במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic
16 במרץ 2017
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאים טרופובלסטיים אנושיים באמצעות מורפוגני עצם 4 ומעכבים של מסלולי האיתות הפעילים והצמתים כדי לחקור את האירועים המוקדמים של היווצרות ותפקוד השליה האנושית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר תפקודי תאים טרופובלסטיים וכיצד תאים אלה נוצרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לייצר תאים טרופובלסטיים בשפע למגוון רחב של יישומים כולל גנטיקה ולאפשר בדיקות תפקוד תאים.
כדי להתחיל בניסוי, יש להפשיר כמות גדולה של מטריצה חוץ-תאית על קרח למשך שלוש עד ארבע שעות. באמצעות טיפים קרים כקרח, צינור חרוטי קר אחד של 50 מיליליטר והמדיום השווה השונה של Dulbecco, או מדיום DMEM F12, מעבירים שני מיליגרם של מטריצה חוץ-תאית ל-24 מיליליטר של DMEM F12 קר כקרח. העבירו מיד את הצינור החרוטי של 50 מיליליטר לקרח ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס.
לציפוי צלחות תרבית רקמות, הוסף מיליליטר אחד של מטריצה חוץ-תאית מדוללת לכל באר של צלחת בת שש בארות. סובבו את הצלחת לציפוי הבארות ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות. שאפו את המטריצה החוץ-תאית מהצלחת החדשה והוסיפו מדיום מותנה פיברובלסטים עובריים של עכבר או MEFCM המכיל bFGF.
השתמש בפיפטה כדי להעביר את המהדקים הסלולריים המגורדים מלוח ה- MEF ולהכניס אותם לצלחת המצופה מטריצה חוץ-תאית. ואז דגרו את הצלחת. מגרדים תאים מובחנים עם פיפטה פסטר לפני החלפת ה-MEFCM במדיום bFGF מדי יום באמצעות שני מיליליטר מדיום לבאר אחת.
כאשר מושבות נראות גדולות ובהירות תחת המיקרוסקופ, מעבר hESCs כל שישה עד שבעה ימים. כאשר התאים נטולי המזין מוכנים למעבר, הסר את המדיום ושטוף את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS באמצעות פיפטה. שאפו את ה- PBS והחליפו אותו ב -0.5 מיליגרם למיליליטר של דיספאז מחומם מראש עם פיפטה.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים עם PBS על ידי הוספת שני מיליליטר PBS לבאר ולשאוף את ה- PBS. הוסף מיליליטר אחד של CM לבאר וגרד ידנית את התאים לגושים קטנים בעזרת קצה פיפטה של חמישה מיליליטר.
לאחר מכן, צלחו את גושי התאים התלויים לצלחות חדשות מצופות מטריצה חוץ-תאיות. הכן את אמצעי ההתמיינות. השתמש ב-CM ללא bFGF והוסף מעכבים טריים לפני השימוש.
השתמש ב-hESCs ללא מזין הגדלים על צלחות מצופות מטריצה חוץ-תאית למעבר אחד שתורבת בתוך אינקובטור המוגדר ב-5% חמצן. לאחר המעבר הראשון על הלוחות המצופים מטריצה חוץ-תאית, הניחו לתאים להיצמד למשך 24 שעות. למחרת, התחל בידול על ידי הסרת ה-CM המכיל bFGF והחלפתו ב-CM המכיל BMP4/A/P עם שני מיליליטר לבאר בצלחת של שש בארות.
המשך בתרבית התאים באמצעות רמות חמצן של 4%. החלף את ה-CM המכיל BMP4/A/P כל יומיים על ידי שאיבת המדיום הישן והוספת מדיום חדש המכיל BMP4/A/P. אסוף תאים בנקודות הזמן הרצויות.
תרבית hESCs לשני מעברים על מטריצה חוץ-תאית לאחר העברתם מה-MEFs עם מדיום hESC המכיל bFGF. מפגש תאים גבוה חשוב, לכן פצלו את ה-hESCs אחד לאחד על צלחת חדשה שתבטיח לפחות 50% מפגש למחרת. דגרו את התאים למשך הלילה בחממה דלת חמצן.
למחרת, החלף את המדיום בשני מיליליטר לבאר של מדיום התמיינות. הנח את התאים באינקובטור דל חמצן למשך הלילה. לפני הטרנספיקציה, ג'לטין מצפים מנה ומוסיפים 0.1% ג'לטין למנה.
מערבבים את המנה לציפוי הצלחת, ואז משאירים את הצלחת בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות מסירים את הג'לטין. הבדיל בין התאים עד לנקודת הזמן הרצויה.
יום לפני הטרנספקציה, נסו את התאים באמצעות 0.05% טריפסין למשך חמש דקות. צלחת את התאים למפגש הרצוי על הצלחת המצופה ג'לטין. הוסף CM המכיל BMP4/A/P חסר bFGF ודגר את התרבית למשך הלילה.
למחרת, הוסף מדיום התמיינות טרי לתאים. Transfect siRNAs באמצעות מגיב טרנספקציה siRNA. עבור DNA פלזמה, השתמש במגיב ליפופקטמין מתאים.
עקוב אחר פרוטוקול המוצר כמתואר עבור כל מגיב טרנספקציה. העבירו את קומפלקסי הליפופקטמין של siRNA לכל באר או צלחת תאים וערבבו בעדינות. לאחר מכן תרבית את התאים למשך הלילה באינקובטור דל חמצן.
למחרת, החלף את המדיה באמצעי בידול חדשים. קצור את התאים בנקודות הזמן הרצויות כדי לבדוק את יעילות שיבוש הגנים באמצעות RT-PCR כמותי. לבסוף, כדי לקצור תאים, הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין לבאר ודגר על התאים.
הוסף חמישה מיליליטר של מדיום MEF לבאר כדי לנטרל את הטריפסין. סובב את התאים ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות והשתמש בכדור התא לבידוד RNA. באמצעות טכניקה זו נראים בבירור שינויים מורפולוגיים.
התאים ביום ההתמיינות הראשון גדולים יותר מהתאים מיום האפס. ככל שההתמיינות מתקדמת, התאים מתחלקים ומתרחבים ממרכז המושבה, וגדלים בכיוון החוצה. המושבות הבודדות מתמזגות יחד ביום ההתמיינות החמישי עם תאים הגדלים זה על גבי זה.
ניתוח QRT-PCR מגלה כי רמות הביטוי היחסיות של סמן C פלוריפוטנטי NANOG מופחתות ב-75% לאחר יום אחד של התמיינות כאשר תאים מתורבתים עם BMP4 ומופחתות ב-90% בנוכחות BMP4/A/P. ביום השני של ההתמיינות, רמות ה-NANOG נמוכות מאוד עבור תאים שגודלו ב-BMP4 בלבד או ב-BMP4/A/P בהשוואה לאלו במדיום hESC CM המכיל בטא FGF. טרנספקציות שבוצעו באמצעות פלסמיד GFP והוכנסו לתאים שטופלו ב-BMP4/A/P ביום ההתמיינות הראשון וביום השלישי השיגו יעילות טרנספקציה של 30 עד 50% ב-24 שעות לאחר הטרנספקציה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבדיל תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לתאים טרופובלסטיים במבחנה וכיצד להכניס מבני DNA למניפולציה של ביטוי גנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הגזרת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי טרופובלסט אנושיים באמצעות bone morphogenic protein 4 ומעכבים של נתיבי Activin/Nodal. שיטה זו מאפשרת ייצור יעיל של תאי טרופובלסט המתאימים ליישומים שונים, כולל מניפולציה גנטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של השיליה
רקע
- תאים טרופובלסטיים אנושיים ממלאים תפקיד מכריע בהיווצרות השילייה ובתפקודה.
- הבנתה של הבחנה של תאים טרופובלסטיים עשויה לספק תובנות לגבי התפתחות מוקדמת של בני אדם.
- שיטות נוכחיות ליצירת תאים אלו הן לרוב לא יעילות.
- פרוטוקול זה נועד לשפר את תנובת התאים הטרופובלסטיים למטרות מחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה להפקת תאים טרופובלסטיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים.
- סיוע בחקר התפקודים של תאים טרופובלסטיים.
- מתן אפשרות למניפולציה גנטית של תאים טרופובלסטיים עבור יישומים שונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הפשרת מטריצה חוץ-תאית על קרח.
- הכנת מצע DMEM F12 לתרבית תאים.
- שימוש בחלבון מורפוגני לעצם 4 ובמעכבי מסלול איתות.
- העברת תאים לתנאי תרבית המתאימים לדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי טרופובלסט.
- ייצור שופע של תאי טרופובלסט לשימוש ניסויי.
- פוטנציאל למניפולציה גנטית של התאים שנוצרו.
- תובנות לגבי האירועים המוקדמים של התפתחות השילייה האנושית.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה להפקת תאים טרופובלסטיים.
- גישה זו עשויה לקדם משמעותית את המחקר בביולוגיה של השילייה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בתאים אלו כדי לחקור תפקודים טרופובלסטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
פרוטוקול זה מאפשר יצירה בקנה מידה רחב של תאי טרופובלסט אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, ובכך הוא עוקף מגבלות אתיות של מחקר בעוברים ראשוניים. הוא מספק מערכת מתחדשת וניתנת למניפולציה גנטית לחקר התפתחות השילייה ותפקודה, ובכך תומך בתיקוף מטרות בטוקסיקולוגיה של הרבייה ובהפרעות של השלב המוקדם של ההיריון. השיטה מקלה על הפחתת סיכונים מכנית על ידי מתן אפשרות לביצוע מחקרי אובדן תפקוד (loss-of-function) והגברת תפקוד (gain-of-function) במודל של תאי אדם הרלוונטי למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקודי גנים ספציפיים לטרופובלסט באמצעות טרנספקציית siRNA וביטוי יתר מבוסס פלסמיד.
- ערך תפעולי: מייצר אוכלוסיות טרופובלסט שמימות והומוגניות המתאימות לסריקת פנוטיפ בעלת תוכן גבוה.
- ערך ניבוי: תומך בהערכת השפעות של תרכובות על התמיינות תאי שליה, היתוך והפרשת הורמונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: תאים מובחנים מביעים סממנים ספציפיים לשלב (למשל, CGB, HLA-G), המאפשרים קריאות כמותיות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מדרגיות: הפרוטוקול תומך בהרחבה לפורמטים של 6 בארות ופורמטים גדולים יותר עבור יישומים בעלי תפוקה בינונית עד גבוהה.
- שחזוריות: תנאי עיכוב מוגדרים של BMP4/A/P מניבים בידול טרופובלסט עקבי לאורך מעברים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אי-ספיקת שליה מוקדמת ומסלולים הקשורים לרעלת הריון באמצעות תפקוד לקוי של הטרופובלסט.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ביולוגיה של תאי גזע להערכה פרה-קלינית של טיפולים המכוונים לשליה.
- התאמה לסמנים ביולוגיים: הפרשת hCG ו-PLGF מאפשרת ניטור של הבשלת הטרופובלסט ומצבו התפקודי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
ממצב את ייצור הטרופובלסט ככלי גילוי בסיסי בין תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטיים לבין פריסת בדיקות פונקציונליות בתוכניות של רעילות רבייית ובריאות האם והעובר.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על פלישת טרופובלסט, סינציטיזציה ומנגנוני סבילות חיסונית.
- סריקה: מאפשר סריקת תרכובות למציאת מודולטורים של בידול טרופובלסט ורגישות לנשאי מחלות.
- אנליטיקה: מדדי QRT-PCR ויעילות טרנספקציה מספקים נקודות סיום כמותיות למעורבות מטרה ומודולציה של מסלולים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין בידול in vitro לתיקוף במודלים של שליה ex vivo ו-in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מקור טרופובלסט הניתן להרחבה ולאחסון לשימוש חוזר בפרויקטים ובהתוויות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של השילייה באמצעות הפרעה גנטית מבוקרת.
- ערך תפעולי: פרוטוקול דיפרנציאציה סטנדרטי מבטיח עקביות בין סדרות (lot-to-lot) על פני שורות תאים ומעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של סיכונים בשילייה בשלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכונים על בסיס פרופילי בטיחות של הטרופובלסט.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי גזע, דגירה בתנאי חמצן נמוך וטכניקות טרנספקציה.
- תלוי בציפוי של מטריצה חוץ-תאית, תוספת של BMP4/A/P ובתנאי תרביות היפוקסיים (4–5%).
- מחייב סטנדרטיזציה של ריאגנטים לטרנספקציה ותזמון מדויק להעברה עקבית של siRNA או פלסמידים.
- התאמה לקווי hPSC חלופיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של יעילות הדיפרנציאציה והבעת סממנים.
- מוגבל על ידי הטרוגניות של הטרופובלסט וסינציטיזציה ספונטנית לאורך תקופות תרביות ממושכות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Transitioning hESCs to Feeder-free Conditions
2:59
hESC Differentiation Using BMP4/A/P
4:02
Trophoblastic Cell Transfection Preparation
4:41
Transfection Using siRNAs
6:33
Results: Rapid Differentiation for Visualization and Analysis
7:51
Conclusion
