אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל

סרטון זה מתאר שיטה לשיתוק תאי יונקים, כגון איי לבלב בחרוזי אלגינט באמצעות כלי ערבוב פשוט. העיקרון של השיטה הוא יצירת טיפות אלגינט על ידי תחליב מים ושמן, ולאחר מכן ג'לציה פנימית של טיפות האלגינט. השלב הראשון של ההליך מורכב מיצירת תחליב שבו פאזה מימית המכילה תאי אלגינט וסידן פחמתי מתפזרת בשלב אורגני של שמן מינרלי.

השלב השני הוא החמצת האמולסיה על ידי הוספת חומצה מסיסה בשמן, כגון חומצה אצטית, המתפצלת במהירות לפאזה המימית. ירידת ה-pH מובילה לפירוק הסידן הפחמתי, ולג'לציה הפנימית של טיפות האלגינט לחרוזים. השלב האחרון מורכב מהחזרת החרוזים מהאמולסיה על ידי הוספת תמיסה מימית, הפרדת השלבים על ידי צנטריפוגה, ואחריה שטיפה וסינון החרוזים.

לאחר מכן ניתן לתרבת את התאים המשותקים במבחנה או להשתמש בהם להשתלה. השיטה שתיארנו היא אלטרנטיבה לשימוש במעטפות תאים מבוססות זרבובית ליצירת חרוזי אלגינט. זה נגזר משיטה לאנזימים וקיבוע תאים מיקרוביאליים, שדווחה לראשונה על ידי פונסלה ואחרים בשנת 1992.

היישום שהכי מעניין אותנו הוא אנקפסולציה של אלגינט כאמצעי לבידוד חיסוני של תאים מושתלים, כדי להפחית או אפילו לבטל את הצורך בתרופות נגד דחייה. היתרונות העיקריים של התהליך מבוסס האמולסיה על פני מכשירים מבוססי זרבובית הם יכולת ההרחבה שלו וחוסנו. מכיוון שהטיפות נוצרות כמעט בו זמנית, ניתן לייצר כמויות גדולות מאוד של חרוזים בפרקי זמן קצרים מאוד, מתמיסות אלגינט מדוללות מאוד או מרוכזות מאוד.

יתר על כן, התהליך חזק מאוד, ואינו נוטה לכישלון, ואפילו בנוכחות חלקיקים שעלולים לחסום חרירים, ולבסוף ציוד התהליך פשוט למדי ולכן הוא נגיש, בעלות נמוכה יחסית לרוב המעבדות. שלבי העיבוד העיקריים הם תחליב ליצירת טיפות אלגינט, והחמצה לשחרור מקור הסידן הפנימי. גודל הטיפה מושפע בעיקר מעיצוב האימפלר, קצב התסיסה ומשך התסיסה.

התכונות המכניות של החרוזים והישרדות התא מושפעות מהיקף ומשך ההחמצה. בסרטון זה אנו מדגימים שיטה המשמשת לעטיפת תאים בחרוזי אלגינט 5% להשתלה. סביר להניח שפרמטרים אלה ידרשו אופטימיזציה עבור יישומים פוטנציאליים אחרים.

כדי לייצר חרוזי אלגינט 5% המכילים תערובת חצי וחצי של אלגינטים LVM ו-MVG, שקלו 583 מיליגרם LVM ו-583 מיליגרם אבקת חומצה אלגינית MVG. מניחים מאגר תהליך של 20 מיליליטר על צלחת ערבוב מגנטית. ליישומי השתלה אנו משתמשים במאגר HEPES של 10 מילי-מולרי המכיל 170 מילי-מולרי נתרן כלורי ב-pH 7.4.

הוסף בהדרגה את אבקת החומצה האלגינית לתמיסה. השאירו את התמיסה תוך ערבוב למשך הלילה במהירות נמוכה. במידת הצורך, מהדקים את הבקבוק לצלחת הערבוב.

למחרת, אם האלגינט לא מומס לגמרי, מהדקים את הצנצנת על מערבל סיבובי וממשיכים לערבב למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר המסה מלאה של האלגינט, עקרו את התמיסה על-ידי חיטוי במשך 30 דקות. הניחו לטמפרטורה לרדת מתחת ל-50 מעלות צלזיוס לפני פתיחת החיטוי.

הכן את תרחיף הסידן הפחמתי על ידי הוספת גרם אחד של סידן פחמתי למאגר תהליך של 20 מיליליטר. חיטוי תרחיף הסידן הפחמתי והכלי המעורב המשמש לתהליך האמולסיה. לפני השימוש, הסר כל עקבות של מים מרוכזים מהכלי.

מיד לפני תהליך האמולסיה, ממיסים 44 מיקרוליטר חומצה אצטית קרחונית בשמן מינרלי של 11 מיליליטר המונח בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. טעות נפוצה היא פירוק לא מלא של החומצה האצטית, הימנע מפיפטינג בכמויות קטנות מ-10 מיקרוליטר, וודא שהחומצה מומסת לחלוטין על ידי מערבולת חוזרת. אפשר לכל התמיסות להגיע לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך לעטיפת תאים.

מניחים 10 מיליליטר שמן מינרלי בבקבוק הספינר, ומתחילים לערבב בחום של 250 סל"ד. אם משתמשים בתאים דבקים כגון תאי בטא-tc3, נסה את התאים. סיים את התגובה על ידי הוספת מדיום שלם וקח דגימה לספירת תאים.

קבע את ריכוז התאים באופן ידני או באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה את התאים למשך שבע דקות ב -300 גרם ולאחר מכן השעו מחדש את משטח התא בתווך שלם. חזור על שלב הצנטריפוגה ולאחר מכן השהה מחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום שלם כדי להשיג פי 10 ו -1/2 את הריכוז הסופי הרצוי בחרוזים.

העבירו תמיסת אלגינט של 9.9 מיליליטר לצינור תחתון שטוח, ואז הוסיפו 1.1 מיליליטר ממלאי התאים, ו-550 מיקרוליטר מתרחיף הסידן הפחמתי. מערבבים את האלגינט, הסידן הפחמתי ותרחיף התאים על ידי מערבולת קלה. העבירו מיד 10.5 מיליליטר מתערובת זו לשמן המתסיס באמצעות מזרק.

הגדל את קצב התסיסה ולאחר מכן הפעל את הטיימר. כדי לקבוע את קצב התסיסה, יש ליצור תחילה עקומה סטנדרטית המקשרת את גודל החרוז לקצב התסיסה. לאחר 12 דקות מוסיפים 10 מיליליטר מתמיסת השמן והחומצה האצטית כדי להחמיץ את האמולסיה, לשחרר את הסידן מהקרבונט ולקבל חרוזי ג'ל.

הקדישו שמונה דקות לשלב הג'לציה הפנימי הזה. שימו לב לשינוי הצבע של הטיפות המתחלבות המכילות את מחוון ה-pH האדום של פנול. הפחיתו את קצב התסיסה ל-400 סל"ד, נטרלו את החומצה על ידי הוספת 40 מיליליטר של מאגר תהליך מעורבב עם 10% בינוני, מה שמוביל להיפוך פאזה.

עצרו את התסיסה כעבור דקה והעבירו את התערובת לצינורות חרוטיים. שוטפים את בקבוק הספינר עם 20 מיליליטר נוספים של מדיום, ומוסיפים אותו לצינורות. שאפו כמה שיותר מהתמיסה המימית לפני שאיבת שלב השמן.

צנטריפוגה את הצינורות למשך שלוש דקות ב-630 גרם כדי להאיץ את שקיעת החרוזים והפרדת הפאזה. הסר את השמן ואת מאגר התהליך העודף על ידי שאיבה עם פיפטה פסטר. שוטפים את החרוזים לפחות פעם אחת עם בינוני באמצעות צנטריפוגה של 630 גרם בין השטיפות.

סנן את מתלה החרוזים על מסננות תאי ניילון 40 מיקרון ושאב עודפי נוזלים במסננת מלמטה. מעבירים את החרוזים לנפח ידוע של מדיום בעזרת מרית. מדוד את נפח החרוז ומלא את המדיום כדי להשיג את ריכוז החרוזים הרצוי.

ריכוז טיפוסי הוא חרוז מיליליטר אחד לכל נפח כולל של חמישה מיליליטר. מנקודה זו ואילך, טפל תמיד בחרוזים עם פיפטות גדולות כדי למנוע נזק לחרוזים. כעת ניתן להעביר את התאים העטופים לצלוחיות T, ולהשתמש בהם לתרבית חוץ גופית או להשתלה.

בסוף תהליך האמולסיה יש להשיג חרוזי אלגינט המכילים תאים משותקים. לאחר התהליך, יש להעריך באופן שגרתי את התפלגות גודל החרוז ואת הישרדות התא. כדי לקבוע את התפלגות גודל החרוזים, ניתן לצבוע את החרוזים בכחול טולואידין, ולאחר מכן ניתוח תמונה.

מתהליך זה צפויה התפלגות רחבה של גודל החרוזים. כדי להעריך את הישרדות התאים ניתן לדגור את החרוזים עם כתמים מתים חיים, כגון קלצין-AM ואתידיום הומודימר. באמצעות התהליך המתואר בסרטון זה, נמדדה הישרדות של 76% תאי בטא-tc3.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לשתק תאי יונקים בחרוזי אלגינט באמצעות מערכת ערבוב פשוטה. הפרוטוקול הבסיסי המוצג בסרטון זה אמור להתאים לשיתוק מגוון סוגי תאים באמצעות מגוון רחב של סוגי אלגינט והסתיידויות. אנו ממליצים ליצור עקומה סטנדרטית המתייחסת לגודל החרוז הממוצע לקצב הערבול עם כל מנה חדשה של אלגינט או שמן.

תהליך האמולסיה שתיארנו הוא אלטרנטיבה מבטיחה למעטפות תאים מבוססות זרבובית. זוהי שיטה חזקה ופשוטה לשתק תאי יונקים בחרוזי אלגינט. ככל שאנו ואחרים ברחבי העולם מפתחים טיפולים בתאי זרבובית, יהיה צורך בקנה מידה כזה של שיטות עבור אלפים רבים של חולי סוכרת.

פרסמנו תוצאות מבטיחות מהשתלת קו תאי בטא בחרוזי אלגינט 5%, וממשיכים לחקור את הביצועים in vivo של המחסום המשופר הזה לדחיית השתל.