Name: ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: למדו את פרוטוקול Twin-spot MARCM לניתוח שושלת תא ברזולוציה גבוהה ולימודי תפקוד גן בנוירונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התפתחות נוירונים באמצעות סימון בשני צבעים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 104-2311-B-001-034) והמכון סלולארית וביולוגיה והאורגניזמית, Academia Sinica, טייוואן.

1. בניית tsMARCM המוכן זבובי שימוש החובה Transgenes 11, 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את הגרסה המקורית של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 11 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטיים רגילות זבוב, אשר תוארו בעבר, על ידי צבת transgenes המרובה באותו המניות לטוס 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באחד קו הורי, להרכיב את transgenes של FRT 40A, כטב&quot;מ- mCD8 :: GFP (הכתב הראשון, mCD8 :: GFP; ביטוי של transgene הוא תחת השליטה של אמרגן רצף הפעלה במעלה הזרם, אשר מייצרת עיתונאי קשור-קרום של העכבר מקבץ של חלבון בידול 8 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו כטב&quot;מ-rCD2RNAi (להלן מדכא כי מעכב התבטאות הכתב השני, את RNAi נגד ביטוי o אשכול עכברושf בידול 2, rcd2) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מקום רקמות ספציפיות הנהג -GAL4 על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של 40A FRT, כטב&quot;מ-rCD2 :: RFP (הכתב השני, rCD2 :: RFP; כתב הקרום קשור אחרים מורכבים של חלבון rCD2 התמזג עם חלבון פלואורסצנטי אדום), ו כטב&quot;מ-GFPRNAi (את מדכא זה מעכב את הביטוי של ה- GFP :: mCD8, את RNAi נגד הביטוי של ה- GFP) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מניחים-הלם חום (hs) -FLP או FLP specific--רקמה על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את הגרסה החדשה של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 14 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטי רגילות זבוב, אשר תוארו previously, על ידי הצבת transgenes מרובים באותו מניות לטוס 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באחד קו הורית, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב&quot;מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (א transgene בשילוב של mCD8 :: GFP ואת מדכא כי מעכב התבטאות rCD2 :: RFP) ביחד באותו זרוע 2 nd או 3 rd כרומוזום (זוגות מתאימים של transgenes של FRT ו כטב&quot;מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i מסומנים בטבלה 1). מניח נהג הרקמות הספציפי-GAL4 בכרומוזומים מלבד כרומוזום של אתר FRT הנבחר, אם אפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב&quot;מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi (את הגן המשולב אחרים של rCD2 :: RFP ואת המדכא כי מעכב התבטאות mCD8 :: GFP) באותה הזרוע של כרומוזום 2 nd או 3 rd (זוגות מתאימים של transgenes של FRT </em&gt; ו כטב&quot;מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi מסומנים בטבלה 1). מקום hs-FLP או רקמות ספציפיות-FLP על הכרומוזומים למעט כרומוזום של האתר FRT הנבחר, אם אפשר. </li></ol></li></ol> 2. הצלב tsMARCM מוכן מתקיף צור tsMARCM המשובטים בקרב צאצאיהם&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלב tsMARCM מוכן זבובים יחד (למשל, לשים 10-15 זבובים זכרים משלב 1.1.1 או 1.2.1 ו- 20-30 הנשי בתולה זבובים משלב 1.1.2 או 1.2.2 יחד) בבקבוקון מזון-fly עם טרי להדביק שמרים -made על הקיר של הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובי tsMARCM המוכנים חצו במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לשפר את הסיכוי של הזדווגות לפני איסוף ביצים מופרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות להעביר את הזבובים tsMARCM המוכנים חצו לתוך צלוחיות yeasted הטרי כדי למנוע צפיפות (להקיש את הזבובים או להשתמש פחמן דו חמצני כדי להרדים את הזבובים כדי להקל על ההעברה; לשמור על לא יותר מ 80-100 ביצים מופרות בתוך מזון לטוס 10 מיליליטר דרךl להימנע מדי הזחלים בקעו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות החיות tsMARCM (כלומר, ביצים מופרות; דוגמה של הגנוטיפ של חיות tsMARCM, כפי שמוצג באיור 3, הוא hs-FLP [22], w / w; כטב&quot;מ- mCD8 :: GFP, כטב&quot;מ-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / כטב&quot;מ-rCD2 :: RFP, כטב&quot;מ-GFPRNAi, 40A FRT; +; +) אשר נקבע ב הצלוחיות הועברו הסדרה של 25 מעלות צלזיוס עד שהם מפתחים לשלבים הרצויים (למשל, עובר, הזחלים, או גלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הבקבוקונים הועברו המכילים חיות tsMARCM באותו שלב התפתחותי כדי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10, 20, 30, 40, ו -50 דקות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי של הלם חום שגורם ביטוי של FLP על מנת ליצור את שיבוטים של עניין tsMARCM. דלג על שלב זה אם FLP רקמות specific- נמצא בשימוש בניסוי tsMARCM (hs-FLP היא מועדפת עבור שושלת עצבית מנתח; הסיבות להעדפה זו תוארו בעבר 15). הערה: חזור על שלב 2.5 באמצעות הזמן האופטימלי של הלם חום בניסויים tsMARCM בעתיד אם יותר שיבוטים tsMARCM עניין מבוקשים; בדרך כלל, ביטוי FLP יותר מושרה hs-FLP [22] לעומת hs-FLP [1] עם הזמן חום הלם אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות החיות tsMARCM-בהלם חום של 25 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחותי המתאים, ולאחר מכן המשך לשלב 3. </li></ol> 3. כן, כתם, מוח טס הר המכיל tsMARCM המשובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאכלים מלקחיים-הגנה. מערבבים חלק (30 גרם) וחלק ב &#39;(3 גרם) של ערכת אלסטומר סיליקון עם פחם פעיל (0.25 גרם). יוצקים את התערובת לתוך מנות המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זחל, גלמים או מוחות בוגרים מתוך חי tsMARCM המלוחים פוספט שנאגר 1x (PBS) באמצעות מלקחיים על צלחת מלקחיים-הגנה מוצגת באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הערה: פרוטוקול לנתיחת מוח לטוס כבר יורדתribed בעבר 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית עם PBS 1x המכיל פורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לעבד את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית זה לשארית המדרגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT (PBS 1x המכיל 1% Triton X-100) ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד PBT 1% (לשטוף: להסיר PBT ולהוסיף PBT חדשים במהירות; לשטוף: להסיר PBT, להוסיף חדשים PBT, דגירת מוח הזבוב בתוך PBT החדש באמצעות שייקר מסלולית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים ראשוניים הוא עכברוש נוגדן אנטי CD8 (1: 100), נוגדן אנטי DsRed ארנב (1: 800), ועכבר אנטי Bruchpilot (BRP) נוגדנים (1:50) ב 1% PBT המכיל 5% נסיוב עז נורמלי (NGS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. </li><li&gt; דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים משני לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים משני הוא נוגדן IgG אנטי עכברוש עיזים מצומדות עם צבע ירוק ניאון (1: 800), נוגדן IgG נגד ארנב עז מצומדות עם צבע צהוב-ניאון (1: 800), ו עז נגד העכבר נוגדן IgG מצומדות עם צבע מרחיקות אדום-ניאון (1: 800) ב PBT 1% המכיל 5% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. הר אותם בשקופית מיקרו עם מגיב אנטי מרווה. שים כוס כיסוי מיקרו בשקופית מיקרו לכסות ולהגן על המוח זבוב. חותם את הקצוות של השקופית זכוכית מיקרו כיסוי מיקרו באמצעות לק ברור. אחסן רכוב אלה וחתומים לטוס דגימות מוח על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. קחו, תהליך, ולנתח תמונות פלורסנט משובטים tsMARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות הניאון של fr שיבוטים tsMARCMאום הדגימות שנוצרו בשלב 3.8 באמצעות מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות הפרויקט של תמונות ניאון confocal tsMARCM לתוך דו מימדי, שטוח התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מסופק עם מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה (ראה איור 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, ו 3Q - 3T לדוגמאות של בברוטליות תמונות ניאון confocal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הסלולרי של הצדדים רב תאיים-NB של שיבוטים tsMARCM באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (למשל, הפונקציה &quot;מונה תא&quot; ב ImageJ 17; ראה 3E איור, 3J, 3O, ו 3T לדוגמאות של התא גופות נוירונים). </li></ol>

<ol><li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li>
<li>Goodman, C. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodman%2C+CS+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li>
<li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li>
<li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).</li>
<li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li>
<li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול צעדים 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, ו -3.2 הם קריטיים להשגת תוצאות tsMARCM טובות. רקמות ספציפיות נהגי -GAL4 כי אינו מבטא GAL4 ב אבות עצביים הם העדיפו צעדים 1.1.1 1.2.1. הימנע צפיפות גדולה החיות גדלו צלוחיות-אוכל לטוס בשלב 2.3. מכיוון חביון האינדוקציה, את רמת הביטוי של FLP אפון-הלם חום, ובפעם המפריד הממוצעת של אבות עצביים (כלומר, NBS ו GMCs) אינם ידועים, עדיף לגוון את הזמן החו...

המוח, מורכב ממספר עצום וסוגים מגוונים של נוירונים, מעניק חיות עם היכולת לתפוש, תהליך, ולהגיב לאתגרים מהעולם החיצוני. נוירונים של המוח המרכזי תסיסנית המבוגר נגזרים ממספר מצומצם של תאי גזע עצביים, neuroblasts שנקרא (NBS), במהלך התפתחות 1, 2. רוב NBS המשתתפים neurogenesis המוח תסיסנית עוברים חלוקה סימטרית לייצר NBS עצמית חידוש תאים אמא גנגליון (GMCs), ואת GMCs ואז לעבור לעוד סיבוב של חלוקת לייצר שני לתאי הבת כי להתמיין נוירונים 3 (איור 1 א ). בגלל המורכבות של מורפולוגיה עצבית ואת האתגרים הקשורים בזיהוי נוירונים ספציפיים, טכנולוגית תיוג פסיפס חיובית, ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM), הומצא כדי לאפשר visualizatיון של נוירון בודד או קבוצה קטנה של נוירונים מתוך אוכלוסיית נוירונים שמסביב, ללא תווית 4. MARCM מנצל את flippase (FLP) / היעד הכרה FLP (FRT) מערכת לתווך רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא המפריד מבשר נושאת אלל הטרוזיגוטיים של גן מדכא, שביטויים בדרך כלל מעכב את הביטוי של הגן הכתב 4. לאחר חלוקת mitotic, הכרומוזומים רקומביננטי מופרדים לתאים התאום, כך תא אחד מכיל אללים הומוזיגוטים של הגן מדכא והתא השני אין גן-the מדכא ביטוי של הכתב בתא כי (וצאצאיו) הוא כבר לא חסם 4. שלושה דפוסי המשובטים נמצאים בדרך כלל ניסוי MARCM כאשר FLP מושרה stochastically ב- NBS או GMCs: תא בודד ושני תאים-GMC שיבוטים, המתארים מורפולוגיה העצבית ב resolutio תא בודדn, ומשכפל רב התאי-NB, המגלה דפוסי מורפולוגיים כולו של נוירונים נגזרו NB משותף (איור 1 ב). טכניקת MARCM הוחלה נרחבת במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית, לרבות זיהוי סוג עצבי לשחזור רשתות חיווט-רחב מוח, שושלת עצבית ניתוחית לחשוף את ההיסטוריה ההתפתחותית של נוירונים, אפיון פנוטיפי של פונקציות גן מעורבות מפרט גורל תא, ומורפוגנזה עצבית והבחנה לומדת 5, 6, 7, 8, 9, 10. בגלל MARCM הקונבנציונלי רק תוויות אחד משני התאים הבת (שושלות) לאחר אירוע רקומבינציה mitotic המושרה, מידע שימושי פוטנציאלי מהצד המסומן הולך לאיבוד. מגבלה זו מונעת את היישום של M הבסיסימערכת ARCM כדי ברזולוציה גבוהה מנתח של שושלות עצביות רבות לעבור גורלות תא קצב מהיר או דיוק מנתח של פונקציות גן בנוירונים זהה של בעלי חיים שונים 11, 12. Twin-spot MARCM (tsMARCM) הנו מערכת מתקדמת המאפשרים תוויות נוירונים נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים, אשר מאפשרת שחזור של מידע שימושי משני צידי תאי התאומים, ובכך להתגבר על המגבלה של מערכת MARCM המקורית 11 ( איור 2 א - 2C). במערכת tsMARCM, שתי התערבות RNA (RNAi) מבוססת מדכאי ממוקמים ב-אתרי טרנס של כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא מבשר, והביטוי של מדכאים אלה באופן עצמאי לעכב את הביטוי של העיתונאים שלהם (איור 2 ב). בעקבות רקומבינציה mitotic באתר ספציפי בתיווכם של מערכת FLP / FRT, את two מדכאים מבוססים RNAi להיות הפרדה לתאים התאום להתיר את הביטוי של עיתונאים נפרדים (איור 2 ב). שני דפוסים משובטים, תא בודד הקשורים שיבוטי תא בודד ושני תאים-GMC הקשורים שיבוטים רבים תאי-NB, נתפסים בדרך כלל בניסוי tsMARCM (איור 2 ג). מידע נגזר צד אחד של תאי התאומים יכול להיות מנוצל כהפניה עבור הצד השני, מה שמאפשר שושלת עצבית ברזולוציה גבוהה מנתח, כגון לידת היכרויות הנוירונים שכותרתו, פנוטיפי מנתח של נוירונים זהים בחיות שונות לחקירה המדויקת של תפקוד גן עצבי 11, 12. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול המתאר כיצד לערוך ניסוי tsMARCM, אשר ניתן להשתמש בהם על ידי מעבדות אחרות כדי להרחיב את לימודיהם של ההתפתחות העצבית (כמו גם התפתחות של רקמות אחרות, אם זה אפשרי) תסיסנית.

<table><tbody><tr><td>פחמן דו חמצני (CO2)</td><td>ספק מקומי</td><td>n.a.Anesthetize</td> <td>זבובי הרדמה</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>ספק מקומי</td><td>n.a.מיון</td><td>, הצלבה והעברה של זבובי</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (או ספקים אחרים)</td><td>PBS001</td><td>ניתוח, שטיפה, שטיפה וחיסון מוחות זבובים</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252549</td><td>תיקון מוחות זבוב</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>לשטוף, לשטוף ולחסום מוחות זבובים</td></tr> עז <tr><td>רגילה</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>סרום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עכברוש נגד עכבר CD8 נוגדן</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד DsRed</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>עכבר נוגדן נגד BRP</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>nc82</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד חולדות עיזים מצומד עם Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב עיזים מצומד עם Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>מוחות זבוב חיסון עיזים</td></tr><tr><td>נגד עכבר נוגדן IgG מצומד עם Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>מוחות זבוב אימונוסטיין</td></tr><tr><td>SlowFade מגיב זהב אנטי-דהייה</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S36936</td><td>הר מוחות זבובים והגן על כיבוי הקרינה&nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 דיכאון זכוכית</td><td>ספוט צלחת קורנינג</td><td>7220-85</td><td>ניתוח, שטיפה, שטיפה ואימונוסטייל מוח זבוב</td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td> World <td>Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>הכינו צלחות סילגארד שחורות להגנה על מלקחיים במהלך דיסקציה מוחית</td></tr><tr><td>פחם פעיל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>242276-250 גרם</td><td>הכינו כלי סילגארד שחורים</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td> מדע <td>משובח כלים</td><td>11252-30</td><td>לנתח ולהרכיב מוחות זבוב</td></tr><tr><td>מיקרו שקופיות</td><td>קורנינג</td><td>2948-75x25</td><td>הר מוחות זבוב</td></tr> מיקרו <tr><td>כיסוי זכוכית מס' 1.5</td><td>VWR בינלאומי</td><td>48366-205</td><td>הר מוחות זבוב</td></tr><tr><td>לק</td><td>ספק מקומי</td><td>לא זמין</td><td>חותם זכוכית כיסוי מיקרו על מיקרו שקופיות</td></tr><tr><td>אינקובטור&nbsp;</td>תרבות <td>Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>עפה ב-25 מעלות; C</td></tr> <tr><td>(או ספקים אחרים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אמבט מים</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>לגרום להלם חום בזבובים ב-37 מעלות; C</td></tr> <tr><td>(או ספקים אחרים)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>שטיפה ואימונוסטיין מוחות זבובים</td></tr> <tr><td>(או ספקים אחרים)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>מיון, הצלבה והעברה של זבובים; לנתח, לשטוף, לשטוף וליצור מוחות זבובים חיסונים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss (או ספקים אחרים)</td><td>LSM 700 (או דגמים אחרים)</td><td>תמונהMARCM משכפלים</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה 1 (למשל , דפדפן תמונה Zeiss LSM)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>לא זמין</td><td>ערימות פרויקט של תוכנות עיבוד תמונה של תמונות קונפוקליות</td></tr><tr><td>2 (למשל , ImageJ)&nbsp;</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>ספירת מספר תאים של שיבוטי tsMARCM</td></tr></tbody></table>

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות twin-spot marcm

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

M osaic nalysis עם arker ג r epressible ell מ (MARCM) היא מערכת תיוג פסיפס חיובית כי כבר מיושמת באופן נרחב במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית לתאר מורפולוגיות מסובכות כדי לתפעל את הפונקציה של גנים תת קבוצות של נוירונים בתוך אחר לא מסומן ו שאנן אורגניזמים. פסיפסים גנטיים שנוצרו במערכת MARCM באים לידי ביטוי בתיווכם רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים ההומולוגיים בתוך חלוקת תאים מבשרים לייצור הן (שיבוטי MARCM) מסומן לתאים בת לא מסומנים במהלך מיטוזה. הארכת תוקפה של שיטת MARCM, MARCM תאום המקום שנקרא (tsMARCM), תוויות הן של תאי התאום נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים. טכניקה זו פותחה כדי לאפשר שהליפה של מידע שימושי משני-השושלות החמות. על ידי מקיף וניתוח זוגות שונים של שיבוטי tsMARCM, מערכת tsMARCM מתירה mappin שושלת עצבית ברזולוציה גבוההז כדי לחשוף את הלידה-הסדר המדויק של נוירונים שכותרתו מופק ובתאים משותפים. כמו כן, מערכת tsMARCM גם מרחיבה מחקרים לתפקד גנים על ידי מתיר הניתוח פנוטיפי של נוירונים זהים של בעלי חיים שונים. כאן אנו מתארים כיצד ליישם את מערכת tsMARCM כדי להקל על מחקרים של ההתפתחות העצבית תסיסנית.

מערכת tsMARCM נעשה שימוש כדי להקל על שושלת עצבית מנתח ומחקרי תפקוד הגן באמצעות אחזור מידע חשוב על נוירונים נגזרו NBS המשותף. המערכת נעשתה שימוש כדי לזהות את רוב (אם לא כל) סוגי נוירונים, לקבוע את המספר הסלולרי של כל סוג עצבי, ותוודא הלידה מהסדר של נוירונים אלה 11, 12, 18 (ראה פרטים בפרק הדיון לקבלת פרטים אודות שימוש tsMARCM כדי לנהל שושלת ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

המטרה הכללית של פרוטוקול twin-spot MARCM זה היא לבצע ניתוחי שושלת תאים ברזולוציה גבוהה ומחקרי תפקוד גנים משופרים. מאחר שרקמת המוח מורכבת ממספר עצום של נוירונים מגוונים, קשה ללמוד את המנגנון העומד בבסיס האופן שבו נוירונים מתחברים יחדיו במהלך ההתפתחות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא סימון נוירונים שנגזרו מאבות-תאים נוירונליים משותפים בשני צבעים נפרדים.אשר מאפשרים לשחזר את המידע על מועד הלידתו של כל נוירון. לפיכך, טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית. את הפרוצדורה תדגים היום Pei-Chi Chung.טכנאי מהמעבדה של פרופסור Yu. התחילו בשילוב של זכרים ונקבות מוכנים ל-twin-spot MARCM בתוך מבחנה מזון לזבובים עם שמרים טריים במבחנה. שמרו את הזבובים המצולבים המוכנים ל-twin-spot MARCM בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך יומיים כדי להגביר את הסיכוי לזיווג לפני איסוף הביצים המופרות.כדי למנוע צפיפות יתר בעת בקיעת הזחלים, העבירו את הזבובים המוכנים להצלבת twin-spot MARCM למבחנות עם שמרים טריים. גידלו את צאצאי ה-twin-spot MARCM עד שיגיעו לשלב הפיתוח הרצוי. בשלב זה, הזבובים בשלב הזחל יעברו הלם חום כדי להשרות ביטוי של flippase.העבירו את מבחנות הזבובים למקבץ מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10, 20, 30, 40 ו-50 דקות, כדי לקבוע את הלם החום האופטימלי עבור ביטוי של flippase. זאת כדי ליצור את שיבוטי ה-twin-spot MARCM הרצויים. תזמון הלם החום קובע את שלב דור הפינוי (clearing generation), בעוד שמשך הלם החום מגדיר כמה פינויים ייווצרו.יש לגדל את בעלי החיים מסוג twin-spot MARCM שעברו הלם חום בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. לאחר מכן, יש להמשיך לצביעה ולהרכבה. יש להוסיף PBS לכלי ההגנה של הפינצטות.לאחר מכן, העבירו את בעלי החיים מסוג twin-spot MARCM לצלוחיות. בעודכם מביטים דרך מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את המוחות מבעלי החיים מסוג twin-spot MARCM. ראשית, הסירו את הראש מגוף הזבב.לאחר מכן, הסירו בעדינות את הקוטיקולה מבלי לפגוע במוח. לאחר מכן, הסירו בזהירות את הקנהות, הנראות כסיבים בצבע לבן. העבירו את המוחות ללוחית זכוכית (spot plate) המכילה 4% formaldehyde ו-PBS.וקבעו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. התחילו את הליך הצביעה על ידי שטיפת מוחות הזבובים שלוש פעמים ב-1% PBT. ולאחר מכן שטפו ב-1% PBT שלוש פעמים.עם ניעור למשך 30 דקות בכל פעם. הדגרו את מוחות הזבובים עם תערובת של נוגדנים ראשוניים למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס או למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את מוחות הזבובים שלוש פעמים כל אחת עם 1%PBT, עם ניעור כפי שבוצע קודם לכן.לאחר מכן, דגרו את מוחות הזבובים עם תערובת של נוגדנים שניים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C. לאחר שטיפה של המוחות כפי שנעשה קודם לכן, קבעו את המוחות על סלייד מיקרוסקופי באמצעות סוכן נוגד-דהייה (anti-quenching). לסיום, הניחו זכוכית כיסוי כדי לכסות ולהגן על מוחות הזבובים.אטמו את השוליים של כיסוי הזכוכית המיקרוסקופי והשקופית המיקרוסקופית באמצעות לק שקוף. לבסוף, צלמו תמונות פלואורסצנטיות של שיבוטי twin-spot MARCM מהדגימות באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית נבחרת. איור זה מציג תוצאות משיבט twin-spot MARCM, נוירוני השהיה של olfactory projection מסוג VL2p antero dorsal שנגזרו על ידי השראה של flippase.כדי לתווך רקומבינציה מי dividing ב-adPN neuroblast בשלב העוברי. דיאגרמה זו מראה את תבנית הנוירוגנזה. בתמונה זו של המוח במיקרוסקופ קונפוקלי, ה-VL2p adPNs מופיעים בירוק והם מקושרים ל-multicellular neuroblast adPNs במגנטה.תמונה זו מציגה את התאים בקרן הצדית (lateral horn). כאן ניתן לראות את המורפולוגיה העצבית של האונה האנטנלית (antennal lobe). תמונה זו מציגה את הנתונים עבור DL1 adPNs.כפי שניתן לראות כאן, ה-DL1 adPNs מופיעים בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות מאשר ה-VL2p adPNs. השראה של twin-spot MARCM clones של DC3 adPNs מדגימה כי סוג נוירונלי זה מופיע בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות. תמונה זו מראה כי אירוע twin-spot MARCM מתרחש בנוירון GAL4 שלילי בתוך שורת ה-adPN.לאחר השליטה בטכניקה זו, היא תוכל לסייע לחוקרים לנתח שושלות עצביות ולספק סממנים שונים להבחנה בין נוירונים לבין שיבוטי נוירובלסטים. יתרה מכך, שיטת twin-spot MARCM יכולה להפיק שיבוטי מוטנטים הומוזיגוטים כדי לחקור מנגנונים מולקולריים ברקע גנטי הטרוזיגוטי.

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

גלקסי והדוד צמחו ככלים פופולריים המאפשרים לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטיקה לנתח ולפרש נתוני RNA-seq. אנו מתארים פרוטוקול לחוקרי אלגנס לבצע ניסויים-Seq RNA, גישה ולעבד את הנתונים באמצעות גלקסי ולקבל מידע ביולוגי משמעותי מרשימות הגן באמצעות DAVID.

Transcriptomic ניתוח<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA רצף נתונים באמצעות Suite טוקסידו על פרויקט גלקסי

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

פרוטוקול לבצע מעקב שושלת היוחסין ניתוח גנטי פונקציונלי של גנים המועמדים ברמת תא בודד באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM) מוצג. ניתוח שבטים MADM מספק מסגרת כמותית כדי למדוד את ההתנהגות ההתרבות, הפלט הסלולר, ואת הקשר השושלת של ושלתי בודדים ותאי הבת שלהם.

איתור השושלת וניתוח שבטים בפיתוח קליפת המוח באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM)

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

CUT&amp;RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&amp;RUN של תא יחיד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

ניתוח מדויק של נתוני מיקרוסקופיה רב-ממדיים דורש זרימות עבודה מורכבות. מאמר זה מדגים כיצד להשתמש בתוכנה Cell-ACDC. הוא ממנף מודלים חדישים מונעי בינה מלאכותית לפילוח, מעקב, ניתוח אילן יוחסין של תאים וכימות של נתוני מיקרוסקופיה. באופן מכריע, הוא משלים את המודלים הללו עם מסגרת חדשנית לתיקון אוטומטי למחצה של תפוקת הדגמים.

ניתוח נתוני מיקרוסקופיה רב-ממדית באמצעות Cell-ACDC

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למדו את פרוטוקול Twin-spot MARCM לניתוח שושלת תא ברזולוציה גבוהה ולימודי תפקוד גן בנוירונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התפתחות נוירונים באמצעות סימון בשני צבעים שונים.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

גלה סרטונים נוספים