Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התכונות החשמליות של תאים עירוריות בתנאים פיזיולוגיים לא פולשניים, תוך שימוש בעוברים של דג הזברה יחד עם GEVI מבוסס FRET. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לביולוגיה של תאים עירוריות, כגון נוירונים. לדוגמה, ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי לנתח את תפקיד העירוריות בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות.

גישה זו עושה שימוש בעוברי דג ゼברה שקופים המבטאים מדדי מתח מקודדים גנטית המבוססים על FRET. הגישה מאפשרת מדידה של התכונות החשמליות של התאים in vivo באופן לא פולשני. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי עירור של נוירונים בעמוד השדרה בעוברי דג ゼברה.

ניתן ליישם זאת גם במערכות in-vitro או in-vivo אחרות המתאימות למחקרי דימות. כדי להתחיל בהליך זה, הכין את תערובת ה-PCR להגברה של רצף הקידוד של הביו-סנסור Mermaid. חמם את תערובת ה-PCR למשך 15 שניות בטמפרטורה של 95 degrees Celsius.

בצעו פרימינג למשך 15 שניות ב-50 °C והארכה למשך ארבע דקות ב-72 °C, למשך סה"כ 35 מחזורים. לאחר מכן, בצעו טיהור בג'ל של תוצר ה-PCR הבלונט (blunt) הספציפי באמצעות ערכה מסחרית לטיהור ג'ל. לאחר מכן, שחזרו את מקטע ה-DNA לתוך וקטור pCMV-SC blunt והליניאריזרו את הפלסמיד החיובי ל-Mermaid באמצעות אנזים ההגבלה SmaI לצורך השחלה של ה-HuC promoter.

הכינו את תגובת ההגבלה בנפח כולל של 20 µL והדגרימו את התגובה בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצעו טיהור של הפלסמיד שעבר עיכול באמצעות ערכה מסחרית לטיהור ג'ל. לאחר מכן, הגבירו באמצעות PCR את הפרומוטור של HuC בעזרת PFU DNA polymerase ו-DNA גנומי של דג זברה ככתבלה.

הכינו את תערובת ה-PCR. לאחר שלב ראשוני של שתי דקות ב-95 °C, חממו את תערובת ה-PCR למשך 15 שניות ב-95 °C. בצעו היברידיזציה של הפריימרים (Priming) למשך 15 שניות ב-50 °C והאריכו את הרצף למשך ארבע דקות ב-72 °C, למשך סך הכל 35 מחזורים.

לאחר מכן, בצע טיהור בג'ל של תוצר ה-PCR blunt הספציפי. חבר כמות שומולרית שווה של pCMV-SC Mermaid ו-pHuC DNA מטוהרים, תוך שימוש ב-1 µL של T4 DNA ligase וב-1 µL של Specific 10x buffer, בנפח כולל של 10 µL. לאחר מכן, דגרי את התגובה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 °C.

בצע טרנספורמציה לאליקוט של תאים קומפטנטים באמצעות 5 µL מתגובת הליגציה. בחר את השיבוטים החיוביים ל-pHuC, שבהם הפרומוטור מושבב באוריינטציה הנכונה, באמצעות עיכול כפול של CEL1-EcoRV. העבר את השיבוטים למבחנות של 15 mL ודגור אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.

לאחר מכן, הוציאו את הפלסמיד מהתאים, הגדירו תגובת הגבלה כפולה של CEL1-EcoRV והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, הריצו את התגובות על ג'ל אגרוז. בהליך זה, העבירו את הביצים המופרות שהתקבלו מדגי zebrafish בוגרים מסוג wild type או sod1G93R לפיתרי לבית גידול של 10 מ"מ.

שטפו את העוברים במי דגים קרים. לאחר מכן, בצעו מיד מיקרו-הזרקה לחלמון עם 200 picograms של פלסמיד pHuC-Mermaid. העבירו את העוברים לפיתרי, דגשו אותם במי דגים בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עד שיגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי עבור האנליזות הבאות.

לביצוע אנליזת התכרבלות ספונטנית של הזנב, העבירו את העוברים לצלוחית פטרי עגולה בקוטר 90 מילימטר מלאה במי דגים המכילים 0.2% DMSO. בצעו דה-כוריאציה ידנית באמצעות שתי פינצטות צורפים בעלות קצוות חדים או מחטים. לאחר מכן, דגרו את העוברים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.

בעזרת מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ סטריאו, זהו את התכרבלול של הזנב בטמפרטורת החדר במהלך הקלטת וידאו של דקה אחת. לאחר מכן, רכוש את סדרת הזמנים ברזולוציית זמן של 30 פריימים לשנייה. לאחר מכן, חשב את התדירות של התכרבלולי זנב ספונטניים על ידי ספירת מספר הכיפופים ליחידת זמן.

כדי להעריך את השפעת התרופה riluzole, העבירו את העוברים לצחנה פטרי חדשה בקוטר 90 מילימטר ממלאה במי דגים המכילים five micromolar riluzole. לאחר מכן, דגרו את העוברים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 28 degrees Celsius לפני הקלטת וידאו של דקה אחת וביצוע הניתוח ההתנהגותי. כעת, קבעו את העוברים בני 20 עד 24 hpf בתוך one percent low-melting point agarose במי דגים, בתוך צלחת דימות בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

הניחו את העוברים על צדם והמתינו עד שהאגרוז יתמצק בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את צלחת הדימות לבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי. זהו את הנוירונים המוטוריים המבטאים את הביו-סנסור על ידי עירור של monomeric Umikinoko-Green באמצעות לייזר ארגון של 488 ננומטר.

לאחר מכן, הגדירו את הפליטה בין 495 ל-525 ננומטרים ולחצו על כפתור ההקלטה. למדידת FRET, עוררו את mUKG, התורם של זוג ה-FRET, באמצעות לייזר של 488 ננומטרים. בו-זמנית, השתמשו בשני מכפילים פוטוניים כדי לגלות את הפלואורסצנציה הנפלטת מהתורם ואת הפלואורסצנציה הנפלטת מהמקבל monomeric Kusibira-Orange.

בתחילת הניסוי, בצעו אופטימיזציה של ה-gain וה-offset של פוטומולטיפליקטור 1, שבו נרשמת הפלואורסצנציה של mUKG, והשאירו אותם קבועים לאורך כל הסשן. כדי לקבוע את ה-offset, שנו את צבע התמונה לערכי העוצמה באמצעות טבלת ה-Q lookup. בעת סריקה כאשר הלייזר כבוי, השתמשו במכוון ה-offset כך שפיקסלי הרקע יהיו בעוצמה הגבוהה מעט מאפס.

בעזרת אותה טבלת חיפוש (lookup table), הדלק את הלייזר. בזמן הסריקה, השתמש במכוון ההגבר (gain slider) כדי למקסם את יחס אות לרעש, תוך הקפדה להימנע מפיקסלים רוויים. בחלון הרכישה של התוכנה, בחר במצב רכישת xyt ובגודל שדה תמונה של 512 על 64 פיקסלים מתוך התפריט הנפתח.

לאחר מכן, הגדירו את הקלטת השינויים במתח של נוירוני חוט השדרה בעוברים כך שיירשם מישור XY בודד כל 30 מילישניות למשך דקה אחת. כדי להעריך את השפעת מתן riluzole על דפולריזציה של ממברנה באותו נוירון, רכשו סט נתונים חדש חמש דקות לאחר הוספה של מי דגים המכילים 5 µM riluzole. בסרטון זה תועדו התכווצויות ספונטניות (spontaneous coilings), תגובות מוטוריות המורכבות אך ורק מכיווץ של כל הגוף המביא את קצה הזנב אל הראש, בשלב של 20 עד 24 hpf במדיום דגים רגיל.

סרט זה מציג התכווצויות ספונטניות של עובר לאחר דגירה ברילוזול (riluzole) בריכוז של 5 µM. כדי לבחון האם שינויים בפעילות החשמלית של נוירוני המוטוריקה בעמוד השדרה היוו את הבסיס לשינויים בתדירות ההתכווצויות הספונטניות המושרים על ידי רילוזול, נלמד פוטנציאל הממברנה בנוירוני מוטוריקה בעמוד השדרה של העובר באופן לא פולשני לחלוטין, על ידי מדידת יחס עוצמת הפלואורסצנציה של זוג ה-FRET תורם-מקבל של הביוסנסור Mermaid. נוירוני מוטוריקה ראשוניים של עמוד השדרה המבטאים את הביוסנסור זוהו, ופעילות הדפולריזציה הספונטנית הבסיסית שלהם תועדה.

יחד עם הפחתה בתדירות תנועות התכרבללות הזנב, מתן riluzole הפחית את תדירות אירועי הדפולריזציה הספונטנית. לאחר השליטה בגישה זו, חוקרים יוכלו ללמוד את התכונות החשמליות של הרשתות העצביות שלווים שלמים, מה שמשמר באופן מלא את מורכבות האינטראקציות בין תאים במערכת התפקודית המתפתחת. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו הפעילות החשמלית של נוירוני השדרה נמצאת במתאם עם תדירות התכרבללויות הזנב הספונטניות.