תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשיג תרחיפים של תאים בודדים מאבי העורקים, הכליות ובלוטות הלימפה של העכברים כדי לכמת ולאפיין תאי חיסון במודל של יתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות לב וכלי דם, כגון אילו שתי תת-קבוצות לימפוציטים מקדמות התפתחות יתר לחץ דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי וכימות של תת-קבוצות של תאים חיסוניים באיברים מוצקים ברמת התא הבודד.

לפני תחילת ההליך, יש לחטא את חזה העכבר עם 70% אתנול. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לפתוח בזהירות את העור ואת דופן החזה כדי לחשוף את הלב. כדי לחלחל את כלי הדם, בצע חתך קטן בפרוזדור הימני והזריק בהתמדה לפחות 10 מיליליטר PBS קר בקצב של כמיליליטר לשנייה לקודקוד החדר השמאלי.

כאשר כל האיברים הלבינו, השתמש במלקחיים מנותחים עדינים כדי להסיר את בלוטות הלימפה המנקזות את אבי העורקים הבטני, תוך הקפדה לא לקרוע את הכמוסות. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר את שתי הכליות במספריים עדינים. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקלים עדינים כדי לנתח את כל אבי העורקים החזי והבטני החל מהלב וכלה בהתפצלות הכסלית, תוך הקפדה לשמור על השומן הספרי-וסקולרי שמסביב מחובר לאבי העורקים.

לאחר מכן, העבירו את הכליות לצינור דיסוציאציה המכיל 10 מיליליטר של תמיסת עיכול כליות והשתמשו בדיסוציאטור חצי אוטומטי כדי לפרק מכנית את רקמת הכליה בהתאם להוראות היצרן. בתום הדיסוציאציה, דגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס בסיבוב מתמשך. לאחר 20 דקות, הפסק מיד את העיכול האנזימטי עם מדיום RPMI 1640 קר בתוספת 5% FBS וסנן את תמיסת הרקמות המתקבלת דרך מסננת של 40 מיקרון לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

השתמש בבוכנה ממזרק של מיליליטר כדי להפריד את הרקמה שנותרה. ואז גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות של 36% והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

שכבו בעדינות שלושה מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות של 72% מתחת לתאים, הקפידו לא להפריע לשכבות, והפרידו את התאים באמצעות צנטריפוגה. תאי החיסון ימוקמו בממשק. הסר את השכבה הצהבהבה העליונה המכילה פסולת סלולרית ואז העלה את הנפח ל -15 מיליליטר באמצעות PBS קר.

לנער היטב כדי לפרק את השיפוע ואז לשטוף את התאים בצנטריפוגה. כדי לבודד את תאי החיסון של אבי העורקים, העבירו את אבי העורקים לצינור של שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת עיכול אבי העורקים שהוכנה על קרח והשתמשו במספריים עדינים כדי לטחון את כל אבי העורקים לחתיכות דקות. לאחר מכן דגרו את השברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות של סיבוב רציף.

בתום העיכול, הוסיפו RPMI קר בתוספת 5% FBS בנפח פי חמישה מתמיסת העיכול וסננו את תמיסת הרקמות המתקבלת דרך מסננת של 40 מיקרון. לאחר מכן אסוף את המתלה החד-תאי על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-RPMI טרי עם FBS. כדי ליצור תרחיף של תא בודד מבלוטות הלימפה המנקזות את אבי העורקים, העבירו את בלוטות הלימפה למסננת של 40 מיקרון בצלחת תרבית רקמה בגודל 60 על 15 מילימטר והשתמשו בבוכנה מזרק של מיליליטר כדי לפרק את הרקמה.

לאחר מכן שטפו את המסננת בשני מיליליטר RPMI בתוספת FBS והעבירו את התאים המשוחררים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כדי לעורר את התאים, התאם תחילה כל תרחיף תאים לריכוז אחד כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של קוקטייל הפעלת התאים לכל קבוצת תאים עבור כל מיליליטר אחד של מדיום.

לאחר מכן, העבירו אחת עד פעמיים 10 לתאי אבי העורקים או הכליה השישי לכל באר לצלחת של 12 בארות ואחת עד פעמיים 10 לתאי בלוטות הלימפה השישית לכל באר לצלחת של 24 בארות. מניחים את הצלחות בחממת פחמן דו חמצני לח של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן העבירו את התאים לצינורות ה-FACS המתאימים מפוליסטירן וגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה.

לאחר שטיפת התאים פעמיים עם מאגר FACS טרי באותם תנאי צנטריפוגה, חסום וקשירת משטח לא ספציפית עם בלוק FC ושטוף את התאים ב-PBS. השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של PBS טרי וצבעו את התאים במיקרוליטר אחד של כתם כדאיות תגובתי של אמין למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור. בתום הדגירה, שטפו את התאים פעמיים נוספות במיליליטר אחד עד שניים של מאגר FACS והשעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המתאים על פני התא.

לאחר 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ומוגנים מפני אור, יש לשטוף את התאים פעמיים נוספות בשני מיליליטר של חוצץ FACS טרי, ולתקן ולחלחל את התאים עם ערכת קיבוע וחדירה לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, סמן את התאים עם קוקטייל הנוגדנים התוך-תאי המעניין ושטוף שוב את התאים במאגר FACS. לניתוח זרימה ציטומטרי של ייצור הציטוקינים התוך-תאיים המגורה, הפעל תחילה את צינורות הבקרה הלא מוכתמים והצבועים הבודדים כדי להתאים לחפיפה הספקטרלית, ואחריהם בקרות הקרינה מינוס אחד עבור כל פלואורופור בפאנל.

לאחר שנקבעו הפרמטרים הבסיסיים של ניתוח הקרינה, השתמש בתרשים אזור פיזור קדימה לצד זה כדי להגדיר את השער העיקרי לזיהוי אוכלוסיית הלויקוציטים, ואחריו שער כדי לא לכלול את התאים המתים בהתאם לחוסר ביטוי כדאיות שלהם. שרטט את אזור הפיזור קדימה כנגד גובה הפיזור קדימה והשער כדי לא לכלול את הכפילים. לאחר מכן ניתן לזהות את הלויקוציטים על ידי ביטוי CD45 שלהם.

כדי לקבוע את נוכחותם של תאי T המייצרים IL-17A או IL-17F עם הכליה או אבי העורקים של העכבר, ניתן להכין תרחיפים של תא בודד כפי שהודגם זה עתה לניתוח בקרה פלואורסצנטי מינוס אחד של כל ציטוקין. כצפוי, מעט מאוד תאים חיוביים ל-IL-17A או IL-17F בבקרות הקרינה מינוס אחד, מה שמאפשר הבחנה מדויקת של אותות חיוביים לעומת שליליים כדי להתאים כראוי את השערים לזיהוי תאים חיוביים IL-17A או IL-17F בדגימות הניסוי. צביעה תוך-תאית מייצגת של תאי T שבודדו מהכליה ומאבי העורקים של עכברים מסוג בר שהוחדרו לרכב או אנגיוטנסין II חושפת נוכחות של תת-קבוצה של תאי T המבטאים IL-17A או IL-17F בשתי הרקמות.

יתר על כן, הצביעה התוך-תאית של תאי T מבלוטות הלימפה המנקזות את אבי העורקים מדגימה שתאי T חיוביים ל-CD8 מבטאים אינטרפרון גמא ו-T-bet לאחר גירוי אנגיוטנסין II. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד תשע שעות בהתאם למספר הרקמות המעובדות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד במהירות וביעילות כדי למזער את מוות התאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תרחיף חד-תאי מהכליות, אבי העורקים ובלוטות הלימפה של העכבר, ולאפיין ולכמת תת-קבוצות של תאים חיסוניים מאיברים אלה. טכניקה זו מאפשרת לפיזיולוגיה של הלב וכלי הדם והכליות לחקור את השינויים באוכלוסיות תאי החיסון שעשויים לתרום ליתר לחץ דם ולמחלות פרו-דלקתיות אחרות.