בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

המטרות הכלליות של פרוטוקול עיכול הכבד זה הן להעריך תתי-אוכלוסיות שונות של תאי אב של הכבד באמצעות ציטומטריית זרימה, ולבודד תאים אלו ברמת טוהר גבוהה באמצעות תערובת חדשנית של סממנים שטחייים לצורך ניתוחים המשכיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות שונות לגבי הביולוגיה של תאי אב של הכבד, לדוגמה, מהם המאפיינים הספציפיים של תתי-האוכלוסיות שלהם ומהם הגורמים העקיפים להופעתם במהלך פגיעה בכבד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של תאי אב ברמת טוהר וחיוניות גבוהה, דבר החשוב עבור ניתוחים במערכת in-vitro.

אף על פי ששיטת עיכול זו מספקת תובנות לגבי הביולוגיה של תאי פרוגניטור, ניתן למעשה להשתמש בה לבידוד של אוכלוסיות תאי המטופואטיים ותאים אנדותליאליים. כדי להכין תמיססת תאים בודדים מכבד עכבר, העבירו את האונות למנת Petri יבשה והשתמשו בסכין ניתוח כדי לחתוך את הרקמות לקוביות הומוגניות של כ-2 מילימטרים מעוקב. העבירו את החתיכות לשני מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 15 מיליליטר לכל כבד, המכילות כל אחת 2.5 מיליליטר של בופר עיכול.

הנח את הדגימות במקלח מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור עדין למשך חמש ו-10 דקות. לאחר 15 דקות של עיכול, השתמש בפיפטה של 1,000 µL עם טיפ קצוץ כדי לטריטור (titrate) בעדינות את חתיכות הכבד. לאחר מכן, החזר את המבחנות למקלח ואפשר לחתיכות לשקוע למשך שתי דקות.

בשלב הבא, סננו שתי מנות של כ-700 µL מהעלּי (supernatant) דרך מסנן של 100 מיקרון שהורטב מראש עם 800 µL של תמיסת איסוף (collection buffer). החליפו את העלּי שהוצא בתמיסת עיכול (digestion buffer) טרייה. כאשר רקמת הכבד כבר אינה נראית, העבירו את כל העלּי מ tubes העיכול דרך המסנן.

ואספו את כל התאים על ידי סנטריפוגציה. השביו את המשקעים במיליליטר אחד של בופר ליזיס של ammonium chloride potassium בטמפרטורת החדר, והפסיקו את הליזיס באמצעות חמישה מיליליטר של בופר איסוף טרי לאחר דקה אחת. אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה נוספת.

לאחר מכן, שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע הרפוי. ושחזרו את התאים בארבעה מיליליטר של בופר איסוף טרי על קרח. כדי לקבוע את מספר התאים מדגימת הכבד באמצעות ציטומטריית זרימה, ערבבו תחילה 20 microliters של תגלי התאי הכבד עם 174 microliters של PBS בתוך מבחנה פוליסטירן של 1.5 מיליליטר, ושישה מיליליטר של propidium iodine.

הוסיפו חרוזי ספירה המאפשרים כימות תאים והטעינו את תערובת החרוזים והתאים למכשיר הפלוא-סייטומטר (flow cytometer). בצעו סינון (Gate) של פיזור הצד (side scatter) לפי פרמטרי פיזור קדמי (forward-scatter) כדי למנוע הכללת פסולת. הגדירו סינון להסרת דובלטים (doublets) באמצעות השוואת גובה הפיזור הקדמי לעומת שטח הפיזור הקדמי, והסירו את התאים המתים החיוביים לפרופידיום יודיד (propidium iodine).

לאחר מכן, טענו דגימה של 30 µl לצייטומטר הזרימה (flow cytometer) והקליטו את האירועים. כדי לצבוע את תאי הכבד עבור ניתוח בצייטומטריית זרימה של תתי-אוכלוסיות תאי הפרוגניטור, העבירו מנות של 2x10^5 תאים לשפופרות תגובה של 1.5 mL. ושקיעו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

יש להשעות מחדש את המשקעים ב-Fc block לדגירה של חמש דקות על קרח. לאחר מכן, יש להוסיף 50 microliters של תערובת הנוגדנים לצביעת שטח הפנים של התאים הרלוונטית למבחנות המתאימות, לדגירה של 20 דקות על קרח תוך הגנה מאור. בתום הדגירה, יש לשטוף את הדגימות ב-400 microliters של תמיסרת צביעה לכל דגימה.

יש להשעות מחדש את המשקעים ב-100 µl של תערובת הנוגדנים המשניים המתאימה למשך 20 דקות על קרח, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים עם 400 µl נוספים של תמיסת צביעה. השעו מחדש את המשקעים ב-300 µl של תמיסת צביעה המכילה propidium iodide.

מדוד את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה. כדי להעשיר את אוכלוסיית תאי progenitor באמצעות הפרדה מבוססת מיקרו-חרוזיים מגנטיים, העבר 1.5-2x10^6 תאים למספר המתאים של מבחנות קוניות בנפח 15 מיליליטר ואסוף את התאים על ידי סנטריפוגציה. השהה מחדש את המשקעים ב-400 microliters של HBSS מועשר ב-BSA.

הוסיפו 40 µL של anti-CD31 Microbeads ו-30 µL של anti-CD45 Microbeads לדגירה של 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-5 mL של HBSS בתוספת BSA. השעו את המשקעים ב-100 µL של dead cell removal beads לדגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.

בזמן שהתאים מדגירים, יש להשריות עמודת ברירה חיובית אחת בגודל מתאים לכל כבד עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת BSA. לאחר מכן, יש להוסיף 900 מיקרוליטר של HBSS בתוספת BSA לתאים ולסנן את התאים דרך רשת סינוני פוליאמיד של 100 מיקרון. טענו את התאים המסוננים שדגרו עם חרוזים אל העמודות ואספו את התסנן (eluate) לתוך מבחנה לצנטריפוגה.

כאשר כל התאים עברו דרך העמודה, שטפו את העמודות שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת BSA. השקיפו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ותלו את משקע התאים ב-100 microliters של בופר שטיפה ו-Fc block. השגיחו משקעי תאים מארבעה עד שישה כבדים או עד פחות מ-1x10^6 תאים שנבחרו בשלילה.

לאחר חמש דקות, סמנו את התאים באמצעות נוגדן anti-GP38 ביוטיניליבי למשך 10 דקות על קרח. בסיום הדגירה, אספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה לצורך השיתה מחדש ב-400 microliters של באפר שטיפה וב-5 microliters של Anti-Biotin Microbeads. לאחר 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שטפו מיד את התאים ב-5 milliliters של באפר שטיפה.

ששעלו שוב את המשקע ב-1 ml של בופר שטיפה רענן. הניחו את התאים שנשעו שוב במגש 15 מקורר והפעילו את ההפרדה המגנטית האוטומטית. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה את הנוזל שעבר (flow-through) וששעלו שוב את המשקעים בתמיסה המתאימה לניתוח הניסויי המתוכנן בהמשך.

ביצוע Gating לתאים שאינם מביעים CD45, CD31 וקולטן asialoglycoprotein one מאפשר לבחור את תאי הפרוגניטור של הכבד, אשר ניתן לאחר מכן לקבץ לפי ביטוי glycoprotein 38 ו-CD133. התאים החיוביים ל-gp38 וחיוביים ל-CD133, והתאים השליליים ל-gp38 וחיוביים ל-CD133, מייצגים את אוכלוסיות התאים השכיחות ביותר בקרב תאים שליליים ל-CD45, CD31 ו-ASGPR1 בכבד של עכבר בוגר בריא, עם הבדלים ניכרים בביטוי של סממני שטח שונים שקושרו בעבר לתאי פרוגניטור. בידוד של תאי פרוגניטור אלה באמצעות מיקרו-חרוזי מגנט, כפי שהודגם כעת, מביא לטוהר של מעל 90% של תאי הכבד עם דרגת חיוניות גבוהה.

בעת ניסיון לבודד תאים נדירים אלה, חשוב לקחת בחשבון את האנזימים המשמשים במהלך שלבי עיכול הכבד, שכן אנזימים שונים עשויים להניב באופן מועדף תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי אב ולהפחית משמעותית את רמות הביטוי של CD133. חשוב לזכור כי טוהר התאים והניב תלויים בהכנה עדינה של תרחיפי תאי כבד בודדים. כמו כן, כמות גבוהה של פסולת תאית וזיהום של תאים גוססים עלולים להשפיע לרעה על הצלחתו של פרוטוקול זה.