Name: Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: למד לחקור נדידת תאים יונקים באמצעות התקן מיקרו-זורם PDMS-PC המייצר מדרגות כימיות וחמצן ניצבות. שיטה זו מאפשרת מחקר מטסטזיס סרטני ובדיקות תרופות בתנאי מעבדה פשוטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מאמר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי מכוני המחקר הלאומיים לבריאות (NHRI) בטייוואן במסגרת מענק המחקר החדשני (IRG) (EX105-10523EI), משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), הפרויקט הנושאי של האקדמיה הסינית (AS-105-TP-A06), ותוכנית המחקר בננו-מדע וננוטכנולוגיה. המחברים רוצים להודות לגב' רייצ'ל א. לוקאס על הגהה של כתב היד.

<ol><li>Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+graded+tissue+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering graded tissue interfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+mechanisms+underlying+polarity+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis.</a> Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).</li>
<li>Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19019425">Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival.</a> Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).</li>
<li>Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+oxygen+microenvironment+on+the+proangiogenic+potential+of+human+endothelial+colony+forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells.</a> Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11902584">Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Allen, J. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+steady-state+oxygen+gradients+in+vitro%3A+application+to+liver+zonation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation.</a> Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).</li>
<li>McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+oxygen+concentration+enhances+the+stem-like+properties+of+CD133%2B+human+glioblastoma+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro.</a> Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).</li>
<li>Chang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polydimethylsiloxane-polycarbonate+hybrid+microfluidic+device+capable+of+generating+perpendicular+chemical+and+oxygen+gradients+for+cell+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies.</a> Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).</li>
<li>Chen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).</li>
<li>Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+culture+array+with+various+oxygen+tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions.</a> Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft Lithography.</a> Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCordeli%C3%A8res%2C+FP+%22Manual+Tracking%22">Manual Tracking</a>. , Institute Curie. Orsay, France. 
 <a target="_blank" href=" https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf"> https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf</a> (2005).</li>
<li>Asano, Y., Horn, E. <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf">Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0</a>. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. 
 <a target="_blank" href=" http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf"> http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf</a> (2013).</li>
<li>Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nitric+oxide+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+controlled+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions.</a> Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר לפברק את PDMS מכשיר microfluidic עם סרט דק PC משובץ: (1) גירוש כל הבועות בעת הכנסת סרט PC לתוך PDMS מראש פולימר תוך בודה את שכבת PDMS-PC העליונה (2) ולוודא כל PDMS ריפוי תהליכים מבוצעים על משטח אופקי מפולס היטב. בניסויי נדידת תאים, השלבים הקריטיים ביותר הם: (1) ביטול הבועות בתוך המכשיר microfluidic, צינורות, משאבות מזרק במהלך הניסויים; (2) על מנת להבטיח כי המכשיר microfluidic מושם על משטח אופקי מפולס היטב במהלך ההדמיה תא חי עבור תצפית נדידת תאים; ו (3) שמירה על מכשיר לחות על ידי הוספת DDH 2 O כדי בצלחת פטרי במהלך הניסויים ולוודא כי המים לא התייבש. כדי לפברק את PDMS-PC ההיברידי microfluidic המכשיר בהצלחה ללא delamination, חשוב להסיר את כל הבועות במהלך fi PCכניסת lm. סרט PC יכול להיות מוכנס לאט מזווית (כ -15 עד 30 מעלות מן PDMS שטח מראש פולימר) כדי למנוע דור בועות במהלך ההחדרה של סרט PC לתוך PDMS מראש הפולימר. במידת צורך, הפולימר מראש PDMS כולו עם סרט PC המוטבע יכול להיות ממוקם בתוך תא הייבוש מחובר משאבת הוואקום במשך 10 דקות כדי להרחיק את בועות לכודים. אם הסרט PC צף למעלה לאחר תהליך ואקום, קצה פיפטה ניתן להשתמש כדי ללחוץ על הסרט PC למטה על שכבת PDMS נרפא. חזור על תהליכי הוואקום ולחץ במידת צורך. עבור ניסויי התא, חוסר בועות אוויר הוא קריטי עבור תרבית תאי microfluidic. יש לוודא שאין בועות אוויר מוכנסי התקנת microfluidic כולו (כולל משאבות מזרק, צינורות, ואת מכשיר microfluidic) בעת ביצוע חיבורים. אם בועות אוויר נוצרות בתוך ההתקנה microfluidic כתוצאה מהירידה של מסיסות גז תחת הטמפרטורה הגבוהה של experiments בתוך האינקובטור, כל הרכיבים הניסוי (כולל מזרקים צינורות) ריאגנטים (כולל את מדיום הגידול, pyrogallol, ו NaOH) ניתן להציב לתוך החממה מראש (לפחות 20 דקות לפני השימוש) שמטרתן לצמצם את השוני הטמפרטורה . מזרק משאבות לעתים קרובות לייצר חום מהפעלת המנועים בתוך המשאבות. זה בדרך כלל מקובל לפעול משאבות מזרק בתוך חממות; עם זאת, לעשות לבדוק את הטמפרטורה בחממה במהלך הניסויים. אם הטמפרטורה מרוממת במהלך הניסויים, נהלי קירור נוספים צריכות להתבצע. כמה שיטות קירור ריאליות יכולות להיות מועסקות, כגון הצבת קופסא הקרח לתוך החממה, צמצום מספר משאבות מזרק להציב בתוך האינקובטור, או באמצעות באינקובטור עם מערכת קירור כוח. מכשיר תרבית תאי microfluidic PDMS-המחשב שפותח במאמר זה הוא מסוגל לייצר הדרגתי כימי וחמצן בניצב מהימן FOמחקרי נדידת תאי r. המגבלה של המכשיר שפותח היא כי פרופילי שיפוע חמצן שנוצרו תלוי האיזון בין שטף חמצן, מונע על ידי הדחת תגובה כימית, ודיפוזיה חמצן מאטמוספרת הסביבה, דרך המכשיר, ועל המדיום. כתוצאה מכך, את פרופילי שיפוע חמצן לא ניתן לשלוט באופן שרירותי בתוך המכשיר. בהשוואה לפלטפורמות תרבית תאי microfluidic קיימים, המכשיר שפותח במאמר זה הוא הראשון מסוגל לבצע מחקרי תרבית תאים תחת שילובים של הדרגתיים כימיים וחמצן. המכשיר כולו יכול להיות מפוברק באמצעות תהליך הדפוס העתק ליתוגרפיה הרך הקונבנציונלי, ללא יישור מייגע ומכשור יקר. ההדרגתיים ניתן לדמות מספרי ומאופיין ניסיוני לספק תנאי microenvironment דמוי פיסיולוגיים יותר ללימודי תאים במבחנה. באמצעות שיטת תגובה הכימית מוגבלת מרחבית עם סרט PC בתור די גזמחסום ffusion, שיפוע החמצן יכול להיוצר ללא שימוש בלוני גז דחוסים ויחידות בקרת זרימת גז מתוחכמות. בנוסף, תוכנית ההתקנה דורשת רק כמויות קטנות של כימיקלים (פחות מ -10 מ&quot;ל ליום) כדי לשמור על הדרגתיים חמצן. מאז מתח שליטת חמצן מוגבלת מקומית סביב ערוץ microfluidic, ואינה להפריע את ריכוז חמצן הסביבה, ההתקנה כולו יכולה להיות ממוקמת בתוך תרבית תאי חממה קונבנציונלית ללא טמפרטורה נוספת, לחות, ומכשור בקרה 2 CO. כתוצאה מכך, המכשיר שפותח יש פוטנציאל גדול לשמש כמעט במעבדות ביולוגיות. בשל מגבלות טכניות, התנהגויות הסלולר תחת מתחי חמצן נחקרו לעתים רחוקות בספרות הקיימת. בעזרת המכשיר שפותח במאמר זה, תרבית תאים תחת הדרגתיים חמצן יכולה להתבצע באופן קליל שמקדם מחקרי תא מאוד תחת הדרגתיים חמצן. Furthermore, עיקרון פעולה דומה ניתן ליישם כדי ליצור הדרגתיים גזי אחרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כמו פחמן דו חמצני ותחמוצת חנקן, על תרבית תאים במבחנה במחקרי 17. יכולות אלו מראות כי מכשיר microfluidic PDMS-PC מראה פוטנציאל גדול עבור יישומי תרבית תאים שונים, כוללים בדיקות סמים ובחלוקה של תאי מבחני הגירה, לקדם במחקרי תרבית תאים במבחנה.

ההתפלגות המרחבית של גורמים מסיסים מתח החמצן יכול לווסת מספר תפקודים תאיים חשובים in vivo 1, 2, 3, 4. כדי לחדד לחקור את השפיעו על תאים, פלטפורמת תרבית תאים במבחנה מסוגלת לייצר ביציבות הדרגתית כימי וחמצן היא מאוד רצויה. גורמים מסיסים שונים ממלאים תפקידים מרכזיים פעילויות ביולוגיות ולהשפיע התנהגות הסלולר. לאחרונה, בשל לקידום טכניקות microfluidic, מספר מכשירי microfluidic מסוגלים הדרגתיים כימי ליצירה ביציבות פותח כדי ללמוד תא גירה 5. יתר על כן, מספר מחקרים הראו גם את הצורך של מתח חמצן עבור בתרביות תאים במבחנה 6, 7, 8. למרות זאת,השליטה של ​​מתח חמצן עבור תרבית תאים בעיקר מסתמכת על כן כימי ישירים עבור חממות הדחה או תא חמצן עם בלוני גז בלחץ. בנוסף כימי ישיר משנה את תרבית תאים בינוניים ומשפיע על התגובות הסלולר. חממות מלאות חמצן דורשות עיצוב חממה מיוחד, בקרת זרימת גז מדויקת, כמויות גדולות של גז חנקן על מנת להשיג תנאים היפוקסיה. יתר על כן, הוא מעשי לשלוט הפריסה המרחבית של חמצן באמצעות התקנה זו, אשר מפגרת במחקר התנהגות הסלולר תחת מתחים והדרגות חמצן שונים. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מספר מכשירי microfluidic פותח כדי ליצור הדרגתיים חמצן עבור יישומי תרבית תאים 9. עם זאת, רובם מופעלים באמצעות גזים בלחץ, והדבר עלול לגרום לבעיות אידוי בועה הדור. לכן, לעתים קרובות הם דורשים מכשור מתוחכם ולא יכול להיות אמין עבור studie תרבית תאים לטווח ארוךים. כדי להתגבר על האתגרים ולהמשיך ללמוד את יחסי הגומלין בין הדרגתיים כימיים וחמצן עבור נדידת תאים, פיתחנו מכשיר תרבית תאים microfluidic עשוי polydimethylsiloxane (PDMS) עם פוליקרבונט מוטבע (PC) סרט דק 10. המכשיר מורכב משתי שכבות ערוץ microfluidic מופרדים על ידי קרום PDMS. השכבה העליונה היא שכבת PDMS-PC עבור דור שיפוע חמצן; השכבה בתחתית עשויה PDMS עבור דור שיפוע כימי תרבית תאים. המכשיר יכול בו זמנית לייצר הדרגתי כימית וחמצן בניצב ללא שימוש בלוני גז ומערכות בקרת זרימה מתוחכמות. במכשיר, PDMS מספק שקיפות אופטית גדולה, חדירות גז, תאימות ביולוגית לתרבות הדמיה תא. סרט PC מוטבע משמש כמחסום דיפוזיה גז לבקרת מתח חמצן יעיל. באפיק microfluidic, השתמשנו בסדרה של ערוץ בצורת עקלתוןים כדי ליצור הדרגתיים כימיים. העיצוב נוצל בצורה רחבה כדי ליצור הדרגתיים כימי מכשירי microfluidic עבור יישומים שונים בשל האמינות שלה ועל הגדרת ניסוי קלה. יתר על כן, את פרופילי השיפוע הכימי יכולים להיות מתוכנן על ידי שינוי גיאומטריות הערוץ מראש עם סימולציה נומרית. עבור דור שיפוע חמצן, לקחנו את היתרון של שיטת התגובה הכימית המוגבלת מרחבית אשר פותחה בעבר במעבדה שלנו 10, 11, 12. החמצן ניתן שנלקח מן השטחים המיועדים בלי הקאת חנקן. לשימוש מעשי במעבדות ביולוגיות, הגדרת הניסוי כולו תואמת חממות תרבית תאים קונבנציונליות. על ידי שילוב שיטות אלה, אנחנו יכולים בו זמנית לייצר הדרגתיים כימיים וחמצן יציב ללא בלוני גז בצובר מכשור מתוחכם כדי ללמוד נדידת תאים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ צלחת פטרי</td><td>Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane</td><td>אלפא Aesar, וורד היל, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>302118</td><td></td></tr><tr><td>4 אינץ' סיליקון דמה רקיק</td><td>וולמי טכני, טאויואן, טייוואן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>ECHO כימיקלים, מיאולי, טייוואן</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG יישור מסכה לחשיפה כפולה</td><td>M& R Nano Technology, טאויואן, טייוואן</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטימיוטית</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>מחט קהה</td><td>JensenGlobal, סנטה ברברה, קליפורניה</td><td>מד 14</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>Z359629</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>תחריט תחמוצת חוצץ</td><td>ECHO כימי, מיאולי, טייוואן</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>לסימולציה מספרית של שיפועים כימיים במכשיר</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Desicattor</td><td>A-VAC Industries, אנהיים, קליפורניה</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמה אנושית</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול (IPA)</td> <td>ECHO Chemical, Miaoli, טייוואן</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td><td>NanoEnTek, סיאול, קוריאה</td><td>DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td>תנור כנסים מכני</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, טוקיו, יפן</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>מערכת טרמנט פלזמה</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>לטיפול משטח פלזמה חמצן</td></tr><tr><td>סרט פוליקרבונט (PC)</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimehtylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogallol</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>שפכטל דבק נשלף</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Mach 1.6R צנטריפוגה שולחנית</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>ELS Technology, Hsinchu, טייוואן</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 מפתח</td><td>MicroChem, ווסטבורו, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr>נוצה<td>להב כירורגית</td><td>, אוסקה, יפן</td><td>5005093</td><td>עבור משאבת מזרק חיתוך PDMS</td></tr><tr><td></td><td>Chemyx, יוסטון, טקסס</td><td>פיוז'ן 400</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק תרבית תאים</td><td>ThermoFisher Scientific, וולת'אם, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PTFE Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, אקרון, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, אקרון, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

מאמר זה מדווח על המכשיר microfluidic עשוי polydimethylsiloxane (PDMS) עם פוליקרבונט מוטבע (PC) סרט דק ללמוד נדידת תאים תחת שילובים של הדרגתיים כימיים וחמצן. שני מילויים הכימיים וחמצן יכולים להשפיע נדידת תאים מאוד in vivo; עם זאת, עקב מגבלות טכניות, מעט מאוד מחקר שבוצע לחקור התופעות שלהם במבחנה. המכשיר שפותח במחקר זה מנצל סדרה של תעלות בצורה מתפתלות כדי ליצור ההדרגתיים הכימי הרצויה ומנצל שיטת תגובה הכימית מוגבלת מרחבית עבור דור שיפוע חמצן. הכיוונים של הדרגתיים הכימיים וחמצן הם ניצבים זה לזה כדי לאפשר פרשנות תוצאת הגירה פשוטה. על מנת לייצר הדרגתיים החמצן ביעילות עם צריכה כימית מינימאלית, הסרט הדק PC המשובץ מנוצל כמחסום דיפוזיה גז. מכשיר microfluidic פתחניתן ומונע משאבה מזרק והניח לתוך תא חממה קונבנציונלית במהלך ניסויי נדידת תאים כדי לאפשר פישוט התקנה ותנאי תרבית תאים מותאמים. בניסויי תא, השתמשנו במכשיר ללמוד הגירות של תאי אפיתל בסיס המכתשית אדם adenocarcinomic, A549, תחת שילובים הכמוקין (גורם תאים שמקורם סטרומה, SDF-1α) והדרגות חמצן. תוצאות הניסוי הראו כי המכשיר יכול ליצור הדרגתיים chemokine וחמצן בניצב ביציבות והוא תואם עם תאים. תוצאות המחקר מצביעות על כך הגירה הדרגתית חמצן עשוי לשחק תפקיד חיוני המנחה נדידת תאים, והתנהגות הסלולר תחת שילובים של הדרגתיים לא ניתן לחזות מאלה תחת הדרגתיים יחידים. המכשיר מספק כלי רב עצמה ומעשית לחוקרים ללמוד אינטראקציות בין הדרגתיים הכימיים חמצן תרבית תאים, אשר יכול לקדם מחקרי נדידת תאים טובים יותר in vivo-כמו microenvironments.

PDMS-PC מפוברק מכשיר תרבית תאים microfluidic היברידית. תאנה. 1 מציג תמונה להמחשה בלבד של מכשיר microfluidic. השכבה התחתונה מכילה ארבע רמות של תעלות בצורה מתפתלות כדי לייצר פתרונות מ ריאגנטים הציג שני פתחי כניסה מופרדים עם שישה יחסי ערבוב שונים. באופן תיאורטי, את ששת יחסי ערבוב שונים 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, ו -0: 1 (משמאל: מימין) בין שני הפתרונות הציג פתחי הכניסה. ההדרגתיים הכימי נבנה על ידי ששת פתרונות ערבוב היחס השונים יכול להיות שנוצר בתא תרבית תאים, ממוקם במורד זרם. השכבות העליונות ותחתונות מופרדות על ידי קרום PDMS. בשכבה העליונה, ריאגנטים עבור התגובה הכימית הדחת החמצן מוכנסים ערוץ microfluidic משתי צריכת אוויר נפרדת. ריאגנטים מעורבבים זה בזה על התגובה מיד לפני זורם על גבי תא תרבית תאים כדיscavenge החמצן מהערוץ התחתון, ללא קשר כימי ישיר. סרט PC המוטבע, עם מקדם דיפוזיה גז קטן יותר בהשוואת PDMS, משמש כמחסום דיפוזיה שגורם הדחת חמצן יעילה יותר. חמצן בהדרגה מפזר בחזרה לתא תרבית תאים באמצעות PDMS באזור במורד הזרם כדי ליצור שיפוע חמצן לאורך כיוון הזרימה. מאז התגובה הכימית הדחת חמצן מוגבלת מרחבית, מתחי חמצן מקומיים בלבד מושפעים. כתוצאה מכך, המכשיר יכול להיות מנוצל תא חממה קונבנציונלית ללא שינוי מתח החמצן הגלובלי שלה. בניסויי ההגירה, תאים הם זורעים בתוך חדר תרבית תאים לצורך ההשגחה. מדיום הצמיחה ריאגנטים כימי פוגשים את המכשיר באמצעות משאבות מזרק עם ספיקות לשלוט באופן מדויק. אפיון של הדרגתיים כימיים וחמצן שנוצר בתוך המכשיר. בשל tהוא למינרית לזרום אופי מיקרופלואידיקה, התנהגויות זרימת ניתן לחזות באמצעות דינמיקה fluidic חישובית סימולציה (CFD). במאמר זה, בנינו מודל 3D ובצעו הסימולציה באמצעות תוכנת מודלי multiphysics זמינה מסחרי. תאנה. 2 (א) מציג השוואה בין פרופילי ריכוז והעמסת מאופיין ניסיוני לרוחב חדר תרבית תאים בהתבסס על מדידות עוצמת קרינה ואת תוצאות הסימולציה נומרית. ההסכם בין תוצאות סימולציה והניסיוניות עולה כי מודל CFD יכול גם להעריך את הדרגתיים הכימיים שנוצרו בתוך המכשיר. תאנה. 2 (ב) מגרש שיפוע SDF-1α המדומה שנוצר בתא תרבית תאים. תאנה. 3 מציגים את תוצאות אפיון שיפוע חמצן על ידי זורם לצבוע קרינה רגישה-חמצן בתוך תא תרבית תאים לפני ניסויי התא. התוצאה מעידה כי gradi חמצןאף אוזן גרון, החל בערך 1 ל -16%, ניתן לקבוע באמצעות הפרוטוקול הנ&quot;ל. תוצאות נדידת תאים. כמו הפגנה, ביצענו מחקרים נדידת תאים A549 מתחת לגיל 4 שילובים הכמוקין (-1α SDF) והדרגות חמצן: (1) לא chemokine ולא הדרגתיים חמצן כביקורת, (2) עם שיפוע chemokine וללא שיפוע חמצן, (3) עם שיפוע חמצן וללא שיפוע chemokine, ו- (4) עם שני chemokine והדרגות חמצן. תאנה. 4 מראה את התמונה של הגדרת הניסוי כולו. הניסויים כל בוצעו בתוך תרבית תאי חממה קונבנציונלית עם ההתקנה כולה (כולל מכשירי microfluidic, משאבות מזרק, ומיקרוסקופי הדמית תא חיים) להציב בתוכו. תוצאות נדידת תאים מוצגות בתרשים. 5. תאנה. 5 (א) מציג את התמונות שנאספו במהלך הניסויים באמצעות הדמיה תא חי ana<html> Lyzer, ו איור. 5 (ב) ו- (ג) מגרשים מסלולי נדידת תאים ותנועות ממוצעים לפי ארבעה שילובים ונותחו על ידי תוכנת ImageJ עם התוספים. התוצאות מראות כי מרחק נדידת תאים הממוצע בבקרה שואף לאפס, אשר טוענת תנועה אקראית של התאים בניסוי. לעומת זאת, עם שיפוע chemokine בלבד, התנועה הממוצעת של התאים הוא פונה לצד השמאלי, שבו הריכוז-1α SDF גבוה. התוצאות מצביעות על התנהגות chemotaxis SDF-1α של תאי A549, אשר דווח בעבר. בניסוי עם מילויי חמצן בלבד, התנועה הממוצעת של התאים היא כלפי מעלה, שבו מתח החמצן נמוך. עוד מעניין, בניסוי עם מילויי chemokine וחמצן בניצב, התנועה הממוצעת של התאים היא כלפי מעלה ללא כל תנועה ברורה בכיוון האופקי (כיוון שיפוע chemokine). together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig1.jpg" /> איור 1: התקן תרבית תאים microfluidic מפוברק PDMS-PC. (א) צילום הניסיון של המכשיר המפוברק מסוגל לייצר הדרגתי כימית וחמצן בניצב מהימן ללימודי נדידת תאים. ערוץ השיפוע הכימי מלא צבעי מאכל כחולים וצהובים כדי להדגים את דור השיפוע בתוך חדר תרבית תאים. ערוץ שיפוע החמצן מלא צבע מאכל אדום. הבר קנה המידה הוא 1 ס&quot;מ. (ב) סכמטי של המכשיר microfluidic. השכבה העליונה היא מפוברקת באמצעות PDMS עם שכבת PC מוטבעת כמחסום דיפוזיה גז לבקרת שיפוע חמצן יעיל בתוך חדר תרבית תאים. (ג) תבניות ההורים עבור הייצור של שכבות העליונות ותחתונות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי</a>לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" /> איור 2: שיפוע כימי בתוך המכשיר סלולארי התרבות microfluidic. (א) מדומה מספרי ניסיוני מאופיין מפל ריכוזים והעמסה בתוך חדר תרבית תאים לרוחב חדר תרבית תאים (בכיוון Y). הדמיון בין הדרגתיים נמדדו המדומים בניסוי עולה כי הסימולציה יכולה גם לחזות את השיפוע הכימי. הבלעת האיור מציגה את המודל תלת-ממדי (3D) שנבנה הסימולציה. (ב) תוצאת סימולציה נומרית של שיפוע chemokine-1α SDF לרוחב חדר תרבית תאים ללימודי נדידת תאים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" /> איור 3: שיפוע חמצן בתוך מכשיר תרבית תאי microfluidic. ניסיוני נמדד הדרגתי חמצן בתוך תא תרבית תאים לאורך כיוון הזרימה. ההדרגתיים נאמדו באמצעות צבע פלואורסצנטי ניתוח תמונה רגיש-חמצן. הדרגתיים, משמאל לימין של החדר, מאופיינים, ואת התוצאות מראות פרופילים שיפוע עקבי לרוחב של החדר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" /> איור 4: תמונות של הגדרת הניסוי. ההתקנה כולה, כולל מכשירי microfluidic, משאבות מזרק, ו מיקרוסקופ הדמית תא חי, ממוקמת בתוך תרבית תאי חממה קונבנציונלית עבור אופטימיזציהתנאי תרבית תאים במהלך הניסויים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" /> איור 5: נדידת תאים תוצאות המחקר תחת הדרגתיים SDF-1α וחמצן בניצב. (א) תמונות שנתפסו לפני ואחרי מחקר נדידת תאי 12 שעות. שבילי נדידת תאים ניתן לנתח מתמונות הזמן שפקע שנתפסו באמצעות מיקרוסקופ הדמית תא החי. (ב) שבילי נדידת תאים ותנועת ההגירה הממוצעת נתחה מן התמונות שנתפסו תחת 4 שילובי שיפוע שונים: אין שיפוע, שיפוע chemokine בלבד, שיפוע חמצן בלבד, ושניהם הדרגתיים chemokine וחמצן. התמונות נתפסו כל 15 דק &#39;. סרגל הסולם הוא 250 מיקרומטר. (ג) מגרשים של מרחקי נדידת תאים הממוצעים (שיפוע חמצן) בניצב ואופקי (שיפוע chemokine) הוראות לפי ארבעה שילובי שיפוע שונים. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן, המתקבל שלושה סטים ניסיוני עצמאי, ו -10 תאים נותחו בכל ניסוי. הסטטיסטיות משמעותי השונות (מבחן t המזווג, p &lt;0.01) התוצאות מיועדות על ידי אותיות שונות (A ו- B). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

השליטה בשיפועים כימיים וחמצן חיונית לתרביות תאים. מאמר זה מדווח על מכשיר מיקרופלואידי-נוזלי פולידימתילסילוקסן-פוליקרבונט (PDMS-PC) המסוגל לייצר באופן אמין שילובים של שיפועים כימיים וחמצן למחקרי נדידת תאים, שניתן להשתמש בהם באופן מעשי במעבדות ביולוגיות ללא מכשור מתוחכם.

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להקים התקן מיקרופלואידי מפולידימטילסילוקסן-פוליקרבונט לבחינת הגירה של תאי יונקים תחת שילובים שונים של מדרגות ריכוז כימיות ומדרגות חמצן מאונכות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במחקרי הגירה של תאי יונקים, כולל השפעותיהן של מדרגות ריכוז אלו על הגירה של סוגים שונים של תאים או תאים בעלי גנים שונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את כל מערך הניסוי בתוך אינקובטור קונבנציונלי, כדי להבטיח תנאי תרבית תאים אופטימליים ללא צורך בהקמה מורכבת או במכשור מכביד.ההשלכות של טכניקה זו התרחבו לאבחון של יכולת גרורת תאי סרטן, שכן ניתן לאפיין את ניידות התאים ואת הגרדיאנטים השונים הקשורים פיזיולוגית באמצעות ההתקן המיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הגירה של תאי יונקים. ניתן להחיל אותה גם על מחקרי תאים אחרים, כגון בדיקות תרופות מבוססות תאים in vitro על שילובים של ריכוזי תרופה ומתחי חמצן.העבירו שני גרמים של פולידימეთילסילוקסאן, או PDMS pre-polymer, על התבנית עם תבניות התעלות הפלואידיות של השכבה העליונה כדי ליצור שכבה דקה של PDMS. לאחר מכן, הניחו את התבנית במערך דסיקטור להוצאת בועות גז מה-PDMS למשך 60 דקות. לאחר הוצאת הגזים, הניחו את התבנית למשך לילה בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius לצורך הקשיה של ה-PDMS.וודאו שהתבנית נמצאת במישור אופקי. לאחר קירור התבנית לטמפרטורת החדר, שפכו 13 גרמים נוספים של פרה-פולימר PDMS על התבנית, ולאחר מכן בצעו דגזינג (ניקוי בועות) ל-PDMS במערכת הדסיקטור למשך 60 דקות. השקיעו באיטיות סרט פוליקרבונט (PC) בעובי של מילימטר אחד לתוך שכבת ה-PDMS הטריה, שישמש כמחסום לדיפוזיית גזים.המיר את כל הבועות שנוצרו. לאחר מכן, הנח את התבנית בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius למשך לילה. וודא שהתבנית מונחת על מישור אופקי.לאחר קירור ה-PDMS המאובה לטמפרטורת החדר, חתוך את ההתקן באמצעות סקלפל לשטח של כ-5.5 על חמישה סנטימטרים רבועים שיכסה את כל תבניות התעלות. לאחר מכן, קלף את שכבת ה-PDMS מהתבנית. בשלב הבא, נקב חורים עבור הכניסות והיציאות באמצעות מחורר ביופסיה בקוטר של 2 מ"מ.אחסן את שכבת ה-PDMS-PC העליונה שיוצרה הרחק מאבק סביבתי לצורך הרכבה מאוחרת. כדי להרכיב את המכשיר, מקם תחילה את שכבת ה-PDMS-PC העליונה המיוצרת ואת הפרוסה (wafer) בעלת ממбраסת ה-PDMS שסובבה (spin-coated) בתוך מכונה לטיפול פלזמה של חמצן, כאשר משטחי ההדבקה פונים כלפי מעלה. טפל במשטחי ה-PDMS בפלזמה של חמצן בהספק של 90 watts למשך 40 שניות.הדביקו את השכבה העליונה אל ממבקר ה-PDMS מיד לאחר טיפול פני השטח בפלזמה של חמצן. הניחו משקולת על השכבות המודבקות והכניסו אותן לתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך הלילה כדי לעודד את ההדבקה. לאחר שהשכבות המודבקות התקררו לטמפרטורת החדר, חתכו בעזרת סכין מנתח את הממברנה המודבקת לשכבה העליונה לשטח של כ-5.5 על 5 סנטימטרים רבועים.קלפו את המבנה המחובר מסיליקון ונקבו חורים בכניסות וביציאות של תעלת המדרג הכימי באמצעות מחץ ביופסיה בקוטר של 2 mm. לאחר מכן, הניחו את השכבה העליונה המחוברת לממברנה ואת שכבת ה-PDMS התחתונה המיוצרת במכשיר לטיפול שטח בפלזמת חמצן, כאשר משטחי החיבור פונים כלפי מעלה. כדי להפעיל את משטחי ה-PDMS, השתמשו בפלזמה בהספק של 90 watts למשך 40 seconds.חברו את השכבות העליונה והתחתונה זו לזו להדבקה מיד לאחר הטיפול במשטח. הניחו את המשקולת על גבי המכשיר המודבק כולו והשאירו אותו למשך הלילה בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius. למחרת, הוציאו את המכשיר המיוצר כולו מהתנור והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר.התחילו את בדיקת הגירה של תאים במיקרופלואידיקה על ידי הכנת התאים במכשיר כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ביום השני, שאבו את המצע מהתאים שהותרבו מאז יום אפס ושטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של DPBS פעמיים. שאבו את ה-DPBS והוסיפו שני מיליליטר של Trypsin-EDTA, ולאחר מכן דגרו את התאים באינקובטור למשך חמש דקות כדי להפריד את התאים מפני השטח של הבקבוק.לאחר שהתאים השתחררו והם תלויים בתמיסה, הוסיפו שמונה מיליליטרים של מצע ללא סרום לבקבוק. העבירו את כל הנוזלים למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר וסובבו במערך צנטריפוגלי במהירות של 140 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, שאבו את העלייה והוסיפו כמות מתאימה של מצע ללא סרום כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של מיליון תאים למיליליטר.לאחר מכן, הוצאו את המכשיר המיקרופלואידי שהוכן ביום הראשון כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השתמשו במזרק של 1 מיליליטר עם מחט קהה במידה 14 כדי להזריק את המצע נטול הסרום דרך היציאה של תעלת המדרג הכימי, עד שהמצע זורם החוצה משתי המחטים בכניסות. לאחר מכן, הזריקו 200 µL של תרחיף התאים מהיציאה של תעלת המדרג הכימי.בחן את תא תרבית התאים במכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים הוכנסו לתעלת המיקרופלואידיקה. לאחר מכן, הנח את המכשיר בתוך מכל לח וסגור ושמור אותו באינקובטור לתרביות תאים למשך חמש שעות כדי לעודד את היצמדות התאים לפני השטח של המכשיר. במקביל, הכן את החומר הכימי בריכוז הרצוי בתוך מצע ללא סרום.שאבו את המצע ללא סרום, עם ובלי החומר הכימי, לשתי מזרקים נפרדים של 3 מיליליטר המחוברים לצינורית בעלת טוהר גבוה. לאחר מכן, הניחו את המזרקים על משאבת מזרקים בקצב זרימה של 1 µL לדקה לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הכינו 15 מיליליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד בריכוז 1M ו-15 מיליליטר של תמיסת pyrogallol בריכוז 200 mg/mL.שאבו את תמיסת הנתרן הידרוקסיד למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור PFTE ברמת טוהר גבוהה, ושאבו את תמיסת הפירגאלול למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור ברמת טוהר גבוהה. הגדירו את המזרקים על משאבת מזרקים עם קצב זרימה של five microliters per minute לשימוש מאוחר יותר. לאחר דגירה של חמש שעות, הוציאו את המכשיר כולו והניחו אותו על פטרי של 15 סנטימטר בקוטרו.קבעו את המכשיר בתוך פטריית פטרי באמצעות דבק פלסטלינה, ולאחר מכן העבירו את הפטריה למיקרוסקופ לדימוי תאים חיים הנמצא בתוך אינקובטור. חברו את הפיתולים מהמזרקים לכניסות של תעלת המדרג הכימי ליצירת המדרג הכימי. לאחר מכן, חברו את היציאה לפיתול המוביל למכל פסולת.הפעל את משאבת המזרקים עם המזרקים ליצירת מדרג כימי. לאחר מכן, חבר את צינורות הניקיון ברמה גבוהה מהמזרקים המכילים sodium chloride ו-pyrogallol לכניסות של תעלת מדרג החמצן. חבר את הצינור ליציאה כדי לאסוף את הפסולת והפעל את משאבת המזרקים עם המזרקים ליצירת מדרג חמצן.הוסיפו כ-15 milliliters של מים מזוקקים פעמיים לצ Dish פטרי כדי לשמור על המכשיר לח. לאחר מכן, הגדירו את מיקרוסקופ דימות תאי חיים לצילום במרווחי זמן (time-lapse) וצלמו תמונה בכל 15 דקות. בצעו איסוף וניתוח נתונים, וכן אפיון של גרדיאנטים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.מוצגות כאן תוצאות מייצגות של מדרגי ריכוז כימיים שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי עבור הגירה של תאים. תוצאת הסימולציה המספרית תואמת היטב את האפיון הניסיוני שבו נעשה שימוש בתמיסת פלוארסצאין כחומר הכימי. ניתן להעריך מראש גם מדרגי ריכוז של חומרים כימיים אחרים, כגון הכמוקין SDF-1 alpha, באמצעות הסימולציה.ניתן לאפיין באופן ניסיוני את מפלטי החמצן הנוצרים בתוך המכשיר באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לחמצן. בדרך כלל, ניתן להקים במכשיר מפלטי חמצן יציבים הנעים בין 1% במעלה הזרם ל-16% במורד הזרם. מוצגות כאן תמונות טימלאפס טיפוסיות שנאספו במהלך הניסויים באמצעות מיקרוסקופ לדימוי תאים חיים.לאחר ניתוח התמונה, ניתן לחשב את מסלולי הנדידה של תאי A549 ואת התנועה הממוצעת שלהם. בהיעדר מדרגות ריכוז, התאים מראים נדידה אקראית והתנועה הממוצעת קרובה לאפס. בנוכחות מדרג ריכוז של כימואטראקטין SDF-1 alpha בלבד, התאים מראים התנהגות כיmotקטית ונדים לכיוון מדרג הריכוז הגבוה של הכימואטראקטין, כצפוי.בנוכחות מפל חמצן בלבד, התאים נעים לכיוון הריכוז הנמוך של החמצן, ובכך מפגינים התנהגות אירוטקטית (aerotactic) שטרם נחקרה לעומק בתאי יונקים. באופן מעניין, בנוכחות מפלי כימוקינים וחמצן בו-זמנית, התאים נעים לעבר מפל החמצן הנמוך, דבר המעיד על כך שלמפל החמצן יש השפעה דומיננטית. תצפית זו מחייבת מחקר נוסף.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לפלס היטב את המכשיר במהלך הייצור ולהסיר בועות אוויר מהרכבת המכשיר המיקרופלואידי במהלך ניסוי נדידת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת מכשיר מיקרופלואידי מסוג PDMS-PC והקמת הניסויים לבדיקת נדידת תאי יונקים תחת שילובים של מדרגי ריכוז כימיים ומדרגי חמצן.

polydimethylsiloxane-polycarbonate-microfluidic-devices-for-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

למד לחקור נדידת תאים יונקים באמצעות התקן מיקרו-זורם PDMS-PC המייצר מדרגות כימיות וחמצן ניצבות. שיטה זו מאפשרת מחקר מטסטזיס סרטני ובדיקות תרופות בתנאי מעבדה פשוטים.

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

גלה סרטונים נוספים