ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM
2 במרץ 2017
כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול MARCM דו-נקודתי זה היא לבצע ניתוחי שושלת תאים ברזולוציה גבוהה ומחקרי תפקוד גנים טובים יותר. רקמת המוח מורכבת ממספר עצום של נוירונים מגוונים, זה מאתגר לחקור את המנגנון העומד בבסיס האופן שבו נוירונים מתאספים יחד במהלך ההתפתחות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לתייג נוירונים שמקורם באבות נוירונים נפוצים בשני צבעים נפרדים.
המאפשרים לאחזר את לידתם של המידע של נוירונים בודדים. לכן, טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את המנגנון התאי והמולקולרי העומד בבסיס ההתפתחות העצבית. מי שמדגים את ההליך היום יהיה פיי-צ'י צ'ונג.
טכנאי מהמעבדה של פרופסור יו. התחל בשילוב זכרים ונקבות מוכנים ל-MARCM בבקבוקון מזון זבוב עם שמרים טריים בבקבוקון. שמרו על הזבובים המוכנים ל-MARCM ב-25 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לשפר את הסיכוי להזדווגות לפני איסוף ביצים מופרות.
כדי למנוע צפיפות יתר כאשר הזחלים בוקעים, הקישו על הזבובים המוכנים ל-MARCM והעבירו לבקבוקוני שמרים טריים. לגדל את צאצאי ה-MARCM התאומים, עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחות הרצוי. כאן, זבובים בשלב הזחל יקבלו הלם חום כדי לגרום לביטוי היפוך.
העבירו את בקבוקוני הזבוב לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10, 20, 30, 40 ו-50 דקות כדי לקבוע את הלם החום האופטימלי לביטוי היפוך. כדי ליצור את שיבוטי MARCM התאומים המעניינים. העיתוי של מכת החום קובע את שלב יצירת הפינוי, בעוד שתקופת הלם החום מגדירה כמה קרחות ייווצר.
תרבית החום זעזע את בעלי החיים התאומים MARCM ב-25 מעלות צלזיוס, עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. לאחר מכן המשך לצביעה והרכבה. הוסף PBS לכלי ההגנה של המלקחיים.
ואז, העבירו את חיות ה-MARCM התאומות לכלים. תוך כדי התבוננות דרך מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו במלקחיים כדי לנתח את המוחות מחיות MARCM עם נקודות תאומות. ראשית, הסר את הראש מגוף הזבוב.
לאחר מכן הסר בעדינות את הציפורן מבלי לפגוע במוח. לאחר מכן, הסר בזהירות קנה הנשימה המופיע כסיבים בצבע לבן. העבירו את המוח לצלחת זכוכית, המכילה 4% פורמלדהיד ו-PBS.
ומקבעים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. התחל את הליך הצביעה על ידי שטיפת מוח הזבוב שלוש פעמים עם 1% PBT. ואז שטיפה עם 1% PBT שלוש פעמים.
עם ניעור במשך 30 דקות בכל פעם. דגרו על מוחות הזבובים בתערובת של נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. שטפו ושטפו את מוח הזבוב שלוש פעמים כל אחד עם 1% PBT, עם ניעור כמו קודם.
לאחר מכן דגרו על מוחות הזבובים בתערובת של נוגדנים משניים למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה ושטיפת המוח כמו קודם, הרכיבו את המוחות על מיקרו-שקופית עם מגיב נגד מרווה. ואז הניחו זכוכית כיסוי כדי לכסות ולהגן על מוחות הזבובים.
אטום את הקצוות של זכוכית כיסוי המיקרו והמיקרו-שקופית באמצעות לק שקוף. לבסוף, צלם תמונות פלואורסצנטיות של שיבוטי MARCM דו-נקודתיים מהדגימות באמצעות מערכת המיקרוסקופיה הקונפוקלית לבחירה. איור זה מציג תוצאות משיבוט MARCM בעל הנקודה התאומה, נוירוני הקרנת ריח גביים אנטרו VL2p שמקורם באינדוקציה של flippase.
לתווך רקומבינציה מיטוטית בפיצוץ הנוירולוגי adPN בשלב העוברי. התרשים הראשון הזה מראה את דפוס הנוירוגנזה. בתמונת מיקרוסקופ קונפוקלית זו של המוח, ה-VL2p adPNs מוצגים בירוק וקשורים ל-adPNs רב-תאיים של נוירו-בלאסט במג'נטה.
תמונה זו מציגה את התאים בקרן הצדדית. המורפולוגיה העצבית של אונת האנטנה נראית כאן. תמונה זו מציגה את הנתונים עבור שמות adPN של DL1.
כפי שניתן לראות כאן, שמות ה-adPN של DL1 מופיעים בשלב מאוחר יותר בפיתוח מאשר שמות adPN של VL2p. אינדוקציה של שיבוטי MARCM דו-נקודתיים של DC3 adPNs מדגימים כי סוג עצבי זה מופיע מאוחר יותר בהתפתחות. תמונה זו מראה שאירוע MARCM דו-נקודתי מתרחש בנוירון שלילי GAL4 בתוך שושלת adPN.
לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לנתח שושלת עצבית ולספק סמנים שונים להבחנה בין נוירונים לשיבוט נוירובלסטים. יתר על כן, MARCM נקודתי כפול יכול לייצר שיבוטים מוטנטיים הומוזיגוטיים כדי לחקור מנגנון מולקולרי. ברקע גנטי הטרוזיגוט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול twin-spot MARCM שתוכנן לניתוחים ברזולוציה גבוהה של שושלות תאים ומחקרי תפקוד גנים בנוירונים. באמצעות סימון נוירונים מתאי פרוגניטורים משותפים בשני צבעים נבדלים, חוקרים יכולים לעקוב ביעילות אחר הפיתוח והתאריך המדויק של לידתם (birth-dating) של נוירונים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- רקמת המוח מורכבת ממגוון רחב של נוירונים.
- הבנת התארגנות הנוירונים במהלך ההתפתחות היא מורכבת.
- יתכן שטכניקות נוכחיות אינן מספקות רזולוציה מספקת למעקב אחר שושלות תאים.
- פרוטוקול זה נועד לתת מענה לאתגרים אלו.
מטרת המחקר
- לביצוע אנליזות מפורטות של שושלות תאים.
- לשיפור מחקרים על תפקוד גנים בנוירונים.
- להקל על חקירת מנגנונים תאיים ומולקולריים בהתפתחות עצבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול Twin-spot MARCM לסימון נוירונים.
- שימוש בסמני צבע מובחנים למעקב אחר שושלות תאים.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה.
- ניתוח של התפתחות נוירונלית ותפקוד גנים.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של נוירונים מתוך תאי אב משותפים.
- יכולת לשחזר מידע על מועד הלידה של נוירונים בודדים.
- הבנה משופרת של השושלה וההתפתחות העצבית.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תפקוד גנים בפרטים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול ה-MARCM בעל ה-twin-spot הוא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- הוא מאפשר ניתוח מפורט של שושלת נוירונלית ותפקוד גנים.
- טכניקה זו יכולה לקדם באופן משמעותי את הבנתנו לגבי התפתחות עצבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת השושלת העצבית ותפקודי הגנים באורגניזמי מודל מספקת תובנות בסיסיות לתיקוף יעדים בפיתוח טיפולים נוירו-תרפויטיים. טכניקת ה-twin-spot MARCM מאפשרת מיפוי ברזולוציה גבוהה של סדר הלידה הנוירונלי ואנליזה פנוטיפית של נוירונים זהים גנטית בין פרטים שונים, ובכך היא תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור מנגנוני התפתחות לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מעקב אחר השושלת הנוירונלית מפרוגניטורים משותפים, כדי להעריך תפקוד גנים באוכלוסיות תאים מוגדרות.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אנליזה פנוטיפית של שיבוטים מוטנטיים הומוזיגוטים ברקעים הטרוזיגוטים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתוני שושלת כמותיים המתואמים עם מנגנונים של מחלות התפתחותיות נוירולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מערכות עצביות מאושרות ומסומנות בצבע, המתאימות לסריקת תרכובות בשלב הבא במעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה וחזרתיות באמצעות יצירת שיבוטים הניתנים להשראה וספציפיים לשלב, הנשלטים על ידי משך ההלם התרמי.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור תתי-סוגים עצביים מרובים (למשל, שושלאות adPN) לסריקת פנוטיפים השוואתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אפשור ניתוח של סדר הלידה של נוירונים המעורבים בהפרעות נוירו-התפתחותיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר ניתוח פנוטיפי של נוירונים זהים בין בעלי חיים כדי להבחין בין שונות גנטית לשונות סטוכסטית במחקרי תפקוד גנים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי לשלב התיקוף על ידי אספקת נתונים ברזולוציית שושלה (lineage) למחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציית מסלולים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת ה-MARCM בעלת הנקודות הכפולות (twin-spot) משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד למחקרי מנגנון פרה-קליניים, במיוחד עבור אינדיקציות להתפתחות עצבית שבהן מקור הנוירונים והקישוריות ביניהם הם קריטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי קישור הפרעה גנטית לפנוטיפים עצביים ספציפיים לשושלה.
- סריקה: מספקת תכונות עצביות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, עם פלטים כמותיים המבוססים על עיתוי הלידה הקלונאלית וביטוי סמנים.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח השוואתי של מורפולוגיה עצבית וביטוי גנים בשלבי התפתחות שונים באמצעות קריאות בצבעים כפולים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מודלים תואמי-שושלה עבור מודולציה של מטרות התואמות ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כהסכמה הניתנת לשימוש חוזר ליצירת קהות עצביות סטנדרטיות על פני פרויקטים ומערכות מודל שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת משתנים מתבלים הקשורים לשושלת במחקרי תפקודי גנים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות השראה קלונאלית מבוקרת ופרוטוקולים סטנדרטיים לצביעה ולקיבוע.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של השפעות פנוטיפיות ספציפיות לשושלת, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אספקת בהירות מכניסטית לגבי מטרות נוירונליות ברקמות הטרוגניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, בטכניקות סימון קלוני ובמיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך פרשנות מדויקת של שוורות תאים.
- תלוי במיכשור הכולל התקן להלם חום, מיקרוסקופים לניתוח ומערכות דימיון קונפוקאלי להשראה ולוויזואליזציה של קלונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון הלם החום, פרוטוקולי צביעה ופרמטרי דימיון כדי להבטיח עקביות קלונית בין המשתמשים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על שוורות עצביות שונות או שלבי התפתחות שאינם מודל ה-adPN המוצג.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון תלות היעילות הקלונית במשך הלם החום והצורך באופטימיזציה עבור כל שוורה מטרת, כפי שצוין בפרוטוקול.
