Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להקים מכשיר מיקרופלואידי-פוליקרבונט פולידימתילסילוקסן-פוליקרבונט לנדידת תאי יונקים תחת שילובים שונים של שיפועים כימיים וחמצן בניצב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקרי נדידת תאי יונקים, כולל ההשפעות של שיפועים אלה על נדידה של סוגים שונים של תאים או תאים עם גנים ote. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את כל מערך הניסוי בחממה קונבנציונלית לתנאי תרבית תאים אופטימליים ללא התקנה מייגעת ומכשור מגושם.

ההשלכות של טכניקה זו התרחבו לקראת אבחון יכולת גרורות של תאים סרטניים שכן ניתן לאפיין את תנועתיות התא ואת השיפועים השונים הקשורים פיזיולוגית באמצעות המכשיר המיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נדידת תאי יונקים. ניתן ליישם אותו גם במחקרי תאים אחרים כגון בדיקת תרופות מבוססות תאים במבחנה על שילובים של ריכוזי תרופות ומתחי חמצן.

העבירו שני גרם של פולידימתילסילוקסן, או PDMS קדם-פולימר על התבנית עם דפוסי התעלה הנוזלית של השכבה העליונה ליצירת שכבה דקה של PDMS. לאחר מכן, הנח את התבנית במערך ייבוש כדי להסיר את ה-PDMS למשך 60 דקות. לאחר הסרת הגז, הכניסו את התבנית למשך הלילה לתנור של 60 מעלות צלזיוס לריפוי PDMS.

וודא שהתבנית נמצאת במישור אופקי. לאחר קירור התבנית לטמפרטורת החדר, שפכו 13 גרם נוספים של קדם-פולימר PDMS על התבנית, ולאחר מכן הסירו את ה-PDMS במערך הייבוש למשך 60 דקות. הטמע באיטיות פוליקרבונט בעובי מילימטר אחד, או סרט PC לתוך שכבת ה-PDMS הטרייה כמחסום דיפוזיה של גז.

גרש את כל הבועות הקיימות. לאחר מכן, מכניסים את התבנית לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. וודאו שהתבנית נמצאת במישור אופקי.

לאחר קירור ה-PDMS הנרפא לטמפרטורת החדר, חתוך את המכשיר בעזרת אזמל לשטח של כ-5.5 על חמישה סנטימטרים רבועים שיכול לכסות את כל דפוסי הערוצים. לאחר מכן, קלף את מעבדת ה-PDMS מהתבנית. לאחר מכן, נקב חורים לכניסות ויציאות באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר שני מילימטרים.

אחסן את שכבת ה-PDMS-PC העליונה המפוברקת הרחק מאבק הסביבה להרכבה מאוחרת יותר. כדי להרכיב את המכשיר, הנח תחילה את השכבה העליונה המפוברקת PDMS-PC ואת הוופל עם קרום ה-PDMS המקודד בספין במכונה לטיפול משטח חמצן-פלזמה כשמשטחי ההדבקה פונים כלפי מעלה. טפל במשטחי ה-PDMS עם 90 וואט פלזמת חמצן למשך 40 שניות.

הצמידו את השכבה העליונה לקרום ה-PDMS מיד לאחר הטיפול במשטח פלזמת החמצן. מניחים משקולת על החלק העליון של השכבות המודבקות ומכניסים לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקדם את ההדבקה. לאחר שהשכבות המודבקות התקררו לטמפרטורת החדר, חותכים את הממברנה המודבקת לשכבה העליונה בעזרת אזמל לשטח של כ -5.5 על חמישה סנטימטרים רבועים.

קלף את המבנה המלוכד מפרוסת הסיליקון ונקב חורים בכניסות וביציאות של תעלת השיפוע הכימית באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר שני מילימטרים. לאחר מכן, הנח את השכבה העליונה מלוכדת הממברנה ואת השכבה התחתונה המפוברקת של PDMS במכונת טיפול פני השטח של פלזמת החמצן כשמשטחי ההדבקה פונים כלפי מעלה. כדי להפעיל את משטחי ה-PDMS, השתמש בפלזמה ב-90 וואט למשך 40 שניות.

חבר את השכבות העליונות והתחתונות יחד להדבקה מיד לאחר טיפול פני השטח. מניחים את המשקל על גבי כל המכשיר המודבק ומשאירים אותו למשך הלילה בתנור של 60 מעלות צלזיוס. למחרת, הוציאו את כל המכשיר המיוצר מהתנור וקררו אותו לטמפרטורת החדר.

התחל את בדיקת נדידת התאים המיקרופלואידיים על ידי הכנת התאים במכשיר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום השני, שאפו את המדיום מהתאים שגודלו מיום האפס ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר DPBS פעמיים. שאפו את ה-DPBS והוסיפו שני מיליליטר של טריפסין-EDTA, ואז דגרו על התאים באינקובטור למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים משטח הבקבוק.

לאחר ניתוק התאים ותלויים בתמיסה, הוסף לבקבוק שמונה מיליליטר של מדיום נטול סרום. מעבירים את כל הנוזלים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומצנטריפוגה אותו ב -140 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו כמות מתאימה של מדיום נטול סרום לצפיפות תאים סופית של מיליון תאים למיליליטר.

לאחר מכן, הוציאו את המכשיר המיקרופלואידי שהוכן ביום הראשון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש במזרק של מיליליטר אחד עם מחט קהה בגודל 14 כדי להזריק את המדיום נטול הסרום דרך יציאת תעלת השיפוע הכימית עד שהמדיום יזרום החוצה משתי המחטים בכניסות. לאחר מכן, הזרקו 200 מיקרוליטר של תרחיף התא מיציאת תעלת השיפוע הכימית.

התבונן בתא תרבית התאים במכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שהתאים הוכנסו לתעלה המיקרופלואידית. לאחר מכן, הנח את המכשיר בכלי לח ושמור אותו באינקובטור תרבית תאים למשך חמש שעות כדי לקדם את הידבקות התאים על פני המכשיר. בינתיים, הכינו את הכימיקל בריכוז הרצוי במדיום נטול סרום.

משוך את המדיום נטול הסרום עם ובלי הכימיקל לשני מזרקים נפרדים של שלושה מיליליטר המחוברים לצינור בעל טוהר גבוה. לאחר מכן, הגדר את המזרקים על משאבת מזרק בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הכינו 15 מיליליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת ו -15 מיליליטר של 200 מיליגרם לתמיסת פירוגלול מיליליטר.

משוך את תמיסת הנתרן הידרוקסיד למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור PFTE בעל טוהר גבוה ושאב את תמיסת הפירוגלול למזרק של 15 מיליליטר המחובר לצינור בעל טוהר גבוה. הגדר את המזרקים על משאבת מזרק בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה לשימוש מאוחר יותר. לאחר הדגירה של חמש שעות, הוציאו את המכשיר כולו והניחו אותו על צלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטר.

מקבעים את המכשיר בצלחת פטרי באמצעות שפכטל דבק, ואז מעבירים את צלחת הפטרי למיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים באינקובטור. חבר את הצינור מהמזרקים לכניסות תעלת השיפוע הכימית ליצירת השיפוע הכימי. לאחר מכן, חבר את השקע לצינור המוביל למאגר פסולת.

הפעל את משאבת המזרק עם המזרקים ליצירת שיפוע כימי. לאחר מכן, חבר את הצינורות בעלי הטוהר הגבוה מהמזרקים המכילים נתרן כלורי ופירוגלול לכניסות תעלת שיפוע החמצן. חבר את הצינור לשקע כדי לאסוף את הפסולת והפעל את משאבת המזרק עם המזרקים ליצירת שיפוע חמצן.

הוסף כ -15 מיליליטר מים מזוקקים כפולים לצלחת פטרי כדי לשמור על לחות המכשיר. לאחר מכן, הגדר את מיקרוסקופ ההדמיה של התא החי לצילום תמונה בזמן-lapse וצלם תמונה כל 15 דקות. לבצע איסוף וניתוח נתונים וכן אפיון שיפועים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצגות כאן תוצאות מייצגות של שיפועים כימיים שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי לנדידת תאים. תוצאת הסימולציה המספרית תואמת היטב את האפיון הניסיוני באמצעות תמיסת פלואורסצאין ככימיקל. ניתן גם להעריך מראש את השיפועים של כימיקלים אחרים כגון כימוקין SDF-1 אלפא באמצעות הסימולציה.

ניתן לאפיין באופן ניסיוני שיפועי חמצן הנוצרים בתוך המכשיר באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לחמצן. בדרך כלל, ניתן לקבוע ביציבות שיפועי חמצן מ-1% במעלה הזרם ל-16% במורד הזרם בתוך המכשיר. מוצגות כאן תמונות טיפוסיות עם קיטועי זמן שנאספו במהלך הניסויים באמצעות מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים.

לאחר ניתוח תמונה, ניתן לחשב את מסלולי הנדידה של תאי A549 ואת תנועותיהם הממוצעות. ללא שיפועים, התאים מראים נדידה אקראית והתנועה הממוצעת קרובה לאפס. עם שיפוע כימוקין אלפא SDF-1 בלבד, התאים מראים התנהגות כימוטקטית ונודדים לעבר כיוון שיפוע הכימוקין הגבוה כצפוי.

עם שיפוע חמצן בלבד, תאים נעים לכיוון דל חמצן ומראים התנהגות אווירוטקטית שלא נחקרה היטב עבור תאי יונקים. מעניין שעם שיפועי כימוקין וחמצן, התאים נעים לעבר שיפוע החמצן הנמוך ומראה כי לשיפוע החמצן יש השפעות דומיננטיות. תצפית זו דורשת מחקר נוסף.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ליישר היטב את המכשיר במהלך הייצור ולחסל בועות אוויר בתוך מערך המכשיר המיקרופלואידי במהלך ניסוי נדידת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין מכשיר מיקרופלואידי PDMS-PC ולהגדיר את הניסויים לחקר נדידת תאי יונקים תחת שילובים של שיפועים כימיים וחמצן.