הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

פרוטוקול זה מדגים כיצד להקים את פלטפורמת iCRISPR לעריכת גנום מהירה ב-hPSCs, וכיצד לשלב קווים ערוכים בגנום עם התמיינות לבלב מכוונת hPSC כדי לחקור התפתחות ומחלות לבלב אנושיות. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הלבלב האנושי, כגון בקרה גנטית על התפתחות לבלב תקינה, והבסיס המולקולרי של סוכרת. היתרון העיקרי של השיטות האלה הוא שהן מאפשרות לנו לשנות ביעילות גנים מעניינים ב-hPSCs ולהשתמש בקווי התאים המותאמים האלה למחקרים על התפתחות הלבלב האנושי ומחלות במבחנה.

תרבית hPSCs בתנאים מוגדרים כימית וללא הזנה על כלים אנושיים קטומים מצופים ויטרונקטין יום לפני האלקטרופורציה, הוסף 10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים במהלך החלפת המדיה. ביום האלקטרופורציה, הכינו מראש מנות מצופות ויטרונקטין בגודל 10 סנטימטרים.

לאחר מכן הסר את מדיום התרבות מהתאים, שטוף פעם אחת עם PBS ללא סידן ומגנזיום, ולאחר מכן טפל בתאים עם מגיב דיסוציאציה 1X בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשלוש דקות. לאחר מכן, שאפו את מגיב הדיסוציאציה לפני שהתאים התנתקו והוסיפו 10.5 מיליליטר של מדיום שלם. השתמש בפיפטינג עדין ליצירת תרחיף חד-תאי לפני העברתו לצינורות צנטריפוגה.

בצע ספירת תאים על 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן גלולה את ה-hPSCs ב-200 פעמים G למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים ב-PBS קר ב-12.5 כפול 10 עד התאים השישיים למיליליטר, והעבירו לנפחים של 800 מיקרוליטר.

הוסף את הפלסמידים לכל מתלה hPSC בנפח 800 מיקרוליטר וערבב היטב. מעבירים את התערובת לקוביית אלקטרופורציה של 0.4 ס"מ, ושומרים על קרח כחמש דקות. אלקטרופורציה של התאים באמצעות מערכת אלקטרופורציה ב-250 וולט ו-500 מיקרו-פאראד.

זה קריטי להשתמש ב-hPSCs בריאים ומתרבים לעריכת גנום. לאחר אלקטרופורציה, העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מדיום שלם ומחומם מראש, ולאחר מכן גלולה את התאים. השעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום שלם עם מעכב ROCK מיקרו-מולרי 10, וצלחת אחת כפול 10 לשישית, 2.5 כפול 10 לשישית וחמש פעמים 10 לתאים השישיים מכל אלקטרופורציה על כלים מצופים ויטרונקטין, כך שלפחות באחת מהצלחות יהיו מספיק מושבות של תא בודד לקטיף.

תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס. ביום השני, התחל בבחירת ניאומיצין על ידי הוספת מדיום המכיל 500 מיקרוגרם למיליליטר G418 סולפט. ביום השישי, התחל את בחירת הפורומיצין על ידי הוספת מדיום המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר פורומיצין דיהידרוכלוריד.

בימים 10 עד 12, מושבות התאים הבודדים של hPSC יגיעו לקוטר של מילימטר עד שני מילימטרים. בשלב זה, בחר 12 עד 24 מושבות תחת מיקרוסקופ סטריאו. לפרק מכנית את מושבות ה-hPSC לחתיכות קטנות באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, ולהעביר את התאים ישירות לצלחות מצופות ויטרונקטין בעלות 24 בארות.

24 שעות לפני הנחיית טרנספקציה של RNA, טפל ב-iCas9 hPSCs בשני מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין. ביום הטרנספקציה, הכינו צלחות מצופות ויטרונקטין בעלות 24 בארות והפרידו את תאי ה-iCas9 לתאים בודדים באמצעות מגיב דיסוציאציה 1X כמו קודם. לאחר מכן, גלולה את התאים ב-200 פעמים G למשך חמש דקות והשעו מחדש את התאים ב-0.5 כפול 10 עד התאים השישיים למיליליטר בתווך שלם בתוספת שני מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין ו-10 מעכב ROCK מיקרו-מולרי.

צלחת 500 מיקרוליטר מהתאים התלויים לבארות בודדות של צלחת 24 הבארות. עבור כל RNA מדריך, הכינו את תערובות הטרנספקציה הבאות. מערבבים A, 50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בתוספת מיקרוליטר אחד של RNA מנחה.

מערבבים B, 50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בתוספת שלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה. מערבבים תערובת A ו-B ליצירת תערובת של 100 מיקרוליטר ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 50 מיקרוליטר מהתערובת לתאים בבארות הכפולות של צלחת 24 הבארות ומערבבים היטב.

לאחר ארבעה ימים, יש לחלץ DNA גנומי, PCR להגביר את אזורי היעד המאגפים את רצפי המטרה של ה-RNA המנחה, ולהעריך את יעילות העריכה באמצעות עיכול T7E1. התחל בהתמיינות של קווי hPSC כאשר התאים הגיעו למפגש של 80% יומיים לאחר הזריעה. הוסף מדיום בידול יום אפס ולאחר מכן שנה את המדיה מדי יום באמצעות הנוסחאות המוצגות כאן.

ביום 10, בדוק את סמני האב המאוחרים יותר של הלבלב, PDX1 ו-NKX6.1 על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית של תת-קבוצה של התאים. לאחר מכן המשך לתרבית ממשק אוויר-נוזל על ידי טיפול ראשון בתאי PP2 עם מעכב ROCK מיקרו-מולרי 10 למשך ארבע שעות. לאחר שחלף זמן הדגירה, נתק תאים כמו קודם.

צמצם את משך הטיפול במגיב דיסוציאציה כדי למקסם את הישרדות התאים לזריעה בשלב ממשק האוויר-נוזל של ההתמיינות. שאפו את מגיב הדיסוציאציה לפני שהתאים התנתקו. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום בו-לה לצלחת ופזרו את תאי ה-PP2 לתאים בודדים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה.

אוספים את ההשעיה החד-תאית. ספור את מספר התא וגלול את התאים. לאחר השעיית כדור התא במדיום התמיינות S5, אתר חמישה עד 10 מיקרוליטר תאים לכל נקודה במסנן הכנסת טרנסוול.

הוסף מדיום S5 לתחתית כל תוספת טרנסוול ודגר עם שינויים במדיה עד שניתן לזהות סמנים אנדוקריניים בלבלב על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית. איור זה מראה הצטרפות קצה לא הומולוגית בתיווך iCRISPR ב-hPSCs. נוקאאוט גנים יעיל ביותר, מכיוון שלא מעורב תהליך בחירה, וניתן להשיג בקלות מוטציות דו-אלליות של 20% עד 50%.

לשינויים גנטיים יעילים ומדויקים, RNA מנחה מועבר יחד עם תורם DNA חד-גדילי הנושא את שינוי הרצף הספציפי, המוצג באדום. לעתים קרובות, כדי למנוע חיתוך מחדש באללים ששונו, מומלץ לכלול מוטציה שקטה ברצף ה-PAM, המוצגת כאן בירוק. עם מערכת זו, ניתן להשיג כ-10% מהשיבוטים הנושאים את שינוי הגנום הרצוי בתיווך תיקון מכוון הומולוגיה, ללא שינויים נוספים בשני האללים.

לאחר השליטה, לוקח פחות מחודשיים להקים קו iCas9 hPSC חדש. לאחר מכן, ניתן ליצור מגוון קווי מושבה מוטנטיים של hPSC תוך חודש עד חודשיים. לאחר יצירת קווים מוטנטיים גנטיים של hPSC, התמיינות הדרגתית במבחנה של קווי התאים המוטנטיים לתאים דמויי בטא בלבלב מאפשרת לנו לחקור את שלבי ההתפתחות הספציפיים המושפעים ממוטציות אלה, מה שיאפשר הבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה הבסיסיים.