ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך שלנו לייצור מכשירים תלת מימדיים מבוססי נייר, בהם אנו משתמשים כפלטפורמה לפיתוח בדיקות אימונולוגיות בנקודת טיפול. שיטה זו מספקת פלטפורמת מיקרופלואידיקה מבוססת נייר עם תהליך ייצור אמין, כך שניתן להפנות זמן ומאמץ לפיתוח בדיקות במקום לתכנן מכשירים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא בכך שהיא מאפשרת להכין מכשירים רבים במקביל ובכמות הרצויה לפרויקטים מחקריים אקדמיים.

בדרך כלל, משתמשים חדשים יתקשו בשיטה זו מכיוון שישנם משתנים רבים שיש לקחת בחשבון בעת ייצור מכשירים, כמו יישור נכון של שכבות. טעויות עלולות לגרום למכשירים שמתקלקלים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לדמיין הרכבה באמצעות הפרטים המופיעים בכתבי יד בלבד.

ראשית, הכינו שכבות של נייר סינון איכותי על ידי חיתוך גיליון נייר לגודל נייר סטנדרטי כדי להקל על הדפוס באמצעות מדפסת שעווה. טען גיליון נייר חתוך במגש המדפסת. לאחר מכן הדפיסו שכבות שתוכננו בעבר.

לאחר מכן, חותכים שורת מלאי של קרום ניילון ליריעות באמצעות חותך נייר שולחני, תוך הקפדה רבה על טיפול בקרום הניילון כדי לשמור על שלמותו ולהגן מפני קריעה. אחסן כל חומר שאינו בשימוש בארון ייבוש, מכיוון שממברנות ניילון רגישות ללחות. בעזרת מדפסת שעווה, הדפיסו תבנית שכבת לכידה על פיסת נייר העתקה, והדביקו אותה לקופסת אור כדי לשמש כמדריך למיקום קרום הניילון.

לאחר מכן, הנח גיליון נקי של נייר צילום על גיליון נייר הצילום שהודפס קודם לכן. הדביקו את גיליון הנייר הנקי לקופסת האור, אך אל תדביקו את שני הגיליונות יחד. כעת, הנח גיליון חתוך של קרום ניילון על גיליון נייר ההעתקה, וודא שהממברנה מכסה את האזור המודפס של השכבה התחתונה של נייר העתקה.

הדביקו את כל ארבעת הצדדים של קרום הניילון לגיליון נייר הצילום הנקי. טען גיליון ממברנת ניילון הנתמך על-ידי נייר הצילום המודבק אליו לתוך מגש מדפסת ההזנה הידנית. לאחר מכן הדפס גיליון אחד של קרום ניילון בכל פעם.

הדביקו את השכבות המודפסות על מסגרת אקרילית לחימום אחיד מעל ומתחת לשכבה כאשר מכניסים אותם לתנור הסעת כוח הכבידה. כעת, הכניסו את השכבות לתנור בחום של 150 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד שהשעווה נמסה לעובי הנייר. לאחר הוצאת הנייר מהתנור, ודא שהשעווה חלחלה לעובי הנייר על ידי הפיכתו ובדיקת פגמים בעיצוב.

הסר את הנייר וקרום הניילון מהמסגרת האקרילית. לאחר מכן הסר את קרום הניילון מגיליון התמיכה של נייר הצילום באמצעות חותך נייר. דפוס יריעות דו צדדיות של סרטי דבק באמצעות פלוטר סכין רובוטי עם קבצי עיצוב שהוכנו בעבר.

לאחר מכן, הדביקו שכבת נייר דפוס שצריך לגבות בדבק על קופסת אור כשהצד המודפס כלפי מטה. קלף צד אחד של תוחם המגן מגיליון הדבק של התבנית. לחץ על גיליון הדבק ושכבת הנייר יחד.

לאחר מכן הנח את המכשיר שהורכב חלקית לתוך החלקה מגן. לאחר מכן, העבירו את מכלול שתי השכבות המתקבל דרך למינציה אוטומטית כדי ללחוץ לחלוטין את הדבק והנייר יחד, ולהסיר כיסי אוויר מהשכבות הסמוכות. הדביקו שכבה מצומדת על מסגרת אקרילית כך שהאזור ההידרופילי שיש לטפל בו מושעה ולא במגע עם המסגרת.

הוסף 2.5 מיקרוליטר BSA ו-X PBS אחד לאזור ההידרופילי בשכבה המצומדת לאחר שאפשרו לדגימה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, יבשו אותה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של חמישה ננו-חלקיקי זהב קולואידים OD מצומדים לנוגדנים נגד בטא hCG, ולאחר מכן חזור על תהליך הייבוש.

הדביקו שכבת תעלה רוחבית על מסגרת אקרילית כך שהאזור ההידרופילי שיש לטפל בו מושעה ולא במגע עם המסגרת. הוסף 10 מיקרוליטר של חומר חוסם לטיפול בתעלה הרוחבית, ולאחר מכן חזור על אותו תהליך ייבוש המשמש לשכבה המצומדת לאחר מכן, הדביקו שכבת לכידה על מסגרת אקרילית כך שהאזור ההידרופילי שיש לטפל בו מושעה ולא במגע עם המסגרת.

טפל בשכבת הלכידה בחמישה מיקרוליטרים של נוגדן אנטי-אלפא hCG. לאחר שאפשרו לדגימה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, יבשו אותה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות. הוסף שני מיקרוליטר של חומר חוסם, ולאחר מכן חזור על אותו תהליך ייבוש המשמש לשכבת הלכידה.

הדביקו את שכבת הכביסה לקופסת האור כשהצד המודפס פונה כלפי מעלה. אם נעשה שימוש בחורי יישור, הסר אותם מהשכבות הבאות באמצעות כלי ניקוב חורים כף יד. הסר את סרט המגן בגב שכבת הלכידה כדי לחשוף את הדבק.

יישר את שכבת הלכידה מעל שכבת הכביסה באמצעות חורי היישור כמדריך, ולאחר מכן לחץ את שתי השכבות יחד והימנע מלגעת באזורים ההידרופיליים כדי למזער זיהום או נזק למכשיר. לאחר מכן, הסר את סרט המגן בגב שכבת הדגירה כדי לחשוף את הדבק. יישר את שכבת הדגירה מעל שכבת הלכידה ולחץ אותם יחד.

המשיכו להוסיף שכבות באופן זה עד שכל השכבות הפעילות יורכבו. כעת, הנח את המכשיר שהורכב חלקית לתוך החלקה מגן והצמד היטב את השכבות זו לזו באמצעות למינציה. הסר את סרט המגן בגב שכבת הכביסה והצמד את שכבת הכתם לתחתית המכשיר.

לאחר למינציה להשלמת הרכבת המכשיר המיקרופלואידי התלת מימדי מבוסס הנייר, חתוך את מספר המכשירים הרצוי מגיליונות של מכשירים שהורכבו במלואם באמצעות מספריים. הוסף 20 מיקרוליטר של דגימת בקרה חיובית של מאגר hCG לאזור ההידרופילי על גבי המכשיר. לאחר שהדגימה התפתלה לחלוטין לתוך המכשיר, הוסף 15 מיקרוליטר של מאגר כביסה.

לאחר שהמנה הראשונה של מאגר הכביסה התפתלה לחלוטין לתוך המכשיר, הוסף מנה שנייה של 15 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כדי לחשוף את תוצאות הבדיקה, קלף את שלוש השכבות העליונות של המכשיר באמצעות פינצטה כדי לחשוף את שכבת הלכידה. ניתן להשתמש בשיטת הדפסת השעווה ליצירת מחסומים הידרופוביים בתוך מכשירים מיקרופלואידיים מבוססי נייר, ומייצרת מסלולים נוזליים עם ממדים הניתנים לשחזור, וזה קריטי לבדיקות עם ביצועים חוזרים וזמני משך.

הביצועים של הבדיקה החיסונית מבוססת הנייר hCG הודגמו על ידי ביצוע 35 בדיקות חיוביות ו-35 שליליות במקביל. מקדם השונות עבור כל מערך נתונים נקבע כ-1% עבור בדיקות שבוצעו באמצעות דגימות שליליות ו-3% עבור בדיקות שבוצעו באמצעות דגימות חיוביות. חוסר יישור בין השכבות המרכיבות את תעלת הדגירה ואזור הלכידה עלול לגרום להתפתחות של דפוס לא סדיר באות החיובי, מה שעלול לגרום לפרשנות שגויה של האות האיכותי.

אם השעווה אינה מודפסת בכמות מספקת או אינה מאפשרת לה להתמוסס לחלוטין דרך עובי הנייר, שלמות המחסומים ההידרופוביים המתקבלים עלולה להיפגע ולהוביל לדליפות בתוך המכשיר. בדיקות שלוקחות זמן רב מהצפוי להשלים עשויות להצביע על תקלה בייצור מכשיר. מכשירים מיקרופלואידיים מבוססי נייר מספקים לחוקרים פלטפורמה רב-תכליתית לפיתוח בדיקות אנליטיות בעלות נמוכה של נקודת טיפול.

בעוד שקיימים מספר יישומים, הגישה שאנו מדגימים כאן מביאה לארכיטקטורת מכשיר כללית לביצוע בדיקות חיסוניות, שהן קריטיות בתחום הבריאות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק אם יש פגמים במהלך תהליך הייצור ולפני טיפול בשכבות בריאגנטים ביוכימיים יקרים. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בשיטה זו, מהדפסת שכבות ועד הרכבת שכבות מטופלות, להכנת גיליון של בדיקות אימונולוגיות פונקציונליות תוך שעתיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לייצר מכשירים תלת מימדיים מבוססי נייר, ולהיות נוח מספיק כדי להתאים את הפלטפורמה הזו לסוגי בדיקה אחרים שמעניינים.