Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להקים התקן מיקרופלואידי מפולידימטילסילוקסן-פוליקרבונט לבחינת הגירה של תאי יונקים תחת שילובים שונים של מדרגות ריכוז כימיות ומדרגות חמצן מאונכות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במחקרי הגירה של תאי יונקים, כולל השפעותיהן של מדרגות ריכוז אלו על הגירה של סוגים שונים של תאים או תאים בעלי גנים שונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את כל מערך הניסוי בתוך אינקובטור קונבנציונלי, כדי להבטיח תנאי תרבית תאים אופטימליים ללא צורך בהקמה מורכבת או במכשור מכביד.

ההשלכות של טכניקה זו התרחבו לאבחון של יכולת גרורת תאי סרטן, שכן ניתן לאפיין את ניידות התאים ואת הגרדיאנטים השונים הקשורים פיזיולוגית באמצעות ההתקן המיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הגירה של תאי יונקים. ניתן להחיל אותה גם על מחקרי תאים אחרים, כגון בדיקות תרופות מבוססות תאים in vitro על שילובים של ריכוזי תרופה ומתחי חמצן.

העבירו שני גרמים של פולידימეთילסילוקסאן, או PDMS pre-polymer, על התבנית עם תבניות התעלות הפלואידיות של השכבה העליונה כדי ליצור שכבה דקה של PDMS. לאחר מכן, הניחו את התבנית במערך דסיקטור להוצאת בועות גז מה-PDMS למשך 60 דקות. לאחר הוצאת הגזים, הניחו את התבנית למשך לילה בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius לצורך הקשיה של ה-PDMS.

וודאו שהתבנית נמצאת במישור אופקי. לאחר קירור התבנית לטמפרטורת החדר, שפכו 13 גרמים נוספים של פרה-פולימר PDMS על התבנית, ולאחר מכן בצעו דגזינג (ניקוי בועות) ל-PDMS במערכת הדסיקטור למשך 60 דקות. השקיעו באיטיות סרט פוליקרבונט (PC) בעובי של מילימטר אחד לתוך שכבת ה-PDMS הטריה, שישמש כמחסום לדיפוזיית גזים.

המיר את כל הבועות שנוצרו. לאחר מכן, הנח את התבנית בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius למשך לילה. וודא שהתבנית מונחת על מישור אופקי.

לאחר קירור ה-PDMS המאובה לטמפרטורת החדר, חתוך את ההתקן באמצעות סקלפל לשטח של כ-5.5 על חמישה סנטימטרים רבועים שיכסה את כל תבניות התעלות. לאחר מכן, קלף את שכבת ה-PDMS מהתבנית. בשלב הבא, נקב חורים עבור הכניסות והיציאות באמצעות מחורר ביופסיה בקוטר של 2 מ"מ.

אחסן את שכבת ה-PDMS-PC העליונה שיוצרה הרחק מאבק סביבתי לצורך הרכבה מאוחרת. כדי להרכיב את המכשיר, מקם תחילה את שכבת ה-PDMS-PC העליונה המיוצרת ואת הפרוסה (wafer) בעלת ממбраסת ה-PDMS שסובבה (spin-coated) בתוך מכונה לטיפול פלזמה של חמצן, כאשר משטחי ההדבקה פונים כלפי מעלה. טפל במשטחי ה-PDMS בפלזמה של חמצן בהספק של 90 watts למשך 40 שניות.

הדביקו את השכבה העליונה אל ממבקר ה-PDMS מיד לאחר טיפול פני השטח בפלזמה של חמצן. הניחו משקולת על השכבות המודבקות והכניסו אותן לתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך הלילה כדי לעודד את ההדבקה. לאחר שהשכבות המודבקות התקררו לטמפרטורת החדר, חתכו בעזרת סכין מנתח את הממברנה המודבקת לשכבה העליונה לשטח של כ-5.5 על 5 סנטימטרים רבועים.

קלפו את המבנה המחובר מסיליקון ונקבו חורים בכניסות וביציאות של תעלת המדרג הכימי באמצעות מחץ ביופסיה בקוטר של 2 mm. לאחר מכן, הניחו את השכבה העליונה המחוברת לממברנה ואת שכבת ה-PDMS התחתונה המיוצרת במכשיר לטיפול שטח בפלזמת חמצן, כאשר משטחי החיבור פונים כלפי מעלה. כדי להפעיל את משטחי ה-PDMS, השתמשו בפלזמה בהספק של 90 watts למשך 40 seconds.

חברו את השכבות העליונה והתחתונה זו לזו להדבקה מיד לאחר הטיפול במשטח. הניחו את המשקולת על גבי המכשיר המודבק כולו והשאירו אותו למשך הלילה בתנור בטמפרטורה של 60-degree Celsius. למחרת, הוציאו את המכשיר המיוצר כולו מהתנור והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר.

התחילו את בדיקת הגירה של תאים במיקרופלואידיקה על ידי הכנת התאים במכשיר כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ביום השני, שאבו את המצע מהתאים שהותרבו מאז יום אפס ושטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של DPBS פעמיים. שאבו את ה-DPBS והוסיפו שני מיליליטר של Trypsin-EDTA, ולאחר מכן דגרו את התאים באינקובטור למשך חמש דקות כדי להפריד את התאים מפני השטח של הבקבוק.

לאחר שהתאים השתחררו והם תלויים בתמיסה, הוסיפו שמונה מיליליטרים של מצע ללא סרום לבקבוק. העבירו את כל הנוזלים למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר וסובבו במערך צנטריפוגלי במהירות של 140 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, שאבו את העלייה והוסיפו כמות מתאימה של מצע ללא סרום כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של מיליון תאים למיליליטר.

לאחר מכן, הוצאו את המכשיר המיקרופלואידי שהוכן ביום הראשון כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השתמשו במזרק של 1 מיליליטר עם מחט קהה במידה 14 כדי להזריק את המצע נטול הסרום דרך היציאה של תעלת המדרג הכימי, עד שהמצע זורם החוצה משתי המחטים בכניסות. לאחר מכן, הזריקו 200 µL של תרחיף התאים מהיציאה של תעלת המדרג הכימי.

בחן את תא תרבית התאים במכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים הוכנסו לתעלת המיקרופלואידיקה. לאחר מכן, הנח את המכשיר בתוך מכל לח וסגור ושמור אותו באינקובטור לתרביות תאים למשך חמש שעות כדי לעודד את היצמדות התאים לפני השטח של המכשיר. במקביל, הכן את החומר הכימי בריכוז הרצוי בתוך מצע ללא סרום.

שאבו את המצע ללא סרום, עם ובלי החומר הכימי, לשתי מזרקים נפרדים של 3 מיליליטר המחוברים לצינורית בעלת טוהר גבוה. לאחר מכן, הניחו את המזרקים על משאבת מזרקים בקצב זרימה של 1 µL לדקה לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הכינו 15 מיליליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד בריכוז 1M ו-15 מיליליטר של תמיסת pyrogallol בריכוז 200 mg/mL.

שאבו את תמיסת הנתרן הידרוקסיד למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור PFTE ברמת טוהר גבוהה, ושאבו את תמיסת הפירגאלול למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור ברמת טוהר גבוהה. הגדירו את המזרקים על משאבת מזרקים עם קצב זרימה של five microliters per minute לשימוש מאוחר יותר. לאחר דגירה של חמש שעות, הוציאו את המכשיר כולו והניחו אותו על פטרי של 15 סנטימטר בקוטרו.

קבעו את המכשיר בתוך פטריית פטרי באמצעות דבק פלסטלינה, ולאחר מכן העבירו את הפטריה למיקרוסקופ לדימוי תאים חיים הנמצא בתוך אינקובטור. חברו את הפיתולים מהמזרקים לכניסות של תעלת המדרג הכימי ליצירת המדרג הכימי. לאחר מכן, חברו את היציאה לפיתול המוביל למכל פסולת.

הפעל את משאבת המזרקים עם המזרקים ליצירת מדרג כימי. לאחר מכן, חבר את צינורות הניקיון ברמה גבוהה מהמזרקים המכילים sodium chloride ו-pyrogallol לכניסות של תעלת מדרג החמצן. חבר את הצינור ליציאה כדי לאסוף את הפסולת והפעל את משאבת המזרקים עם המזרקים ליצירת מדרג חמצן.

הוסיפו כ-15 milliliters של מים מזוקקים פעמיים לצ Dish פטרי כדי לשמור על המכשיר לח. לאחר מכן, הגדירו את מיקרוסקופ דימות תאי חיים לצילום במרווחי זמן (time-lapse) וצלמו תמונה בכל 15 דקות. בצעו איסוף וניתוח נתונים, וכן אפיון של גרדיאנטים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

מוצגות כאן תוצאות מייצגות של מדרגי ריכוז כימיים שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי עבור הגירה של תאים. תוצאת הסימולציה המספרית תואמת היטב את האפיון הניסיוני שבו נעשה שימוש בתמיסת פלוארסצאין כחומר הכימי. ניתן להעריך מראש גם מדרגי ריכוז של חומרים כימיים אחרים, כגון הכמוקין SDF-1 alpha, באמצעות הסימולציה.

ניתן לאפיין באופן ניסיוני את מפלטי החמצן הנוצרים בתוך המכשיר באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לחמצן. בדרך כלל, ניתן להקים במכשיר מפלטי חמצן יציבים הנעים בין 1% במעלה הזרם ל-16% במורד הזרם. מוצגות כאן תמונות טימלאפס טיפוסיות שנאספו במהלך הניסויים באמצעות מיקרוסקופ לדימוי תאים חיים.

לאחר ניתוח התמונה, ניתן לחשב את מסלולי הנדידה של תאי A549 ואת התנועה הממוצעת שלהם. בהיעדר מדרגות ריכוז, התאים מראים נדידה אקראית והתנועה הממוצעת קרובה לאפס. בנוכחות מדרג ריכוז של כימואטראקטין SDF-1 alpha בלבד, התאים מראים התנהגות כיmotקטית ונדים לכיוון מדרג הריכוז הגבוה של הכימואטראקטין, כצפוי.

בנוכחות מפל חמצן בלבד, התאים נעים לכיוון הריכוז הנמוך של החמצן, ובכך מפגינים התנהגות אירוטקטית (aerotactic) שטרם נחקרה לעומק בתאי יונקים. באופן מעניין, בנוכחות מפלי כימוקינים וחמצן בו-זמנית, התאים נעים לעבר מפל החמצן הנמוך, דבר המעיד על כך שלמפל החמצן יש השפעה דומיננטית. תצפית זו מחייבת מחקר נוסף.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לפלס היטב את המכשיר במהלך הייצור ולהסיר בועות אוויר מהרכבת המכשיר המיקרופלואידי במהלך ניסוי נדידת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת מכשיר מיקרופלואידי מסוג PDMS-PC והקמת הניסויים לבדיקת נדידת תאי יונקים תחת שילובים של מדרגי ריכוז כימיים ומדרגי חמצן.