Name: מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו למדוד תגובתיות תאי T אלוגנית באמצעות ציטומטריית זרימה הדמייתית לחקר אימונולוגיית השתלות. שיטה זו מאפשרת ניתוח בקצב גבוה של ממשקים בין תאי T לתאים מציגי אנטיגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SCJ נתמכה על ידי האגודה הבינלאומית ללב וריאות השתלת מחקר אחוות וגם בקולג &#39;המלכותי של רופאים ומנתחים של קנדה Detweiler נסיעה Fellowship.SM נתמכה בחלקה על ידי האגודה הבינלאומית ללב וריאות השתלת קריירה פיתוח פרס (עד SCJ). SS נתמכה על ידי המכונים הלאומיים Centre.JH מחקר ביו-רפואי לבריאות מחקר אוקספורד הוא מקבל כליה מחקר בבריטניה בכיר Non-קליניים Fellowship. עבודה זו מומנה על ידי מענקים הבאים ל AB ו KW: מענק תוכנית הנאמנות Wellcome (082519Z07Z), מענק תוכנית קרן הלב הבריטית (PG / 10 / 62.28504), ואת תכנית המסגרת של האיחוד האירופי 7 (מחקר אחד; BioDRIM). המחברים מבקשים להודות מייקל פרסונס ואת מתקן Core cytometry הזרימה במכון המחקר לוננפלד-טננבאום, מערכת בריאות הסינית, טורונטו למתן גישה ותמיכה עם מכשיר ImageStream מארק X.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cellular+events+in+a+systemic+graft-vs.-host+reaction.+II.+Autoradiographic+estimates+of+the+frequency+of+donor+lymphocytes+which+respond+to+each+Ag-B-determined+antigenic+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex.</a> J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).</li>
<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
<li>Noorchashm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+the+calculation+of+alloreactive+CD4%2B+T+cell+precursor+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency.</a> Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

זרימת הדמיה cytometry נוצל כדי להדגים היווצרות הסינפסה החיסון בין תאי T מונוקלונלי ונגמ&quot;שים או בנוכחות סופר-אנטיגנים 24, 25, 26, 27, 28. שיטה זו מנצלת את העובדה כי לאחר מגע התא-APC T פרודוקטיבי, תא T מארגן מחדש cytoskeleton יקטין שלה, מקטב זה כלפי האתר של מגע 21. התארגנות זו אינה מתרחשת ללא איתות TCR, וזה אפוא לתאם מוקדם של ההפעלה של T-cell 19, 20, 21. השיטה המוצגת כאן מסתגל גישה זו למדידת alloreactive תדירות T-cell באוכלוסיות polyclonal T-cell. ככזה, הוא עשוי בעתיד לשמש בסיס לפיתוח מבחנים עבור reactivi תורם<html> טאי בהשתלות קליניות. למרות השוואה ישירה שטרם בוצעה, זיהוי של alloreactive סינפסות החיסונית נראה שיש יכולת ניבוי מעולה מ לקה&quot;ע הקונבנציונלי. לדוגמא, מחקרים קודמים הראו כי, בפרוטוקול tolerizing שתואר לעיל, התוצאות של לקה&quot;ע מצליחות לתאם באופן אמין עם תוצאה שתל 2. מספר המבחנים פותח עבור המדינה הסובלנית המבצעי בבני אדם 9, 10, 11, אם כי אלה לא מודדים תפקוד תא מפעיל בתגובת alloantigen. לעומת זאת, IFNγ ELISPOT מבחני 8 מידת מפעיל פונקצית T-cell אבל לא יכול ללכוד את מלוא הספקטרום של הפרשת ציטוקינים שעשויות להיות רלוונטי דחייה של שתל אקוטית וכרונית, כגון IL-17 38,&gt; 39. את assay דילול הגבלת 4, אשר הוא עבודה אינטנסיבית, ואת assay טרנס-vivo 6, מחייב עכברים, יש מגבלות מעשיות משמעותיות כי הייתה לעכב את היישום שלהם בסביבה קלינית. השיפורים אחרונים על הניתוח של תאים מתרבים באמצעות ניתוח רצף TCR של תאי T מגיבים ב לקה&quot;ע עשויים להיות בעל ערך, אבל כמו assay המוצג כאן, ידרשו אימות נוספת במחקרים קליניים 18, 40. פיתוח נוסף של assay זיהוי סינפסה החיסוני ידרוש כי מספר השאלות חשובות ייענה. ראשית, assay כפי שפותחה מודד alloreactivity ישירה בלבד. המסלול הישיר מקריא מתחמי אלוגנאית MHC / פפטיד על נגמ&quot;שים תורם נגזר. זה האחרון מסולק בדרך כלל במהירות לאחר השתלה, והצגת alloantigen נוספת היא carried על ידי נגמ&quot;שים נמען בהצגה (מסלול חצי-ישיר) MHC תורם שלם או אנטיגנים תורם מעובדים על עצמי MHC (מסלול עקיף). המסלול העקיף הוא נהג חשוב של דחייה של שתל כרוני 33, 41. באופן עקרוני, זה צריך להיות אפשרי לזהות סינפסות חיסונית עקיפה באמצעות assay, אך בעקיפין alloreactive תאי T יש תדר נמוך בהרבה מאשר אלה ישירים 42, 43, כלומר הניתוח של מספר גדול יותר של אירועים יידרש. שיקול שני הוא שאנחנו רק צריכים לבדוק את זה assay באמצעות תאי CD4 + T, ואילו תאי CD8 + T הם גם מרכיב חשוב של התגובה האנטי-תורם. שוב, זה צריך להיות אפשרי לזהות סינפסות CD8 + T תא-APC בשיטה זו. מגבלה נוספת היא כי השיטה מחייבת בבדיקה הידנית וניתוח של תמונות תא memb הסופישער קשר RANE, ואנחנו עובדים כרגע על האוטומציה של צעד זה. לבסוף, השיטה דורשת בדיקות ופיתוח בבני אדם, מחקרים ראשוניים עם דגימות אנושיות כרגע מתבצעים. פנוטיפי בהמשך לניתוח T-cell משנה (כלומר, מפעיל, זיכרון, שוק הון ועוד) בשילוב עם זיהוי של סינפסות חיסונית במושתלים ייצג גישה חזקה לאפיון רפרטואר תאי T alloreactive ויהיה מוקד חשוב עבודה עתידית.

השתלת איברים Solid שינתה את הטיפול בחולים עם מחלות סופנית של כליות, כבד, לב, ריאות ו. בשל הפערים אנטיגנים histocompatibility ראשיות ומשניות, אולם, allografts נדחות מיד על ידי תאי T הנמען אם בתרופות המדכאות אינם בשימוש. יש סוכנים אלו תופעות לוואי רבות, כולל הסיכונים לסרטן ובעיות בתפקוד האיבר. מטרה קלינית עיקרית היא אפוא להפחית את המינון של דיכוי חיסוני לרמה המינימאלית הנדרשת כדי למנוע דחייה של שתל. רמה זו עשויה להשתנות בהתאם למידת ההפעלה של מערכת החיסון המולדת; מידת התאמת alloantigen התורם-נמען; והבדלים-החולה השאר בתפקוד המערכת החיסונית, פרמקוקינטיקה, ו פרמקודינמיקה. לצערנו, טפל השתלה אין כלים כלשהם להערכת תגובתיות תורמת במדויק בחולים בודדים 1. מעורבתתגובה לויקוציטים (לקה&quot;ע) יכולה לזהות תגובתיות תורמת, אבל זה לא מצליח לחזות 2 תוצאה שתל בצורה מהימנה, 3. מבחני דילול הגבלה, ELISPOTs ציטוקינים, ואת assay טרנס-vivo או למדוד מגוון מוגבל של תגובות או אינן מעשיות 4, 5, 6, 7, 8 פרופילי ביטוי .Gene יש חתימות חשף הקשורים סובלנות מבצעית 9, 10, 11, 12 ודחיית 13, 14, 15, אך אלה אינם תמיד להכליל על פני אוכלוסיות 16 ועלולים בסופו של דבר מוגבל תועלת בחולים בודדים. analy רצף מבוססSES של קולטן T-cell (TCR) של תאי T בדם ההיקפי 17 או מתרבה במהירות 18 לקה&quot;ע גם פותח אך דורש אימות נוספת. מבחינה מושגית, רצוי להיות בעל assay שמזהה את הצעדים הנדרשים המוקדמים הפעלת נמען תא T על ידי אנטיגן תורם. מאז culturing תא על פני ימים (כמו לקה&quot;ע) יכול להציג חפצים, מבחן כזה אידיאלי לא יצריך המדידה של אירועים במורד זרם, כגון התפשטות או פונקציה מפעילה. באותה מידה, לעומת זאת, זה היה גם רצוי למבחן לסמוך על אלמנט כלשהו של תפקוד תאי T, שכן הערכות תיאורי גרידא (למשל, סידור TCR) ייתכן שלא תוכל להבחין בין תאי T anergic ופונקציונלי. מחקרים רבים הראו כי מגע ממושך T-APC נדרש היווצרות סינפסה חיסונית, אשר מהווה הראשון חיוניצעד בתגובת תאי T 19, 20, 21, 22. אנחנו לאחרונה דווח כי, במהלך דינמי הדמיה זמן לשגות במבחנה, על 5 - 10% של העכבר CD4 + T לתאים ליצור קשרים ארוכי טווח עם תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם אלוגנאית (BMDCs) 23. תדירות המגע ממושך הוגדלה בחיות כי דחו שתל, ואילו עכברים שניתנו בעבר סובלני לאותם אנטיגנים, זה נשאר ברמות לראות עכברי untransplanted 23. אינטראקציות ממושכות הופחתו בנוכחות הנמען Tregs וגדילה בהיעדרם, ואנחנו דומים נצפו תופעות באמצעות תאי T אנושיים DCS-נגזר מונוציטים אלוגנאית (MoDCs) 23. עם זאת, ספירת קשר ממושך הנעשית בתוך populatio polyclonal T-celln הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. אנחנו ולכן הסתייענו הדמית תזרים cytometry לבחון היווצרות הסינפסה חיסונית אלוגנאית. זרימת הדמית cytometry משלבת את יכולות רכישת וניתוח נתוני multiparametric של זרימה קונבנציונלית cytometry עם יכולות הדמית תא הבודד של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו שימשה חוקרים אחרים ללמוד היווצרות סינפסה החיסונית על ידי תאי T מונוקלונלי 24, 26, 27 או בנוכחות סופר-אנטיגנים 28. בנסיבות כאלו, אולם, תדירות תאי T מגיבים נע בין 30-100%, ואילו alloreactive תאי T מוערכים בדרך כלל לייצג 5-15% מכלל הרפרטואר T-cell הכולל 29, 30, 31, 32. חשוב לציין, הראינו כי זרימת הדמיה cytometry יכול לייצר avery מידה דומה של alloreactive תדירות T-cell 23 וכי שינויים בתדירות סינפסה בתוך אוכלוסיית polyclonal תאי T הם חזויים של תוצאה שתל 23. נכון לעכשיו, גישה זו כבר מותאמת למדידת alloreactivity הישירה של תאי CD4 + T, אבל, באופן עקרוני, זה יכול להיות גם פתח לבחון תאי CD8 + T ואת המסלול העקיף. העקיף alloreactivity הוא האמין להיות רלוונטי יותר ויותר בזמנים יותר לאחר השתלת 33. אנו מפתחים בימים אלה בשיטה זו כדי להשתמש בתאי אדם, אשר ייאפשרו לבדיקה בחולים. לפיכך, בעתיד, הגישה הכללית עשויה להיות שימושית עבור ההערכה התפקודית של תגובות תאי T במושתלים לפני ההשתלה; מייד לאחר השתלה; וגם לטווח הארוך, כאשר מזעור סמים הופך מטרה חשובה.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td></td><td>משתנה</td><td></td></tr><tr><td>שונים חומצה אתילנדיאמנטטראצטית, תמיסה של 0.5 מ'</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100 חומר ניקוי לא יוני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1635</td><td>היא 37% פורמלדהיד ולכן יש לדלל אותה 25 פעמים עבור תמיסה של 1.5%</td></tr><tr><td>מסנני תאים, 70 &mu; m גודל נקבוביות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין-פלואורסצאין איזותיוציאנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-אמינואקטינומיצין D</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A1310</td><td>להרכיב מחדש ב-DMSO</td></tr><tr><td>אלופיקוציאנין מצומד נגד עכבר CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>פסיפיק כחול מצומד נגד עכבר CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>כחול פסיפי הוחלף ב-eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse MHC class II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>ביוטיניל נגד עכבר CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים אנטי ביוטין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS מפריד תאים מגנטיים</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>TGF ובטא אנושיים רקומביננטיים; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>TGF ובטא אנושיים; 1 יש פעילות על תאי עכבר</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Imaging flow cytometer; פרטים זמינים בכתובת http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>להורדה בחינם (נדרשת הרשמה): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>מדיום תרבית תאים&nbsp;</td><td>משתנים</td><td></td> <td>שונים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td></td><td>משתנים</td><td></td></tr><tr><td>שונים צלחות תרבית תאים</td><td>שונות</td><td>משתנים</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת t cell alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת תגובתיות אימונולוגיים לאנטיגנים התורמים במושתלים צפויה להיות מכריע עבור ההפחתה המוצלחת או הנסיגה של דיכוי חיסוני. התגובה לויקוציטים מעורבת (לקה&quot;ע), מבחני דילול מגבילים, וכן רגישות יתר טרנס-vivo מתעכב-סוג (DTH) assay יש כל הוחלו על שאלה זו, אך שיטות אלו מוגבלים ביכולת חיזוי ו / או מגבלות מעשיות משמעותיות המפחיתים השימושיות שלהם. זרימת הדמיה cytometry היא טכניקה המשלבת כוחות כמותיים multiparametric של זרימת cytometry עם יכולות הדמיה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחרונה ערכנו שימוש בגישת cytometry זרימת הדמיה להגדיר את חלקם של תאי נמען T מסוגלים ליצור סינפסות חיסונית בוגרת עם תאי תורם מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים). באמצעות מודל השתלת לב עכבר מאופיין היטב, הראינו כי התדירות של סינפסות במבחנה חיסונית בקרב T-APC membrקשר Ane אירועי תוצאה חזוי של שתל חזק דחייה, סובלנות, לבין מצב בו הישרדות השתלת תלוי תא T רגולטוריים מושרה. תדירות הקשר T-APC גדל עם תאי T מעכברים במהלך דחייה חריפה וירידה עם תאי T מעכברים שניתנו מגיב alloantigen. התוספת של תאי T רגולטוריים למערכת במבחנה מופחתת קשר T-APC ממושכת. האנושות, האפקט הזה גם נתפס עם polyclonally האנושית התרחבה, המתרחש בתאי T רגולטוריים טבעי, אשר ידוע לשלוט דחיית רקמות אנושיות בעכברי מודל אנושי. פיתוח נוסף של גישה זו עשויה לאפשר אפיון מעמיק יותר של תא T-cell alloreactive במושתלים. בעתיד, התפתחות נוספת והערכה של שיטה זו באמצעות תאים אנושיים עשויות להוות בסיס מבחנים משמשים לבחירת חולים למזעור דיכוי חיסוני, וזה יכול לשמש כדי למדוד את ההשפעה של tolerogenIC טיפול בעזרת במרפאה.

שיטה זו שימשה לחקור CD4 + T-cell alloreactivity בעכברים שניתנו סובלנית כדי alloantigens התורם לפני השתלה שתל לב heterotopic. עכברים CBA (H-2 k) קיבלו פרוטוקול tolerizing המורכב עירוי דם מתורם ספציפי (B6, H-2 ב) בשילוב עם נוגדנים CD4 שאינם מדלדלים חודש אחד לפני שעבר השתלת לב B6. תוצאות פרוטוקול זה בהישרדות השתל לטווח ארוך כי הוא תלוי Foxp3 + תאי T רגולטוריים 36, 37. שבעה ימים לאחר השתלה, תאי טחול CD4 + T התקבלו tolerized ומקבלים הלא tolerized של allografts לב B6 והיו שיתוף וטופח עם DCS-מוח העצמות נגזרות B6 פי פרוטוקול זה. איור 2 מציג נתוני נציג מניסוי זה. שער מגע הקרום מוצג באיור 2A, עם דגש הכוונת ירוק על אירוע הסינפטי (בחלונית השמאלית, 1) ועל אירוע בלתי הסינפטי (פאנל מימין). איור 2B מראה את ערוצי brightfield הקרינה עבור אירוע זה. כדי לצמצם הטיה, נתונים נותחו על ידי משקיף מסונוורים משימת טיפול 23. כפי שניתן לראות מספר דוגמאות באיור 3, הן מן הלא-tolerized (איור 3A-B) ו tolerized (איור 3 ג-ד) מקבלי CBA של לבבות B6, סינפסות הם להבחין בקלות בין המגעים הלא-סינפטי על ידי נוכחות של רכס FITC חיובי צפוף בממשק T-APC. תוצאות אלו מראות כי זיהוי ויזואלי של סינפסות חיסונית שנעשתה על ידי תאי T נמען מסלולים עם מידת alloreactivity של הנמען. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> זיהוי איור 2. T-APC כפילויות עם ממברנהקונטאקט היווצרות הסינפסה חיסון. אירועים בשער כפיל הסופי (איור 1F) מנותחים. א T-cell מסמן קרינת מסכת אובייקט APC זממה נגד קרינת סמן APC במסכת אובייקט DC. כמה אירועי כפיל יש נגמ&quot;ש ו תא T בלי קשר תא-תא מופיעים בפינה השמאלית התחתונה של העלילה (תמונות לא מוצגות). שער קשר קרום מכאן ניתן להסיק כי כוללת רק כפילויות שבו T תאים ונגמ&quot;שים נמצאים בקשר. תמונות של כל אירוע השער הזה נבחנות לצורך עדות התארגנות cytoskeletal יקטין בערוץ phalloidin-FITC והוא יכול להיות מתויג באמצעות תוכנת הניתוח. הלוח השמאלי מציין אירוע סינפסה חיסוני (שכותרתו 1 והצביע על ידי כוונת ירוקה), ואילו בפנל ממני מציין אירוע מגע קרום ללא היווצרות הסינפסה חיסונית (שכותרתו 2 והצביע על ידי כוונת ירוקה). קביעת היווצרות הסינפסה דורשת בדיקה ידנית של אלהתמונות, המוצג ב B. השורה העליונה מציגה תמונות brightfield קרינת ערוץ כפיל עם סינפסה חיסונית (מתאימה לאירוע 1 א); בשורה התחתונה מציגה כפיל עם מגע קרום אבל היווצרות הסינפסה חסרה (מתאים לאירוע 2 א). הנתונים נותחו בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול והם מניסוי שפורסם בעבר 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> דוגמאות איור 3. של T-APC סינפסה גיבוש. עכברים CBA קיבל allografts לב מתורמים B6 לאחר או לא טרום טיפול (AB) או לאחר אינדוקציה סובלנות עם דם B6 כולו תחת כיסוי של נוגדנים שאינם מדלדלים אנטי CD4 ( <st<html> רונג&gt; CD). לאחר 7 ימים, הטחול CD4 + T לתאים נבדקו עבור היווצרות הסינפסה עם DCs B6. א שלוש דוגמאות של כפילויות שאינם סינפטיים עם מגע קרום מבעל חיים שאינו tolerized. B. שלוש דוגמאות של סינפסות החיסונית מבעל חיים שאינו tolerized. ג שלוש דוגמאות של כפילויות שאינם סינפטיים עם מגע קרום מבעל חיים tolerized. ד שלוש דוגמאות של סינפסות החיסונית מבעל חיים tolerized. היווצרות סינפסה מותווה על ידי נוכחות של רכס בהיר, FITC חיובי בממשק T-APC (Ch03). הנתונים נותחו בצורה עיוורת לגבי משימת טיפול והם מניסוי שפורסם בעבר 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> נוגדן / דיי </td><td> fluorochrome </td><td> עָרוּץ </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> Ch02 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, לכיל אמפירית </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> Ch06 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, לכיל אמפירית </td></tr><tr><td> phalloidin </td><td> FITC </td><td> Ch03 </td><td> .05 - 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> Ch05 </td><td> 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. נוגדנים צבעים המשמשים במחקר זה. Fluorochrome מצומדות נוגדנים, צבעים, ספקים, וכן ריכוזים מומלצים מוצגים בטבלה. תזרים הדמיה cytometer ערוץ ששימש לזהות כל fluorochrome גם מוצג בטבלה.

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד אלוראקטיביות של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה עם דימוי (imaging flow cytometry). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח באימונולוגיה של השתלות, כגון איזה חלק מתאי ה-T של המקבל מגיבים לאלו-אנטיגנים של התורם. טכניקה זו משלבת את היכולות הכמותיות הרב-פרמטריות של ציטומטריית זרימה עם יכולות ההדמיה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כדי לאפשר בדיקה בספיקה גבוהה של סינפסות בודדות בין תאי T לתאים מציגי אנטיגן.את הפרוצדורה ידגים סאג'ד מושקלג'ושה, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחילו בזריעה של 0.5×10⁶ תאי דנדריטיים לכל באר של פלטת תרבית תאים בעלת 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו 1×10⁶ תאי T, עד לנפח סופי כולל של 50 µL של מצע גידול לכל באר.דגרו את התרביות הקרות למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר נפח של פורמלהיד בריכוז 1.5% ב-PBS, בכמות השווה לשלושה מכפולות מנפח התרבית, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הקיבוע, העבירו את התאים מכל באר לשפופרת פוליסטירן תואמת בנפח 5 mL.צבע את התאים עם הנוגדנים המתאימים המשוררים לפלואורוכרום ב-100 µL של תמיסת שטיפה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור. לאחר מכן, שטוף את התאים ב-1 mL של תמיסת שטיפה והשעה מחדש את המשקעים בתמיסת perm/wash המכילה phalloidin FITC. לאחר 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר תחת הגנה מאור, שטוף את התאים ב-1 mL של תמיסת perm/wash טרייה.יש להשעות מחדש את המשקעים בתוך צבע הגרעין הרלוונטי בבופר חדירה/שטיפה (perm/wash buffer) לדגירה סופית של 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מהאור. יש לשטוף את התאים ב-1 מיליליטר של בופר חדירה/שטיפה, ולאחר מכן לבצע שטיפה אחת בבופר שטיפה בלבד. לאחר מכן, יש להשעות מחדש את התאים ב-50 עד 100 מיקרוליטרים של בופר שטיפה טרי.העבירו את התאים לשפורי מיקרוצנטריפוגה קטנים עם מכסה. כדי לנתח את האינטראקציות בין התאים, שיימו תחילה ערוץ אחד לרכישת תמונות בשדה בהיר (brightfield) והטעינו את שפור הבקרה הראשון. כאשר ערוץ השדה הבהיר כבוי, צרו בחלון סביבת העבודה תרשים פיזור (scatterplot) חדש עבור כל ערוץ שנעשה בו שימוש, המציג את יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) ביחס לשטח.בצעו גייט (Ingate) עבור הסינגלטים שבהם יחס ההיבט (aspect ratio) קרוב לאחד. עבור כל פלואורוכרום, בדקו את האוכלוסייה החיובית והתאימו את מתח הלייזר בתיבת התאורה, לפי הצורך. בתיבת הערוצים, בחרו את הערוצים המתאימים לפלואורוכרומים ששימשו לצביעה.לאחר מכן, לחצו על record. כאשר מספר האירועים יגיע לסף שנקבע, הרכישה תיעצר באופן אוטומטי. לאחר רכישת כל בקרות הצביעה הבודדת, טענו את מבחנת הדגימה הניסויית הראשונה ורכשו עשרות אלפי אירועים בערוצי הניתוח המתאימים, כולל ערוץ ה-brightfield.כדי להפיק מטריצת פיצוי, טענו את קבצי נתוני בקרת הצביעה הבודדת לאשף הפיצוי (compensation wizard) ובחרו את הערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים לניסוי. לאחר אישור שנבחרו האוכלוסיות החיוביות הנכונות, לחצו פעמיים על ערך במטריצה והוסיפו את הגרף לאזור הניתוח עבור כל ערוץ. לחצו על finish כדי לשמור את מטריצת הפיצוי כקובץ CTM.טען את קובץ ה-RIF לתוכנת הניתוח המתאימה. המר את קובץ ה-RIF לקובץ DAF לניתוח נתונים. פתח את קובץ הדגימה הראשון.שרטטו את השורש הממוצע של הריבוע (RMS) של קצב השינוי בעוצמת הדימוי בערוץ השדה הבהיר (brightfield). לאחר מכן, שרטטו את יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) אל מול השטח עבור הסמן של התא המציג אנטיגן. בצעו גייטינג (ingate) לדובלטים המכילים תא מציג אנטיגן בודד.שרטטו את יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) לעומת השטח עבור סמן תאי ה-T. בצעו סינון (gate) על הדובלטים המכילים תא T בודד. כדי לזהות תאים שנמצאים במגע זה עם זה, תחת תפריט הניתוח (analysis menu), השתמשו באפשרות המסכות (masks) כדי לפתוח את מנהל המסכות, וקראו למסכה החדשה "מסכת אובייקט תאי T" (T cell object mask).לחצו על כפתור הפונקציה ובתיבת הדו-שיח בחרו באובייקט (object). בחרו את הערוץ שבו מזוהה הסמן של תאי T ולחצו על אישור (OK). צרו באופן דומה מסכה עבור הסמן של התא המציג אנטיגן בערוץ המתאים. שרטטו את עוצמת הפלואורסצנציה של הסמן של תאי T במסכת האובייקט של התא המציג אנטיגן אל מול עוצמת הפלואורסצנציה של התא המציג אנטיגן במסכת האובייקט של תאי T.לאחר מכן, הגדירו שער (gate) הכולל רק את התאים שנמצאים במגע זה עם זה. לבסוף, בחנו ידנית את תמונות ה-phalloidin FITC של האירועים בתוך שער זה כדי להבחין בין סינפסות חיסוניות בשלות לבין מגעים פשוטים בין תאים, תוך שימוש בפונקציית סימון התמונות (tag images) כדי לסמן תמונות אלו. כאן מוצג שער מגע הממברנה עבור תאי T חיוביים ל-CD4 מהטחול, שהתקבלו משKינקירטורים שעברו טולריזציה ומכאלה שלא עברו טולריזציה של השתלות לב אלוגנאיות של B6 שבעה ימים לאחר ההשתלה, ואשר דגרו יחד עם תאים דנדריטיים המופקים ממחול השפך של B6, כפי שמוצג.כאשר האירועים הסינפטיים והבלתי-סינפטיים מסומנים באמצעות סימון צלב ירוק. ניתוחים בערוצי שדה בהיר ופלורסצנציה מאפשרים גם ויזואליזציה של האירועים הסינפטיים והבלתי-סינפטיים הבודדים. למעשה, סינפסות ממקבלים של לבבות B6 מסוג CDA, הן כאלה שלא עברו טולרנציה והן כאלה שעברו טולרנציה, ניתנות להבחנה בקלות ממגעים בלתי-סינפטיים על ידי נוכחותן של רכסים דחוסים חיוביים ל-FITC בממשק שבין תאי T לתאים מציגי אנטיגן.לאחר פיתוח נוסף, ייתכן שניתן יהיה ליישם טכניקה זו במסגרות קליניות, כגון בהפחתה או בהסרה של טיפול אימונוסופרסיבי או בניבוי תוצאות השתלה במקבלי השתלה בבני אדם.

measurement-of-t-cell-alloreactivity-using-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים...

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

סרטון זה מדגים שיטה להערכת אלורטיות באוכלוסיות מעורבות של תאי T על ידי התבוננות באינטראקציות עם תאים דנדריטיים נושאי אלואנטיגן, המובילות להיווצרות סינפסות אימונולוגיות. צביעה דיפרנציאלית וכימות של כפילים המכילים סינפסות באמצעות ציטומטריית זרימה חושפים אלורטיות של תאי T.

מדידת אלורטיאקטיביות באוכלוסייה מעורבת של תאי T

הסרטון מדגים שיטה אימונולוגית לניטור in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte או CTL production. עכבר מוזרק מראש עם לימפוציטים CD8+ T מהונדסים גנטית, מוכתמים בצבע מתרבים. הזרקה תת עורית של אובלבומין עם אדג'ובנטים מייצרת לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ T המזוהים לאחר הקציר באמצעות אימונוסטיין וציטומטריית זרימה.

טכניקה אימונולוגית לניטור יצירת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T בתיווך אדג'ובנטי

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זרימת עבודה ניסויית המאפשרת ניתוח ex vivo של גירוי תאי T אנושיים במערכת תרבית משותפת אלוגנית עם תאי גידול שטופלו מראש.

ניתוח פעילות תאי T אנושיים במסגרת תרבית משותפת אלוגנית של תאי גידול שטופלו מראש

למדו למדוד תגובתיות תאי T אלוגנית באמצעות ציטומטריית זרימה הדמייתית לחקר אימונולוגיית השתלות. שיטה זו מאפשרת ניתוח בקצב גבוה של ממשקים בין תאי T לתאים מציגי אנטיגן.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

גלה סרטונים נוספים