Name: Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו מדידה לא פולשנית של פוטנציאל ממברנה בנוירונים מוטוריים בעוברי דג זברה באמצעות חיישן מתח מבוסס FRET. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות חשמליות של תאים במצב פיזיולוגי חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לסימונה רודיגירו על תמיכתה שלא תסולא בפז בניתוח הדמיית FRET.

1. pHuC_Mermaid דור פלסמיד הערה: בת הים היא biosensor שפותחה על ידי זיווג מתח חישה מתח (VSD) של Ciona intestinalis (עכשיו Ciona rubusta ) 5 חיישן מתח המכיל phosphatase (Ci-VSP) עם השותף FRET fluorophores Umi-Kinoko גרין (mUKG: התורם) ואת גרסה מונומריים של חלבון פלואורסצנטי פולטת כתום Kusabira Orange (mKOk: acceptor). עבור biosensor זה, שינויים קונפורמטיביים של תחום VSD, המושרה על ידי depolarization ממברנה, להגדיל את הקרבה של התורם ו acceptor פלואורסצנטי חלבונים, ובכך להגדיל את העברת האנרגיה ביניהם (הגדלת יחס FRET) 3 . ה- VSD מבטיח את לוקליזציה יעילה של biosensor על קרום הפלזמה. הביטוי העצבני של biosensor (בעמוד השדרה, האות הוא לזיהוי הן interneurons ו נוירונים המנוע) מושגת על ידי שיבוט האופרה בת היםEn מסגרת הקריאה (ORF) תחת מקדם דג הזברה פאן עצבית HuC 6 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ORF בתולת הים מ pCS4 + בת הים פלסמיד 3 עם PFU (הגהה) פולימראז דנ&quot;א באמצעות פריימר יוניברסל T3 ואת בת הים Sma אני פריימר (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) על מנת להכניס סמה אני הגבלה האתר במעלה הזרם של ORF בת הים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתערובת ה- PCR הבאה: 0.5 μL של פולימרז DNA PFu, 7.5 μL של חיץ 10x ספציפי, 1 μL של dNTPs 10 מ&quot;מ, 2.5 μL של sulfoxide דימתיל (DMSO), 0.5 μL (50 ng) של הכנה פלסמיד, ו 1 ΜL של 20 מניות מניות פתרונות של כל פריימר בהיקף כולל של 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את תערובת ה- PCR עבור 15 s ב 95 מעלות צלזיוס, הממשלה אותו 15 S ב 50 מעלות צלזיוס, ו להאריך אותו במשך 4 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של 35 מחזורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג &#39;ל לטהר את בוטה ספציפימוצר PCR באמצעות ערכת טיהור ג&#39;ל מסחרי, בעקבות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את קטע ה- DNA לתוך וקטור pCMV-SC קהה בעקבות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לינאריזציה של פלסמיד חיובי בת הים (בשם pCMV-SC_Mermaid) עם אנמה סמה אני הגבלה עבור הכניסה הבאה של האמרגן HuC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת ההגבלה כדלקמן: 0.5 μL (10 U) של אנמה הגבלה סמה אני, 2 μL של חיץ 10x קיט, ו 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד בנפח כולל של 20 μL. דגירה התגובה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1 ח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לטהר את פלסמיד מתעכל באמצעות ערכת טיהור ג&#39;ל מסחרי בעקבות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR-להגביר את האמרגן HuC (pHuC), עם פולימרז DNA Phenu דג הזברה הדנומית דג הזברה כמו בתבנית, באמצעות זוג primers ספציפיים HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ו HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ו פורש 3,150-bp במעלה הזרם של ATG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תערובת ה- PCR באמצעות ערכת הבאה: 0.5 μL של פולימראז DNA Pfu, 7.5 μL של חיץ 10x מסוים, 1 μL של dNTPs 10 מ&quot;מ, 2.5 μL של DMSO, 200 ng של DNA גנומי, ו 1 μL של 20 מיקרומטר פתרונות מלאי של כל פריימר בהיקף כולל של 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צעד ראשוני של 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, לחמם את תערובת ה- PCR עבור 15 s ב 95 מעלות צלזיוס, הממשלה אותו במשך 15 שניות ב 50 מעלות צלזיוס, ו להאריך אותו במשך 4 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של 35 מחזורים . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לטהר את המוצר PCR בוטה ספציפי באמצעות ערכת טיהור ג&#39;ל מסחרי בעקבות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשר כמות שווה של pcmv-SC_Mermaid (שלב 1.5) ואת ה- DNA pHuC (שלב 1.7) באמצעות 1 μL של ליגז DNA T4 ו 1 μL של חיץ 10X ספציפי בנפח כולל של 10 μL. דגירה התגובה עבור 16 שעות ב4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך aliquot של תאים המוסמכות עם 5 μL של התגובה קשירת (שלב 1.8) בעקבות הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שיבוטים חיובי pHuC (pHuC_Mermaid) עם היזם מוכנס בכיוון הנכון על ידי עיכול סאל I- אקו RV פעמיים (האתר סאל אני הגבלה הוכנס במעלה הזרם של מקדם שבר בשלב 1.6, בעוד Eco RV הגבלת האתר ממוקם במורד הזרם של אזור polyadenylation, PolyA, של pCMV-SC פלסמיד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת ההגבלה כדלקמן: 0.5 μL (10 U) של שניהם אני סאל אני ואנזים RV הגבלה, 2 μL של חיץ kit10X, ו 1 מיקרוגרם של ה- DNA pHuC_Mermaid בנפח כולל של 20 μL. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. הפעל את התגובות על גבי ג&#39;ל agarose. </li></ol></li></ol> 2. עוברי Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את מופרית למשלGS המתקבל wild-type (זן AB) או דג הזברה Sod1-G93R מבוגר 4 כדי צלחת 10 מ&quot;מ פטרי באמצעות פיפטה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את העוברים במים קרים (4 מעלות צלזיוס) דגים ו microinject אותם מיד חלמון עם 200 pg של pHuC_Mermaid פלסמיד באמצעות microinjector (לתיאור כולל ומפורט של הליך microinjection, ראה הפניות 7 ו - 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה פלסטיק, להעביר את העוברים לצלחת פטרי דגירה אותם במי הדגים על 28 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי (20-24 שעות לאחר ההפריה, hpf) עבור הניתוחים הבאים. </li></ol> 3. ספונטנית זנב סליל ניתוח הערה: להעריך את התנהגות זנב ספונטנית זנב ב 20-24 עוברים hpf עם או בלי riluzole התרופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העובר לצלחת פטרי 90 מ&quot;מ עגול מלא מים דגים המכילים 0.2% DMSO (רכב riluzole) ו ידנית dechorionate זה באמצעות twמלקחיים של תכשיטן עם טיפים חדים. לדגור את העובר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי הזנב פיתול ב RT במהלך הקלטה וידאו 1 דקות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על stereomicroscope. לרכוש סדרה בזמן ברזולוציה של 30 מסגרות / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תדירות של זנב ספונטנית coilings על ידי ספירת מספר bends (הן contralateral ו ipsilateral) ליחידת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה של riluzole התרופה, בעדינות להשתמש פיפטה פסטר פלסטיק להעביר את העובר לצלחת פטרי 90 מ&quot;מ חדש מלא מים דגים המכילים 5 מיקרון riluzole. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר במשך 5 דקות לפני הקלטה של ​​1 דקות וידאו וביצוע ניתוח התנהגותי כאמור. </li></ol></li></ol> 4. הדמיה ההתקנה של הדמיית Biosensor בת הים בעוברים חיים: זיהוי סימולטני של אותות התורם ו acceptor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר העוברים 20 - 24 hpf ב 1% נמוך נמס agarose נקודת במים דגים ב37 ° C בתוך 35 מ&quot;מ זכוכית בתחתית הדמיה צלחת. אוריינט את העוברים על צדם. המתן עד agarose מתקשה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את צלחת הדמיה לשלב של confocal הפוך רכוב על מיקרוסקופ הפוך. זיהוי נוירונים מוטוריים להביע את biosensor עם מטרה 20X (0.7 צמצם המספרי, NA) על ידי מרגש mUKG עם 488 ננומטר קו לייזר ארגונית הקלטה ההקלטה שלה בין 495 ו 525 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידה סריג, לעורר mUKG, התורם של זוג סריג, עם קו לייזר 488 ננומטר. במקביל לזהות, עם סורק התהודה ההפעלה ב 8,000 הרץ במצב דו כיווני, הקרינה הנפלטת על ידי התורם (בין 495 ו 525 ננומטר) ואת הקרינה הנפלטת על ידי המקבל mKOk (בין 550 ו 650 ננומטר, ערוץ סריג). אם זמין, להשתמש לייזר 473 ננומטר. הערה: יעילות העירוי של התורם תהיה קטנה במקצת (85% במקום 93% עם 488 ננומטר), אבל את עירור צולבת של acceptor יהיהיופחת גם (מ 17% עם 488 ננומטר ל 9% עם 473 ננומטר קו לייזר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית phototoxicity ו הלבנה fluorophore, למזער את הארה של המדגם על ידי הפחתת כוחו של קו לייזר (על חלון הנתיב קרן של תוכנת הרכישה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את עירור כדי להתאים רווח הפרמטרים לקזז שנקבעו בתחילת הניסוי ונשמר קבוע לאורך כל הפגישה. כדי להגדיר את ההיסט, שנה את צבע התמונה לעוצמת העוצמה (באמצעות טבלת החיפוש Q), ובזמן שסורק את הלייזר, סובב את כפתור ההיסט (אופסט חכם) כך שלפיקסלי הרקע יש מעט עוצמה גבוה מאפס. עם אותו שולחן נראה, על ידי החלפת הלייזר בזמן סריקה, להפוך את כפתור הרווח (רווח חכם) כדי למקסם את יחס אות לרעש, נזהר להימנע פיקסלים רוויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתח פתח (2 יחידות אוורירי), לרכוש תמונות 16 סיביות כדי לספק טווח דינמי מספיק quantitativE מנתח. הימנע ממוצעים כדי להגדיל את מהירות הרכישה כדי למזער photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון רכישת התוכנה, בחר גודל שדה תמונה של 512 x 64 פיקסלים (גודל פיקסל: 605 ננומטר) מהתפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ חלון מצב הרכישה, בחר xyt (זמן לשגות על מטוס Xy יחיד) f ROM את התפריט הנפתח ורשום את השינויים העובר מתח הנוירון השדרה על ידי רכישת מטוס Xy יחיד, הגדרת פרמטרים הרכישה כדי להקליט תמונה אחת בכל 30 Ms במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה של הממשל riluzole על המפולת הממברנה של נוירון אותו, לרכוש מערך נתונים חדש 5 דקות לאחר תוספת של מים דגים המכילים 5 מיקרון riluzole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח FRET, השתמש ב- BIOSensor_FRET מאקרו של ImageJ (הבעת חיישנים מסוג FRET של שרשרת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את יחס הממברנה הבסיסית של כל נוירון ב t 1 כמו ((משמעות FRET - רקע רקע) / (התורם אומר - רקע התורם)), שבו FRET ו Donאו בעוצמה הממוצעת היא עוצמת הקרינה מתכוון מחושב באותו אזור של עניין (ROI) נמשך סביב התא עבור כל ערוץ רכשה ו סריג רקע התורם היא עוצמת הקרינה מתכוון מחושב ההחזר על ההשקעה של שדה הראייה ללא מדגם פלואורסצנטי. הערה: תיאור מפורט שלב אחר שלב של השימוש בפלאגין ניתן למצוא באתר האינטרנט <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu /microscopy/resources/imagej</a> - <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">plugins</a> - <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">and</a> - <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">macros/biosensor</a> - <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">fret</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת גרפים כדי להשוות את תדירות, משרעת ומשך של קוטביות בין פרדיגמות ניסוי שונות. השווה בין שתי קבוצות באמצעות t- test של תלמיד לא מזוהה ולשקול ערכים ממוצעים כפי שונה סטטיסטית כאשר P &lt;0.05. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
<li>Chemla, S., Chavane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging%3A+Technique+review+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models.</a> J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Benedetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INaP+selective+inhibition+reverts+precocious+inter-+and+motorneurons+hyperexcitability+in+the+Sod1-G93R+zebrafish+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model.</a> Sci Rep. 6, 24515(2016).</li>
<li>Pennati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+between+larvae+of+the+Ciona+intestinalis+species+complex%3A+hints+for+a+valid+taxonomic+definition+of+distinct+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Drapeau, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12450489">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג כאן אפשר לנו לחקור את הקשר בין התכונות החשמליות של עוברי דג הזברה נוירונים מוטוריים עמוד השדרה ואת ההתנהגות סלילה ספונטנית, הפעילות הסטריאוטיפית המוקדם המוקדם ביותר, אשר מופיע סביב 17 hpf של התפתחות עובריים ונמשך עד 24 hpf 10 . הגישה שלנו מספקת לחוקרים כלי לבדיקת המערכת העצבית של העוברים השלמים, תוך שמירה מלאה על המורכבות של האינטראקציות בין תאים ברשת תפקודית מתפתחת. ההדמיה...

ב vivo ניתוח מרכיב מערכתית מאפשרת למדענים לחקור התנהגות הסלולר בצורה האמינה ביותר. הדבר נכון במיוחד כאשר הפעילות הנבדקת מושפעת במידה רבה מהאינטראקציות של תאי-התא (הן מגע והן ללא קשר), כמו במערכת העצבים, שבה שינויים בממברנה יוצרים את התקשורת בין תאים נרגשים. הבנת המידע המקודד על ידי אותות חשמליים אלה היא המפתח להבנת האופן שבו פועלת מערכת העצבים במצבים פיזיולוגיים ומחלות כאחד. על מנת ללמוד תכונות חשמליות התא בתנאים פיזיולוגיים לא פולשנית ביותר, כמה אינדיקטורים מתח מקודד גנטית פותחו לאחרונה 1 . בניגוד לדורות הקודמים של חיישני מתח אופטי (בעיקר צבעים רגישים למתח) 2 , GEVIs מאפשרים ניתוחי vivo של מערכת העצבים השלמה,הביטוי שלהם יכול להיות מוגבל סוגי תאים ספציפיים או אוכלוסיות. העובר דג הזברה הוא ב &quot;המצע&quot; vivo של בחירה כדי לנצל את הפוטנציאל הגדול המיוחס GEVIs. למעשה, הודות לבהירותה האופטית ולמערכת העצבים הפשוטה אך המשופעת שלה, מודל דג הזברה מאפשר זיהוי ומניפולציה פשוטים של כל רכיב סלולרי ברשת. ואכן, התעסוקה של FRET מבוססי בתולת הים GEVI 3 הובילה לזיהוי שינויים טרום סימפטומטיים בהתנהגות נוירון מוטורי עמוד השדרה במודל דג הזברה של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4 . להלן בפרוטוקול vivo מתאר כיצד לפקח על המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של עוברי דג הזברה שלם להביע בתולת ים בצורה ספציפית נוירונים. יתר על כן, הוא מדגים כיצד chan המושרה pharmacologicallyגזים אלה תכונות חשמליות יכול להיות קשור שינויים בתדר של עובריים ספונטנית עובריים, פעילות מוטורית סטריאוטיפית המאפיינת את התנהגות התנועה של דג הזברה בשלבים מוקדמים מאוד של פיתוח.

<table><tbody><tr><td>נקודת התכה נמוכה אגרוז&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>רילוזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu אולטרה HQ DNA פולימראז&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות - חטיבת מוצרי סטרטג'ן</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>פריימר אוניברסלי T3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Universal SmaI פריימר&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone מערכת וקטורית ביטוי יונקים / וקטור קהה pCMV-SC&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות - חטיבת מוצרי סטרטג'ן&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>סמאי&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ, צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 תוכנה&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי של אפל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(הפוך)</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק&nbsp;</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>מאקרו Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריזמה GraphPad 6.0c&nbsp;</td><td>תוכנת GraphPad, בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לאפשר לחוקרים לחקור את התקשורת התאית מבלי לשנות את שלמות הסביבה שבה נמצאים התאים. באופן ספציפי, הם פותחו כדי לנתח את הפעילות החשמלית של תאים מעוררים, כמו נוירונים בעמוד השדרה. בתרחיש כזה, חיוני לשמור על שלמות תא עמוד השדרה, אך חשוב גם לשמר את האנטומיה והצורה הפיזיולוגית של המערכות המעורבות. אכן, הבנת האופן שבו פועלת מערכת העצבים - ומערכות מורכבות אחרות - חייבת להתבסס על גישה מערכתית. מסיבה זו, עובר דג הזברה החי נבחר כמערכת מודל, ושינויי מתח קרום הנוירונים בעמוד השדרה הוערכו מבלי להפריע לתנאים הפיזיולוגיים של העוברים. 
כאן מתוארת גישה המשלבת העסקה של עוברי דג זברה עם חיישן ביולוגי מבוסס FRET. עוברי דג הזברה מאופיינים במערכת עצבים פשוטה מאוד ומתאימים במיוחד ליישומי הדמיה הודות לשקיפותם, המאפשרת שימוש במחווני מתח מבוססי פלואורסצנטיות בקרום הפלזמה במהלך התפתחות דג הזברה. הסינרגיה בין שני המרכיבים הללו מאפשרת לנתח את הפעילות החשמלית של התאים ביצורים חיים שלמים, מבלי להפריע למצב הפיזיולוגי. לבסוף, גישה לא פולשנית זו יכולה להתקיים יחד עם ניתוחים אחרים (למשל, הקלטות תנועה ספונטניות, כפי שמוצג כאן).

וקטור הביטוי נושא את קידוד ה- BIOSensor המבוסס על תרכובת ה- Mermaid ביולוגית, תחת שליטתו של האמרגן הפאן-נוירוני של ה- pHuC, המניע את הסינתזה של החלבון באופן בלעדי במערכת העצבים, נמסר לתוך ביצים מופרות של תא בודד באמצעות מיקרו- כדי לקבל עוברי מהונדס חולף ( איור 1 , לוח שמאל). לאחר מאסטרינג הטכניקה microinjection, אחוז עוברים חיובי בת הים היה קרוב ל 100%. בין אלה, רק את העוברים להביע את הכמות הנכונה של biosensor בת...

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התכונות החשמליות של תאים עירוריות בתנאים פיזיולוגיים לא פולשניים, תוך שימוש בעוברים של דג הזברה יחד עם GEVI מבוסס FRET. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לביולוגיה של תאים עירוריות, כגון נוירונים. לדוגמה, ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי לנתח את תפקיד העירוריות בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות.גישה זו עושה שימוש בעוברי דג ゼברה שקופים המבטאים מדדי מתח מקודדים גנטית המבוססים על FRET. הגישה מאפשרת מדידה של התכונות החשמליות של התאים in vivo באופן לא פולשני. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי עירור של נוירונים בעמוד השדרה בעוברי דג ゼברה.ניתן ליישם זאת גם במערכות in-vitro או in-vivo אחרות המתאימות למחקרי דימות. כדי להתחיל בהליך זה, הכין את תערובת ה-PCR להגברה של רצף הקידוד של הביו-סנסור Mermaid. חמם את תערובת ה-PCR למשך 15 שניות בטמפרטורה של 95 degrees Celsius.בצעו פרימינג למשך 15 שניות ב-50 °C והארכה למשך ארבע דקות ב-72 °C, למשך סה"כ 35 מחזורים. לאחר מכן, בצעו טיהור בג'ל של תוצר ה-PCR הבלונט (blunt) הספציפי באמצעות ערכה מסחרית לטיהור ג'ל. לאחר מכן, שחזרו את מקטע ה-DNA לתוך וקטור pCMV-SC blunt והליניאריזרו את הפלסמיד החיובי ל-Mermaid באמצעות אנזים ההגבלה SmaI לצורך השחלה של ה-HuC promoter.הכינו את תגובת ההגבלה בנפח כולל של 20 µL והדגרימו את התגובה בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצעו טיהור של הפלסמיד שעבר עיכול באמצעות ערכה מסחרית לטיהור ג'ל. לאחר מכן, הגבירו באמצעות PCR את הפרומוטור של HuC בעזרת PFU DNA polymerase ו-DNA גנומי של דג זברה ככתבלה.הכינו את תערובת ה-PCR. לאחר שלב ראשוני של שתי דקות ב-95 °C, חממו את תערובת ה-PCR למשך 15 שניות ב-95 °C. בצעו היברידיזציה של הפריימרים (Priming) למשך 15 שניות ב-50 °C והאריכו את הרצף למשך ארבע דקות ב-72 °C, למשך סך הכל 35 מחזורים.לאחר מכן, בצע טיהור בג'ל של תוצר ה-PCR blunt הספציפי. חבר כמות שומולרית שווה של pCMV-SC Mermaid ו-pHuC DNA מטוהרים, תוך שימוש ב-1 µL של T4 DNA ligase וב-1 µL של Specific 10x buffer, בנפח כולל של 10 µL. לאחר מכן, דגרי את התגובה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 °C.בצע טרנספורמציה לאליקוט של תאים קומפטנטים באמצעות 5 µL מתגובת הליגציה. בחר את השיבוטים החיוביים ל-pHuC, שבהם הפרומוטור מושבב באוריינטציה הנכונה, באמצעות עיכול כפול של CEL1-EcoRV. העבר את השיבוטים למבחנות של 15 mL ודגור אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.לאחר מכן, הוציאו את הפלסמיד מהתאים, הגדירו תגובת הגבלה כפולה של CEL1-EcoRV והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, הריצו את התגובות על ג'ל אגרוז. בהליך זה, העבירו את הביצים המופרות שהתקבלו מדגי zebrafish בוגרים מסוג wild type או sod1G93R לפיתרי לבית גידול של 10 מ"מ.שטפו את העוברים במי דגים קרים. לאחר מכן, בצעו מיד מיקרו-הזרקה לחלמון עם 200 picograms של פלסמיד pHuC-Mermaid. העבירו את העוברים לפיתרי, דגשו אותם במי דגים בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עד שיגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי עבור האנליזות הבאות.לביצוע אנליזת התכרבלות ספונטנית של הזנב, העבירו את העוברים לצלוחית פטרי עגולה בקוטר 90 מילימטר מלאה במי דגים המכילים 0.2% DMSO. בצעו דה-כוריאציה ידנית באמצעות שתי פינצטות צורפים בעלות קצוות חדים או מחטים. לאחר מכן, דגרו את העוברים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.בעזרת מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ סטריאו, זהו את התכרבלול של הזנב בטמפרטורת החדר במהלך הקלטת וידאו של דקה אחת. לאחר מכן, רכוש את סדרת הזמנים ברזולוציית זמן של 30 פריימים לשנייה. לאחר מכן, חשב את התדירות של התכרבלולי זנב ספונטניים על ידי ספירת מספר הכיפופים ליחידת זמן.כדי להעריך את השפעת התרופה riluzole, העבירו את העוברים לצחנה פטרי חדשה בקוטר 90 מילימטר ממלאה במי דגים המכילים five micromolar riluzole. לאחר מכן, דגרו את העוברים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 28 degrees Celsius לפני הקלטת וידאו של דקה אחת וביצוע הניתוח ההתנהגותי. כעת, קבעו את העוברים בני 20 עד 24 hpf בתוך one percent low-melting point agarose במי דגים, בתוך צלחת דימות בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.הניחו את העוברים על צדם והמתינו עד שהאגרוז יתמצק בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את צלחת הדימות לבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי. זהו את הנוירונים המוטוריים המבטאים את הביו-סנסור על ידי עירור של monomeric Umikinoko-Green באמצעות לייזר ארגון של 488 ננומטר.לאחר מכן, הגדירו את הפליטה בין 495 ל-525 ננומטרים ולחצו על כפתור ההקלטה. למדידת FRET, עוררו את mUKG, התורם של זוג ה-FRET, באמצעות לייזר של 488 ננומטרים. בו-זמנית, השתמשו בשני מכפילים פוטוניים כדי לגלות את הפלואורסצנציה הנפלטת מהתורם ואת הפלואורסצנציה הנפלטת מהמקבל monomeric Kusibira-Orange.בתחילת הניסוי, בצעו אופטימיזציה של ה-gain וה-offset של פוטומולטיפליקטור 1, שבו נרשמת הפלואורסצנציה של mUKG, והשאירו אותם קבועים לאורך כל הסשן. כדי לקבוע את ה-offset, שנו את צבע התמונה לערכי העוצמה באמצעות טבלת ה-Q lookup. בעת סריקה כאשר הלייזר כבוי, השתמשו במכוון ה-offset כך שפיקסלי הרקע יהיו בעוצמה הגבוהה מעט מאפס.בעזרת אותה טבלת חיפוש (lookup table), הדלק את הלייזר. בזמן הסריקה, השתמש במכוון ההגבר (gain slider) כדי למקסם את יחס אות לרעש, תוך הקפדה להימנע מפיקסלים רוויים. בחלון הרכישה של התוכנה, בחר במצב רכישת xyt ובגודל שדה תמונה של 512 על 64 פיקסלים מתוך התפריט הנפתח.לאחר מכן, הגדירו את הקלטת השינויים במתח של נוירוני חוט השדרה בעוברים כך שיירשם מישור XY בודד כל 30 מילישניות למשך דקה אחת. כדי להעריך את השפעת מתן riluzole על דפולריזציה של ממברנה באותו נוירון, רכשו סט נתונים חדש חמש דקות לאחר הוספה של מי דגים המכילים 5 µM riluzole. בסרטון זה תועדו התכווצויות ספונטניות (spontaneous coilings), תגובות מוטוריות המורכבות אך ורק מכיווץ של כל הגוף המביא את קצה הזנב אל הראש, בשלב של 20 עד 24 hpf במדיום דגים רגיל.סרט זה מציג התכווצויות ספונטניות של עובר לאחר דגירה ברילוזול (riluzole) בריכוז של 5 µM. כדי לבחון האם שינויים בפעילות החשמלית של נוירוני המוטוריקה בעמוד השדרה היוו את הבסיס לשינויים בתדירות ההתכווצויות הספונטניות המושרים על ידי רילוזול, נלמד פוטנציאל הממברנה בנוירוני מוטוריקה בעמוד השדרה של העובר באופן לא פולשני לחלוטין, על ידי מדידת יחס עוצמת הפלואורסצנציה של זוג ה-FRET תורם-מקבל של הביוסנסור Mermaid. נוירוני מוטוריקה ראשוניים של עמוד השדרה המבטאים את הביוסנסור זוהו, ופעילות הדפולריזציה הספונטנית הבסיסית שלהם תועדה.יחד עם הפחתה בתדירות תנועות התכרבללות הזנב, מתן riluzole הפחית את תדירות אירועי הדפולריזציה הספונטנית. לאחר השליטה בגישה זו, חוקרים יוכלו ללמוד את התכונות החשמליות של הרשתות העצביות שלווים שלמים, מה שמשמר באופן מלא את מורכבות האינטראקציות בין תאים במערכת התפקודית המתפתחת. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו הפעילות החשמלית של נוירוני השדרה נמצאת במתאם עם תדירות התכרבללויות הזנב הספונטניות.

biosensing-motor-neuron-membrane-potential-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

סרטון זה מתאר טכניקות אופטוגנטיות על ידי הפעלת נוירונים סומטוסנסוריים מהונדסים גנטית ורישום תגובה התנהגותית מעוררת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

Optogenetics של דגי זברה: הפעלת נוירון סומטוסנסורי מהונדס גנטית לחקר תגובות התנהגותיות של זחלים

סרטון זה מדגים בדיקה לא פולשנית לחקר אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה. עם מדידת סליל הזנב בעוברים כתוצאה מדפולריזציה ספונטנית של הנוירונים המוטוריים של חוט השדרה, מוחל חוסם תעלות נתרן כדי להפחית את תדירות הסליל. לאחר מכן, העוברים משותקים באגרוז ומונחים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנוירונים המוטוריים המהונדסים גנטית מבטאים ביו-חיישן חישת מתח עם תורם ופלואורופור מקבל. ירידה בפליטה פלואורופורית מקבלת מצביעה על ירידה בדפולריזציה הספונטנית של נוירונים מוטוריים עקב חוסם תעלות...

גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

הצומת העצבי-שרירי של זחל דג הזברה הוא מודל אטרקטיבי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית. הוא מתאים לטכניקות ניסיוניות רבות, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה אופטית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיית שידור סינפטי באמצעות בדיקה מבוססת pHluorin תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

למדו מדידה לא פולשנית של פוטנציאל ממברנה בנוירונים מוטוריים בעוברי דג זברה באמצעות חיישן מתח מבוסס FRET. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות חשמליות של תאים במצב פיזיולוגי חי.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

גלה סרטונים נוספים