הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

המטרה הכוללת של שיטת צנטריפוגה זו של תחליב מים בשמן היא להכין בקלות שלפוחית ענקית בשכבה דקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הסינתטית כמו יצירת תא מלאכותי המבוסס על שלפוחית ענקית. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת מלאי של 25 מילימולרית של DOPC ותמיסת מלאי של אפס נקודה שתי מילימולר של טקסס אדום DHPE בכלורופורם.

לאחר מכן, צרו סרט שומנים על המשטח הפנימי של בקבוקון זכוכית של חמישה מיליליטר על ידי אידוי תערובת של תמיסות מלאי DOPC וטקסס רד DHPE תחת גז חנקן זורם. לאחר דגירה של הסרט בלחץ מופחת למשך הלילה, הוסף מיליליטר אחד של פרפין נוזלי לבקבוקון. עוטפים את הבקבוקון בנייר אלומיניום ומדגרים את התערובת בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

בתערובת של נקודה אחת של חמישה מיליליטר עם מכסה 237 נקודות חמישה מיקרוליטר של מיקרומטר אחד מיקרוספירות לא פלואורסצנטיות ו-12 נקודות חמישה מיקרוליטרים של מיקרומטר אחד מיקרוספירות פלואורסצנטיות. כעת הוסיפו למיקרו-צינור 64 מיליגרם סוכרוז ואחריו 125 מיקרוליטר של תמיסת טריס טוחנת אחת ו-875 מיקרוליטר מים נטולי יונים. מערבל את התערובת למשך 30 שניות, ואז סוניקציה למשך 10 דקות.

לאחר הכנת 10 מיליליטר של תמיסה חוצצת Tris, הנח מיליליטר אחד במיקרו-שפופרת עם מכסה של נקודה וחמישה מיליליטר. לאחר שהתמיסה עברה מערבולת וסוניקציה מערבבים מיליליטר אחד מתמיסת השמן עם 300 מיקרוליטר מהתמיסה המימית הפנימית במיקרו-שפופרת של נקודה וחמישה מיליליטר. מתחלב את שני הרכיבים במיקרו-שפופרת באמצעות הומוגיניזר מכני המופעל ב-10,000 סל"ד למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שכבו בעדינות 300 מיקרוליטר של תחליב המים בשמן על המשטח העליון של מיליליטר אחד של התמיסה המימית החיצונית בארבע מעלות צלזיוס במיקרו-צינור עם מכסה של נקודה וחמישה מיליליטר. מיד לאחר צינון המיקרו-צינור למשך 10 דקות צנטריפוגה את התערובת בחום של 18, 000 פעמים G למשך 30 דקות. בסיום, השג את שלפוחיות הענק המשקעות או GV על ידי ניקוב תחתית המיקרו-צינור עם סיכת דחיפה ואיסוף טיפה אחת במיקרו-צינור מעוקר של נקודה וחמישה מיליליטר.

הנח תא דגירה דביק לתגובת שרשרת NC שני פולימראז והכלאה על גבי זכוכית כיסוי מיקרוסקופ. בעזרת מיקרופיפטה, הפקידו 25 מיקרוליטר מה-GV המשקעים המדוללים על שטח הדגימה והניחו מיד נקודת אפס זכוכית כיסוי בעובי חמישה מילימטר על גבי תא הדגירה. לאחר הקלטת תמונות מיקרוסקופ של השלפוחית, בצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על ידי הכנסת יחידות מראה פלואורסצנטיות UFBNA ו-UFMCHE למיקרוסקופ.

לאחר מכן התאם את היחידות עם מסנני עירור ומסנני פליטה לניתוח. הגורם החשוב ביותר להצלחה של שיטת מים בשמן הוא שהמשקל הסגולי של התמיסה המימית הפנימית חייב להיות גדול מזה של התמיסה המימית החיצונית כדי שה-GV ישקעו במהלך הצנטריפוגה. מיקרוסקופ הפרעות דיפרנציאלי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של GVs ללא מיקרוספירות ועם מיקרוספירות אישרו כי נוצרו GVs עם למלוריות נמוכה.

מתוך 160 GV שהתקבלו, 55 מיקרוספירות מכוסות ו-105 היו ריקות מה שנותן יחס של 34% של אנקפסולציה. חלק הנפח של המיקרוספירות ב-GV הוערך בכ-11 פלוס מינוס שלושה אחוזי נפח והדיוק של שבר הנפח המחושב היה 10 עד 30% אנקפסולציה של חומרים אחרים ל-100 אחוז מול DOPC GVs תוך שימוש באותה תמיסה מימית חיצונית ואותו פרוטוקול היה מוצלח כפי שהוצג על ידי מיקרוסקופ הפרעות דיפרנציאליות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זרימה ציטומטרית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הבהרת התא המודל.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.