להביע Nkx6-1 תוך הפחתת ביטוי Ptf1a. בניגוד לכך, תאי שושלת אקסוקרינית יאבדו expression של Nkx6-1 ולתחזק Ptf1a הביטוי 12. גורם השכפול Nkx6-1 יש תפקיד מרכזי בפיתוח לבלב, בפרט במהלך ההתמיינות של תאי אב האנדוקרינית כדי בטאו תאים. כפי שתואר קודם לכן, המחיקה של תוצאות Nkx6-1 במבנה לקוי של תאי β במהלך התפתחות הלבלב 14. לכן, יצירת תאי β מייצר אינסולין הוא במבחנת in vivo דורשת האינדוקציה היעילה של Nkx6-1. אנחנו לאחרונה פתחנו פרוטוקול ביעילות ליצור PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs. HPSC נגזרים אלה אבות לבלב לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient 3. פרוטוקול הבידול ניתן לחלק 4 שלבים אופייניים: 1) אינדוקציה האנדודרם סופית, 2) דפוסים במעי הקדמי האחורי, 3) מפרט הלבלב ו -4) אינדוקציה NKX6-1. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל שלב של התמיינות מכוונת.

<table><tbody><tr><td><חזק>מדיה וציטוקינים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-תיוגליצרול (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף</td><td>תזונה טכנולוגיות חיים</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>דורסומורפין</td><td>סיגמא</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>מו"פ D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), פנול אדום</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים לזרימה ציטומטרית (דילול עבודה)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG (H+L), מצומד Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר בע"מ</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>עכבר בקרת איזוטיפ IgG&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון אימונוסקר בע"מ&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>בקרת איזוטיפ עיזים IgG</td><td>מו"פ D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2,000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

יש תאי גזע פלוריפוטנטיים היכולת עצמית לחדש ולבדל שושלות מרובות, מה שהופך אותם מקור אטרקטיבי עבור הדור של ובתאים לבלב שיכול לשמש לחקר וטיפול עתיד של סוכרת. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידול ארבעה שלבים שנועד ליצור ובתאי לבלב מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תאי הגזע האנושי פלוריפוטנטיים קווי (hPSC). הגישה שננקטה כדי ליצור ובתאי לבלב היא להבדיל hESCs לבנות מודל מדויק בשלבים קריטיים התפתחות לבלב. זה מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מושג על ידי culturing תא בנוכחות Activin A, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ו CHIR990210. בידול דפוסים בהמשך עם פיברובלסטים Growth Factor 10 (FGF10) ו Dorsomorphin מייצרים תאים דומים במעי הקדמי האחורי. התוספת של ברטיןOIC חומצה, שהגולגולת, SANT-1 ו FGF10 מבדיל תאים במעי הקדמי האחורי לתאים אופייני endoderm הלבלב. לבסוף, השילוב של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), Nicotinamide ו noggin מוביל הדור יעיל של PDX1 + / NKX6-1 + תאים. Cytometry זרימה מבוצע כדי לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים בשלבים המפתח של התפתחות הלבלב. PDX1 + / NKX6-1 + אבות הלבלב בסוף השלב 4 מסוגלים לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ויכולים להיות מובחן נוסף לייצר תאים מייצרי אינסולין במבחנה. לפיכך, הדור היעיל של PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, הוא בעלת חשיבות רבה כיוון שהיא מספקת פלטפורמה ללמוד פיתוח לבלב אנושי במבחנה מספקת מקור של תאים עם הפוטנציאל של הבחנה כדי תאי β שיכול EVentually לשמש לטיפול בסוכרת.

דור יעיל של אבות לבלב מסתמך על הגידול הנכון ותחזוקה של תאים שלא עברו התמיינות ואחריו התוספת המדויקת של מולקולות ספציפיות איתות במהלך פרוטוקול הבידול, כפי שמודגם סכמטי באיור 1 א. ביום 0, תאים שלא עברו התמיינות צריכים להיות ומחוברות 80-95% ומושבות צריכות להיות קצוות מוגדרים (איור 1 א). במהלך שלב 1, התקשורת תופיע מעונן סביר מאז מות תאים די נפוץ בשלב זה. עד סוף שלב 1, התאים צריכים לשתף להביע סמנים האנדודרם סופי, CXCR4 ...

כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק ביעילות תאי אב ללבלב המבטאים NKX6.1 מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים in vitro, על ידי גזירה (differentiation) של התאים דרך ארבעה שלבים מרכזיים של התפתחות הלבלב. באמצעות גזירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים דרך ארבעה שלבים מרכזיים של התפתחות הלבלב, פרוטוקול זה מספק מודל לחקר התפתחות הלבלב האנושי in vitro. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים הוא היכולת להפיקPercentages גבוהים של תאי אב ללבלב חיוביים ל-NKX6.1 תוך שימוש במגוון של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.בהינתן שלתאי אב ללבלב יש פוטנציאל לייצור תאי בטא דמויי תאי אינסולין, טכניקה זו תעניק לנו את ההזדמנות לפתח תאים לטיפול בסוכרת, לגילוי תרופות ולמידול מחלות. ביום אפס, התחל את הדיפרנציאציה על ידי החלפת מצע ה-KnockOut serum replacement במצע דיפרנציאציה ליום אפס. לאחר מכן, בימים אחד ושניים, נער את הפלטה בעדינות כדי להסיר תאים מתים מהשכבה החד-שכבתית (monolayer) לפני שאיבת המצע.לאחר מכן, החליפו את המצע במצע דיפרנציאציה של יום 1 עד 2. ביום השלישי, קצרו את התאים לצורך ציטומטריה זרימתית. אם התאים מבטאים יותר מ-90% של CXCR4 ו-CD117, הרי שהיעילות הושגה.לאחר מכן, נערו בעדינות את הפלטה כדי להסיר תאים מתים מהשכבה החד-שכבתית (monolayer) לפני השאיבה, והחליפו את המצע במצע בידול ליומיים שלושה עד חמישה. חשוב לוודא באמצעות ציטומטריית זרימה כי התרחשה השראה יעילה של ה-definitive endoderm עד היום השלישי. אם אחוז התאים המבטאים הן CXCR4 והן CD117 נמוך מ-90%, סביר להניח שהבידול לתאי אב ללבלב (pancreatic progenitors) ייפגע.בימים השישי והשביעי, החליפו את המצע למצע בידול לימים שש עד שבע. בימים השמינית, העשירי והשנים-עשר, החליפו את המצע למצע בידול לימים שמונה עד 12. לאחר מכן, ביום ה-13, אספו את התאים לצורך ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את ביטויי PDX1 ו-NKX6.1.כדי לקצור את התאים לניתוח בציטומטריה של זרימה, יש להפריד את התאים באמצעות תמיסת Trypsin מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן ולהדגיר את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, יש להסיר את תמיסת ה-Trypsin ולתרפות מחדש את התאים הבודדים ב-1,000 µL של באפר fax עם 30 µL של DNA One. לאחר מכן, יש לסנן את התאים באמצעות מסננת תאים מרשת ניילון של 35 µm ולהעבירם לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-455 ×g למשך חמש דקות לפני הכנת התאים לצביעה חיה או מקובעת. כעת, השעו את התאים מחדש ב-1,000 µL של תמיפת fax. העבירו 200 µL לשתי באערים של פלטת 96 באערים עבור הדגימות הלא צבועות והצבועות.לאחר מכן, סובב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות, לאחר מכן הסר את הנוזל העליון על ידי הפיכת הפלטה, צבע את התאים באמצעות נוגדן ראשוני מצומד בנפח סופי של 100 µL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר והגנם מהאור. לאחר מכן, סובב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות, ולאחר שתי דקות הסר את הנוזל העליון על ידי הפיכת הפלטה. לאחר מכן, השהה מחדש את הדגימות ב-100 µL של באפר fix.לאחר מכן, סובב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות. הסר את הנוזל העליון על ידי הפיכת הפלטה. לאחר מכן, השהה מחדש את הדגימות ב-300 עד 500 µL של fax buffer, העבר אותן למבחנות מיקרו בנפח 1 mL או למבחנות בעלות תחתית עגולה בנפח 5 mL, והרץ את הדגימות במכשיר flow cytometer.אם לא ניתן להריץ את הדגימות באופן מיידי, יש לאחסן אותן בטמפרטורה של 4°C ולהגן עליהן מאור. בהליך זה, יש לתלה שוב את משקע התאים בתמיסת קיבוע וחדירות (fixation and permeabilization) מסחרית למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C. לאחר 24 שעות, יש לצנטריפוג את הדגימה ב-455 ×g למשך חמש דקות, ולאחר מכן לתלה אותה שוב ב-400 µL של תמיסת שטיפת חדירות (perm wash) מסחרית.בשלב הבא, העבירו 200 µL מהדגימה לשתי באערים של פלטת 96 באערים עבור בקרת IgG וצביעה של PDX1 ו-NKX6.1, וסובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות. לאחר מכן, השביו את משקעי התאים ב-100 µL של תמיסת שטיפה חדירה (perm wash solution) מסחרית המכילה נוגדנים ראשוניים נגד PDX1 ונגד NKX6.1 או נוגדני בקרת איזוטופ. דגרו אותם למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.ביום למחרת, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות, הסירו את הנוזל העליון על ידי היפוך הפלטה והשעיקו מחדש את הדגימות ב-100 µL של תמיססת שטיפה מסחרית מסוג perm wash. לאחר מכן, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות. הסירו את הנוזל העליון על ידי היפוך הפלטה.לאחר מכן, השביה מחדש את הדגימות ב-100 µL של תמיסת שטיפה חדירה (perm wash solution) המכילה נוגדן שני, בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך הגנה מאור. לאחר שעה, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות, ולאחר מכן הסר את הנוזל העליון (supernatant) על ידי הפיכת הפלטה. לאחר מכן, השביה מחדש את הדגימות ב-100 µL של תמיסת שטיפה חדירה מסחרית, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g למשך שתי דקות, והסר את הנוזל העליון על ידי הפיכת הפלטה. לבסוף, השביה מחדש את הדגימה ב-100 µL של תמיסת שטיפה חדירה מסחרית וסבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-931 ×g פעם נוספת למשך שתי דקות לפני הסרת הנוזל העליון.בשלב הבא, השביה מחדש את הדגימות ב-300 עד 500 µL של fax buffer והעבר אותן למבחנות בדיקה נפרדות של 1 mL או למבחנות בעלות תחתית עגולה של 5 mL לצורך ביצוע ציטומטריית זרימה. מוצגת כאן תרשים של השראת תאי אב ללבלב מתאי גזע עובריים אנושיים, המציין את יום ההבדלה, שלב ההתפתחות, מצע הבסיס והציטוקינים שהתווספו בכל שלב. וכאן מוצגות תמונות בניגודיות פאזה (phase contrast) בשלבים מרכזיים של הבדלת הלבלב.תאי H1 בוצעו להם בידול בהתאם לפרוטוקול הבידול בן ארבעת השלבים המוצג. עם תאי גזע עובריים אנושיים לא מובדלים ביום אפס, אנדודרמה דפיניטיבית (definitive endoderm) בשלב אחד, מעי אחורי בשלב שני, אנדודרמה לבלב בשלב שלושה, ותאי אב אנדודרמיים של הלבלב החיוביים ל-NKX6.1 בשלב ארבעה. איור זה מציג תרשימי זרימה (flow cytometry) מייצגים מהיום השלישי עבור צביעת נוגדנים של CXCR4 PE ו-CD117 APC.כאן נמצאה הדגימה ללא הצביעה וכאן נמצאה הדגימה הצבועה. ואיור זה מציג תרשימי זרימה (flow cytometry) מייצגים מיום 13 עבור תאי אב ללבלב הגזורים משלב ארבע המבטאים NKX61 ו-PDX1. זוהי בקרת ה-IGG וזוהי הדגימה הצבועה.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 13 ימים. עם זאת, משך הזמן עשוי להשתנות בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבדוק את כל החומרים עקב שונות בין מנות (batches).לאחר ביצוע הפרוטוקול, ניתן להבדיל את תאי המוצא הלבלביים החיוביים ל-NKX6.1 לתאים דמויי בטא המייצרים אינסולין באמצעות פרוטוקולים גבאיים אחרים שפורסמו. דבר זה מספק פלטפורמה לחקר הבשלת ותפתחות תאי בטא in vitro. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להבדיל ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי מוצא לבלביים על ידי הובלת התאים דרך ארבעה שלבי התפתחות מרכזיים.

efficient-differentiation-pluripotent-stem-cells-to-nkx6-1-pancreatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים את הדור של תאי אב עצביים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים ומהונדסים. hPSCs מתמיינים לתאי אב עצביים באמצעות מדיום התמיינות עצבי. בעוד התמיינות מושרית בתאים שאינם טרנסגניים באמצעות מולקולות קטנות, hPSCs טרנסגניים מתמיינים על ידי הוספת אנטיביוטיקה המשרה את המקדם עבור גורם שעתוק ספציפי התמיינות עצבית.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים לתאי אב עצביים

כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים הבדילו כי מחויב כלפי האנדודרם הסופי לשיפור יישומים במורד בידול נוסף.

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

מטרת מאמר זה היא לספק גישה סטנדרטית כדי לגרום בידול אב האדם בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים. הפיתוח של הליך זה עם ניסוחים מדיה מוכנים לשימוש מציעים למשתמש מערכת facile כדי ליצור תאי כבד אנושיים למחקר ותרגום ביו-רפואי.

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

למד פרוטוקול בידול ארבע שלבים ליצירת תאי אב לבלב מבטאי NKX6.1 מתאי גזע עובריים אנושיים pluripotent. שיטה זו מספקת מודל לחקר התפתחות הלבלב וטיפול בסוכרת.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1

גלה סרטונים נוספים