ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך שלנו לייצור התקנים תלת-ממדיים מבוססי נייר, המשמשים לנו כפלטפורמה לפיתוח בדיקות אימונו-בדיקה (immunoassays) בנקודת הטיפול. שיטה זו מספקת פלטפורמה של מיקרופלואידיקה מבוססת נייר עם תהליך ייצור אמין, כך שניתן להפנות זמן ומאמץ לפיתוח הבדיקות במקום לתכנון ההתקנים. היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת להכין התקנים רבים במקביל ובכמות הרצויה עבור פרויקטים של מחקר אקדמי.

בדרך כלל, משתמשים חדשים יתקשו בשיטה זו כיוון שישנם משתנים רבים שיש להתחשב בהם בעת ייצור המכשירים, כגון יישור נכון של השכבות. טעויות עלולות להוביל למכשירים שאינם תקינים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון שקשה לדמיין את תהליך ההרכבה באמצעות הפרטים המסופקים במאמרים בלבד.

ראשית, הכינו שכבות של נייר סינון איכותי על ידי גזירה של גיליון נייר גולמי לגודל נייר סטנדרטי, כדי להקל על יצירת התבניות באמצעות מדפסת שעווה. טענו גיליון נייר גזור למגש המדפסת. לאחר מכן, הדפיסו את השכבות שתוכננו מראש.

בשלב הבא, חתכו רצועה של ממבנה ניילון לדפים באמצעות חותך נייר שולחני, תוך נקיטת זהירות רבה בטיפול בממברנת הניילון כדי לשמור על שלמותה ולהגן עליה מפני קריעה. אחסנו כל חומר שלא נעשה בו שימוש בתוך ארון דסיקטור, כיוון שממברנות ניילון רגישות ללחות. באמצעות מדפסת שעווה, הדפיסו תבנית של שכבת לכידה על דף נייר רגיל, והדביקו אותה לשולחן אור כדי שתשמש כמדריך למיקום ממבנה הניילון.

לאחר מכן, הניחו דף נייר צילום נקי על גבי דף נייר הצילום שהודפס קודם לכן. הדביקו את הדף הנקי לשולחן האור, אך אל תדביקו את שני הדפים זה לזה. כעת, הניחו פיסת ממברנת ניילון גזורה על גבי דף נייר הצילום הנקי, וודאו שהממברנה מכסה את האזור המודפס בשכבת נייר הצילום התחתונה.

הדביקו את כל ארבעת צדי ממбраסת הניילון לדף נקי של נייר צילום. הכניסו למגש ההזנה הידנית של המדפסת דף של ממברסת ניילון הנתמכת על ידי נייר הצילום המודבק אליה. לאחר מכן, הדפיסו דף ממברסת ניילון אחד בכל פעם.

הדביקו את השכבות המודפסות על מסגרת אקרילית כדי להבטיח חימום אחיד מעל ומתחת לשכבה בעת הנחתה בתנור קונבקציית כבידה. כעת, הניחו את השכבות בתנור בטמפרטורה של 150 °C למשך 30 שניות עד שהשעווה תימס לתוך עובי הנייר. לאחר הוצאת הנייר מהתנור, ודאו שהשעווה חלחלה לכל עובי הנייר על ידי הפיכתו ובדיקת העיצוב לאיתור פגמים.

הסיר את נייר הסינון ואת ממברנת הניילון מהמסגרת האקרילית. לאחר מכן, הסר את ממברנת הניילון מדף התמיכה של נייר ההעתקה באמצעות חותך נייר. גזור דפים דו-צדדיים של סרטי דבק באמצעות פלוטר חיתוך רובוטי עם קובצי עיצוב שהוכנו מראש.

לאחר מכן, הדביקו באמצעות סרט דביק שכבת נייר של תבנית שדורשת גיבוי של דבק על שולחן אור, כאשר הצד המודפס פונה כלפי מטה. קלפו צד אחד של שכבת ההגנה מדף הדבק של התבנית. הצמידו את דף הדבק של התבנית ושכבת הנייר זו לזו.

לאחר מכן, הניחו את המכשיר המורכב חלקית בתוך כיס מגן. בשלב הבא, העבירו את המבנה הדו-שכבתי שנוצר דרך מכונת למינציה אוטומטית כדי להדביק את הדבק והנייר זה לזה באופן מלא, תוך סילוק כיסי אוויר מהשכבות המחוברות. הדביקו בעזרת סרט דביק שכבת צמוד (conjugate layer) למסגרת אקרילית, כך שהאזור ההידרופילי המיועד לטיפול יהיה תלוי ולא במגע עם המסגרת.

הוסף 2.5 µL של BSA ו-1X PBS לאזור ההידרופילי בשכבת הצמידה (conjugate layer). לאחר ייבוש הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ייבש אותה ב-65 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 5 µL של ננו-חלקיקי זהב קולואידיים ב-5 OD המצומדים לנוגדן anti-beta hCG, וחזור על תהליך הייבוש.

הדביקו שכבת תעלה צדית למסגרת אקרילית כך שהאזור ההידרופילי שיוטפל יהיה תלוי ולא במגע עם המסגרת. הוסיפו 10 microliters של חומר חסום לטיפול בתעלה הצדית, ולאחר מכן חזרו על אותו תהליך ייבוש שבו נעשה שימוש עבור שכבת הצמידות. לאחר מכן, הדביקו שכבת לכידה למסגרת אקרילית כך שהאזור ההידרופילי שיוטפל יהיה תלוי ולא במגע עם המסגרת.

טפלו בשכבת הלכידה בחמישה µL של נוגדן anti-alpha hCG. לאחר ייבוש הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ייבשו אותה ב-65 °C למשך שמונה דקות. הוסיפו שני µL של חומר חסימה, ולאחר מכן חזרו על תהליך הייבוש שבוצע עבור שכבת הלכידה.

הדביקו את שכבת השטיפה למקריא האור כאשר הצד המודפס פונה כלפי מעלה. אם נעשה שימוש בחורי יישור, הסירו אותם מהשכבות הבאות באמצעות מחורר ניירות ידני. הסירו את סרט ההגנה מגב שכבת הלכידה כדי לחשוף את הדבק.

יישרו את שכבת הלכידה מעל שכבת השטיפה באמצעות חורי היישור כמדריך, ולאחר מכן הצמידו את שתי השכבות זו לזו תוך הימנעות ממגע עם האזורים ההידרופיליים כדי למזער זיהום או נזק למכשיר. לאחר מכן, הסירו את סרט המגן מגב שכבת האינקובציה כדי לחשוף את הדבק. יישרו את שכבת האינקובציה מעל שכבת הלכידה והצמידו אותן זו לזו.

המשיכו להוסיף שכבות באופן זה עד להרכבת כל השכבות הפעילות. כעת, הכניסו את המכשיר המורכב חלקית לתוך כיס הגנה והדביקו את השכבות זו לזו בחוזקה באמצעות מכונת למינציה. הסירו את סרט ההגנה מגב שכבת השטיפה והדביקו את שכבת הבלוט (blot) לתחתית המכשיר.

לאחר הלמינציה להשלמת ההרכבה של ההתקן המיקרופלואידי התלת-ממדי מנייר, גזרו את מספר ההתקנים הרצוי מגיליונות של התקנים מורכבים במלואם באמצעות מספריים. הוסיפו 20 µL של דגימת ביקורת חיובית של hCG buffer לאזור ההידרופילי בחלקו העליון של ההתקן. לאחר שהדגימה נספגה לחלוטין בתוך ההתקן, הוסיפו 15 µL של wash buffer.

לאחר שהמנה הראשונה של תמיסת השטיפה נספגה לחלוטין במכשיר, הוסיפו מנה שנייה של 15 µL של תמיסת שטיפה. כדי לחשוף את תוצאות הבדיקה, קלפו את שלוש השכבות העליונות של המכשיר באמצעות פינצטה כדי לחשוף את שכבת הלכידה. ניתן להשתמש בשיטת הדפסת שעווה ליצירת מחסומים הידרופוביים בתוך מכשירים מיקרופלואידיים מבוססי נייר, והיא מייצרת נתיבי זרימה בעלי ממדים הניתנים לשחזור, דבר החיוני לבדיקות בעלות ביצועים וזמני משך עקביים.

ביצועיו של הבדיקה החיסונית למדידת hCG מבוססת הנייר הודגמו על ידי ביצוע 35 בדיקות חיוביות ו-35 בדיקות שליליות במקביל. מקדם השונות עבור כל סט נתונים נקבע כ-1% עבור בדיקות שבוצעו באמצעות דגימות שליליות ו-3% עבור בדיקות שבוצעו באמצעות דגימות חיוביות. חוסר התאמה בין השכבות המרכיבות את תעלת האינקובציה ואת אזור הלכידה עלולה לגרום להיווצרות דפוס לא סדיר באות החיובי, דבר שעלול להוביל לפירוש שגוי של האות האיכותני.

אם השעווה אינה מודפסת בכמות מספקת או אם לא ניתן לה להמיס באופן מלא לאורך עובי הנייר, עלולה להיפגע השלמות של המחסומים ההידרופוביים שנוצרו, דבר שעלול להוביל לדליפות בתוך ההתקן. בדיקות שזמן השלמתן ארוך מהצפוי עשויות להעיד על תקלה בייצור ההתקן. התקני מיקרופלואידיקה מבוססי נייר מספקים לחוקרים פלטפורמה רב-גונית לפיתוח בדיקות אנליטיות בעלות נמוכה לנקודת הטיפול (point of care).

למרות קיומם של מספר יישומים, הגישה שאנו מדגימים כאן מניבה ארכיטקטורת מכשיר כללית לביצוע בדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassays), שהן קריטיות בתחום הבריאות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבדוק אם קיימים פגמים במהלך תהליך הייצור ולפני טיפול בשכבות באמצעות ריאגנטים ביוכימיים יקרים. לאחר רכישת מיומנות בשיטה זו, מהדפסת השכבות ועד להרכבת השכבות שעברו טיפול, ניתן להשתמש בה להכנת גיליון של בדיקות אימונו-ספציפיות תפקודיות תוך שעתיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הייצור של התקנים תלת-ממדיים מבוססי נייר, ותהיו בעלי ביטחון מספיק כדי להתאים פלטפורמה זו לסוגי בדיקות אחרים שמעניינים אתכם.