Name: באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו שיטות לשליטה במשטחים מתוכנתים באמצעות E. coli מהונדסת גנטית. טכניקות שילוב שינוי גנטי ופונקציונליזציה של משטחים מאפשרות יצירת חיישנים דינמיים ליישומים רפואיים וסביבתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים בתודה להכיר תמיכה בפרס FA9550-13-1-0108 מלשכת חיל האוויר של המחקר המדעי של ארה&quot;ב. המחברים גם מכירים תמיכה מן הפרס N00014-15-1-2502 מן משרד המחקר של הצי של ארה&quot;ב, מימון מהמכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי במכון הפוליטכני וירג&#39;יניה סטייט, ומן מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע אחוות תוכנית, מספר הפרסים 1,607,310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הצגנו אסטרטגיה חדשה עבור התממשקות תאים מהונדסים חיים עם משטח חומר פונקציונלי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח קו תא מסוגל לסנתז רמות גבוהות של ביוטין כאשר מושרה עם IPTG. הרמות הגבוהות של ביוטין יכולות לשמש כדי לשנות את פני השטח הפונקציונליים. הפרוטוקולים המפורטים כיצד להנדס את שורת תאי E. coli וכיצד ליצור שני משטחים פונקציונליים שונים. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה להתרחש לאורך כל הבנייה של הקו הסלולרי המהונדס. כ...

כאן אנו מדווחים בנהלי פיתוח מצע לתכנות מסוגל להגיב אות כימית מן קו תא מהונדס. 1 אנו עושים זאת על ידי יצירת ממשק streptavidin ביוטין שמגיב ביוטין מיוצר על ידי coli Escherichia המהונדס סינטטי (E. coli) תאים. בעבר, משטחים לתכנות כבר מהונדסים עבור מגוון רחב של יישומים מ זיהוי הרעלן 2 ונקודה של טיפול אבחון 3 עד הגנה וביטחון. 4 בעוד משטחים לתכנות יכולים להיות שימושיים כמו חיישנים ומפעיל, הם יכולים להיעשות &quot;חכמים&quot; על ידי להנחיל להם את היכולת להסתגל לאתגרים סביבתיים שונים. לעומת זאת, אפילו מיקרואורגניזמים פשוטים, כגון E. coli, יש הסתגלות טמונה ומסוגלים להגיב לאתגרים עם פתרונות מתוחכמים ולעתים קרובות בלתי צפויים. הסתגלות זו אפשרה E.אוכלוסיות coli, בשליטת רשתות גנים המורכבים שלהן, חסכונית לחפש משאבים, 5 ליצור מוצרים בעלי ערך מוסף, 6 ואפילו רובוטיקה כוח בקנה מידה מיקרו. 7 על ידי צימוד היתרונות אדפטיבית של תאי חיים עם שימוש משטחים לתכנות, נוכל ליצור מצע חכם מסוגל להגיב לתנאי סביבה שונים. ביולוגיה סינתטית נתן החוקרים יכולות חדשות כדי לתכנת את ההתנהגות של היצורים החיים. באמצעות הנדסה לתאים להכיל רשתות רגולטוריות גן חדש, חוקרים יכולים לעצב תאים כי תערוכה מגוונת של התנהגויות מתוכנות. 8, 9 מעבר מחקר בסיסי, התנהגויות אלו עשויות לשמש ליישומים כגון שליטת הרכבת חומר ביולוגי לייצר מוצרים בעלי ערך מוסף. 10 בזאת, אנו בפירוט כיצד השתמשנו בכלים של ביולוגיה סינתטית כדי engineer זן החיידק כי מסנתז ביוטין על אינדוקציה. זן זה פותח באמצעות שיטות שיבוט אנזים הגבלה להרכיב פלסמיד, pKE1-לאצי-bioB. פלסמיד זה, כאשר הפך K-12 זן E. coli MG1655, מעניק לתאים עם יכולת להביע רמות גבוהות של bioB, אנזים חיוני לסינתזת ביוטין. כאשר תאים שהשתנו היו מושרים עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ובתנאי עם מבשר ביוטין, desthiobiotin (DTB), רמות גבוהות של ביוטין יוצרו. האינטראקציה המחייבת של ביוטין עם streptavidin היא אחת איגרות החוב הלא-קוולנטיים החזקים המצויים בטבע. ככזה, האינטראקציה streptavidin ביוטין הוא גם היטב מאופיין והעסיק מאוד בביוטכנולוגיה. 11 בתוך כתב היד הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות העסקת אינטראקצית streptavidin ביוטין לחוש ולזהות ביוטין בייצור תאים עם משטח פונקציונלי. אָנוּמתייחסים משטחים מנוגדים אלה תוכניות שליטה &quot;עקיפה&quot; ו &quot;ישירה&quot;. בתכנית השליטה העקיפה, ביוטין-מיוצר תא מתחרה עם ביוטין כי כבר מצומדות ו משותק על משטח קלקר streptavidin אתרי קישור. בנוסף, streptavidin הוא מצומדות עם peroxidase חזרת (HRP). HRP משנה 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), להפקת אותות אופטיים, 12 אשר עשוי להיות במעקב על ידי לכימות ספיגת ספקטרלי (כלומר, צפיפות אופטית) ב -450 ננומטר (OD 450). לפיכך, את ערכת השליטה העקיפה מאפשרת לחוקרים למדוד ביוטין בייצור תאים על ידי ניטור attentuation של אות OD 450. ערכת השליטה הישירה מנצלת את האירוע ביוטין-streptavidin על ידי streptavidin משתק ישירות משטח חומר ומאפשר ביוטין תא-פיק biotinylated HRP להתחרות על streptavidin אתרי קישור. שוב,רמות יחסיות של ביוטין בייצור התאים מנוטר על ידי מדידת אות OD 450. יחדיו, התאים המהונדסים משטחים פונקציונליים מאפשרים לנו לשלוט על התכונות של משטח לתכנות על ידי גרימת רשתות בתאים חיים. במילים אחרות, יצרנו מערכת שמנצלת את יכולת ההתאמה של היצורים החיים ואת אמינות מפרט של ממשק חומר מהונדס ידי קישור המערכות הללו יחד.

<table><tbody><tr><td>מרק LB, מילר&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, מלחים מינימליים, 5x</td> חומצות קסמינו <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי, נטול מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי, דיהידראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז (D-גלוקוז), פישר סיינטיפיק נטול מים</td><td></td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB טורבו קו תאי ניו</td><td>אינגלנד ביולאבס</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד פריימרים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>N/A</td><td>25N, טיהור DSL</td></tr><tr><td>Q5 פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 מאגר תגובה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום Bromide, 1%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>ערכות מיצוי ג'ל</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase מאגר תגובה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle חרוזי ציפוי זכוכית&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>סוקסינימידיל 3-(2-פירידילדיטיו) פרופיונאט (SPDP)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-ביוטין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), תמיסה 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>טווין 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 רכזים צנטריפוגליים&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט,</td><td>נטול מים Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות פוליסטירן</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

פתחנו ממשק אביוטי-ביוטיים המאפשר תאים מהונדסים לשלוט בתכונות החומר של משטח פונקציונלי. מערכת זו נעשית על ידי יצירת שני מודולים: זן מהונדס סינטטי של תאי חיידק וממשק חומר פונקציונלי. בתוך נייר זה, אנו פרטנו פרוטוקול עבור גנטית הנדסת התנהגויות נבחרות בתוך זן של חיידק באמצעות אסטרטגיות שיבוט מולקולריות. לאחר שפותח, זן זה מייצר רמות גבוהות של ביוטין כאשר הם נחשפים inducer כימי. בנוסף, אנו פרוטוקולי פרט ליצירת שני משטחים פונקציונליים שונים, שכל אחת מהן מסוגלת להגיב ביוטין תא-מסונתז. יחדיו, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה צמודה, מערכת אביוטי-ביוטיים המאפשר מהונדסת תאים לשלוט רכב חומר והרכבה על מצעים דוממים.

תוצאות נציגים מוצגות חמש דמויות המצורפות. ראשית, אנו מציגים את תהליך השיבוט גרפי (איור 1), כך שהקורא יכול חזותי בצע את השלבים הקריטיים ליצירת זן החיידק המהונדס הסינטטי. על מנת לאפיין את הדינמיקה באוכלוסייה של התאים, אנו מספקים עקומת צמיחה (איור 2) שנוצרה על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של האוכלוסייה. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לרשת גן בקרה מאומתת, באמצעות mCherry כמדד bioB</...

מאמר זה מציג סדרה של פרוטוקולים לפיתוח תאים מהונדסים ומשטחים פונקציונליים המאפשרים מהונדס חיידק סינטטי לשלוט ולטפל משטחי חומר לתכנות.

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

המטרה הכוללת של פרוצדורות אלו היא להשתמש בחיידקי E.coli מהונדסים סינתטית כדי לשלוט במשטחי חומרים ניתנים לתכנות ולmanipulating אותם, באמצעות שילוב של אסטרטגיות של מודיפיקציה גנטית ופונקציונליזציה של פני השטח. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומים כגון רפואה מולקולרית וניטור סביבתי. על ידי שימוש בתאים מתכנתים גנטית כדי לפרש סביבה מקומית ולשנות חומר פונקציונלי בהתאם, אנו מספקים כלי מודולרי למגוון רחב של יישומים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאים חיים מסוגלים לשמש כחיישנים דינמיים המסוגלים לקרוא, לעבד ולהקליט את התנאים סביבם באמצעות ממשקים פונקציונליים. לאחר הכנת התמיסות ואיסוף העליון (supernatant) העשיר בביוטין מ-E.coli מייצרת ביוטין בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף 1.4 µL של תמיסת SPDP ל-20 µL של סטריפטאבידין או תמיסת SA. יש לעטוף את המבחנה בנייר אלומיניום ולהדגיר אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי כדי לאפשר למקשר (cross linker) SPDP להיקשר ל-SA באמצעות קבוצת אמינו, ובכך ליצור SA מופעל ב-pyridyldithio. לאחר ההדגרה, יש להוסיף 2.4 µL של תמיסת DTT למבחנה ולהדגיר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר פיצול של pyridine-2-thione, התוצאה היא SA מופעל בסולפיהידריל. לאחר מכן, יש להוסיף 7.5 µL של תמיסת SCC ל-72 µL של תמיסת HRP, לעטוף בנייר אלומיניום ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי.תהליך זה מביא ל-HRP המופעל על ידי maleimide שקשור לקבוצת אמינו. ערבבו 17 µL של תמיסת LC-LC biotin עם 200 µL של תמיסת BSA, עטפו את המבחנה בנייר אלומיניום והדגירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי. שלב זה מאפשר ל-biotin להצמד ל-BSA באמצעות קשר אמדי.העבר את תמיסת ה-SA-SPDP, את ה-HRP-SMCC ואת תמיסת ה-biotin המצומדת ל-BSA למרכזים צנטריפוגליים נפרדים בשפורי ספין. צנטריפוג את ה-SA-SPDP ב-10,000 ×g עד שנפח השפור יגיע ל-100 µL או למשך 16 דקות, לאחר מכן מלא את שפור הספין עד ל-500 µL באמצעות PBS-EDTA לפני חזרה על פעולת הספין והוספת ה-PBS-EDTA חמש פעמים נוספות. לאחר צמצום התמיסה בספין ל-100 µL, אחסן את תמיסת המקור בטמפרטורה של 4 °C.עבור ה-HRP SMCC, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g עד שהנפח יגיע ל-25 µL או למשך 16 דקות. מלאו את מבחנת הסpin ל-4500 µL באמצעות PBS לפני חזרה על פעולת הסבב והוספת ה-PBS חמש פעמים נוספות. לאחר סבב של התמיסה לנפח של 100 µL, אחסנו את תמיסת המקור בטמפרטורה של 4 °C.עבור ה-BSA biotin, סבב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g עד שהנפח יגיע ל-100 µL או למשך 12 דקות, ולאחר מכן מלא את מבחנת הספין ל-500 µL באמצעות PBS. לאחר חזרה על תהליך הסבב והוספת ה-PBS ארבע פעמים נוספות, סבב את המבחנה בצנטריפוגה עד שהנפח יגיע ל-100 µL או למשך 12 דקות, לאחר מכן הוסף 100 µL של PBS למבחנה ושמור את תמיסת המקור בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, ערבב 25 µL של HRP בריכוז 10 mg/mL עם 25 µL של תמיסת SA בריכוז 10 mg/mL ושמור את המבחנה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה, לאחר מכן הכן שתי אליקוטות של BSA biotin ב-PBS על ידי הוספת 10 µL של תמיסת המקור של BSA biotin ל-490 µL של PBS.טפטפו 100 µL מהתמיסה לכל באער של פלטת 96 באערים. עטפו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו אותה ב-37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו לבאערים 200 µL של 0.5% Tween 80 ו-BPS.דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ולאחר מכן שאבו ושפכו את הנוזל. לאחר חזרה על השטיפה שלוש פעמים, הוסיפו 200 µL של תמיסת 0.5% casing לכל אחת מהבארות, ואז דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר סבב שטיפות נוסף כפי שבוצע קודם לכן, ערבבו 12 mL של תמיסת 05% casing עם 7.5 µL של 05% Tween 80, ולאחר מכן השתמשו בתמיסה זו כדי לדלל את תמיסת הסטוק של SA-HRP ביחס של 1:10,000.טפטף 80 µL של SA-HRP מדולל לכל באער של פלטת 96 באערים, ולאחר מכן הוסף 20 µL של דגימת ביוטין מוכנה לכל באער בפלטה. הדגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. שלב זה מאפשר קישור תחרותי בין ביוטין חופשי לבין BSA ביוטין מקובע עבור אתרי הקישור של SA-HRP.לאחר שטיפת הפלטה שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן, הכינו תמיסה בנפח 20 milliliter של 50 millimolar sodium acetate, 1% TMB ו-3% hydrogen peroxide ביחס של 1,000 ל-10 ל-1. הוסיפו 200 microliters מהתמיסה לכל באער בפלטה, עטפו אותה בנייר אלומיניום והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. טפטפו באמצעות פיפטה 50 microliters של 2 molar sulfuric acid לכל באער כדי לעצור את התגובה, ולאחר מכן השתמשו בקורא פלטות למדידת ה-OD 450.לאחר הכנת התמיסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 7.5 µL של LC-LC biotin ל-72 µL של HRP. עטפו את התמיסה בנייר אלומיניום והדגירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי עם ערבוב. שלב זה גורם לביוטין להצטמד ל-HRP באמצעות קשר אמדי.העבירו את התמיסה למרכז רכז צנטריפוגלי בתוך מבחנה לספין (spin tube) וסבבו את התמיסה במהירות של 10,000 $\times$g עד שהנפח יגיע ל-100 $\mu$L או למשך 12 דקות, לאחר מכן מלאו את מבחנת הספין ב-PBS עד לנפח של 500 $\mu$L וחזרו על פעולות הצנטריפוגה והוספת הבאפר ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 100 $\mu$L של SA בריכוז 0.17 $\mu$g/mL ב-PBS לכל באער של פלטת 96 באערים. עטפו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו אותה ב-37 °C למשך שעה.כדי לשטוף את בארות הפלטה, טפטפו 200 µL של 0.5% Tween 80 לתוך כל בארה. הדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות ושפכו את הנוזל. לאחר חזרה על השטיפה שלוש פעמים נוספות, הוסיפו לבארות 200 µL של תמיסת חסימה (casing solution) בריכוז 0.5%.דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו את הבארות שלוש פעמים כפי שבוצע קודם לכן. בעזרת תמיסת biotin HRP מרוכזת ושתופה שהוכנה מראש, דללו את תמיסת המלאי של biotin HRP ביחס של 1:10,000, ולאחר מכן הוסיפו 80 microliters מהתמיסה לבארות של פלטה בעלת 96 בארות. הוסיפו 20 microliters של דגימת biotin מוכנה לכל בארה בפלטה ודגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת, כדי לאפשר קישור תחרותי בין biotin חופשי לבין biotin HRP עבור אתרי הקישור של SA המקובעים.לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן, הכינו תמיסה של 20 milliliter המכילה 50 millimolar sodium acetate, 1% TMV, ו-3% hydrogen peroxide ביחס של 1,000 ל-10 ל-1. הוסיפו 200 microliters מהתמיסה לכל בארה בלוחית, כסו אותה ברדיד אלומיניום והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 50 microliters של sulfuric acid בריכוז two molar לכל בארה כדי לעצור את התגובה. לבסוף, השתמשו בקורא לוחות למדידת OD 450.תאי E.coli MG1655 מסוג בר (wild type) מהונדסים וניתנים להשראה גודלו וננטרו בתווך מינימלי וכן בתווך מינימלי מועשר ב-DTB ו/או IPTG. גרפים אלו מציגים את קריאות ה-OD 600 שנמדדו מדי חמש דקות במשך 24 שעות. בניסוי זה, החלבון הפלואורסצנטי mCherry שימש במקום הגן bioB כדי שניתן יהיה למדוד את פרופיל ההשראה כאשר התאים המהונדסים הונחו באמצעות IPTG.תוצאות אלו מדגימות את יעילות רשת הגנים האינדוקבילית. מוצגים כאן האותות האופטיים ב-OD 450 בתגובה לריכוזים משתנים של biotin עבור שתי שיטות המשטח הפונקציונלי, העקיפה והישירה. בניסוי זה, נעשה שימוש בתוצרי תאים מהונדסים שעברו אינדוקציה כדי לבצע שינוי כימי של המשטח הפונקציונלי.ריכוזי הביוטין השונים מוצגים כפי שנמדדו על ידי משטח פונקציונלי שהוכשר באמצעות סכימת בקרה עקיפה עבור תאי פרא (wild type), תאים לא מושראים המכילים את הפלסמיד pKE1-lacI-bioB ותאים מושראים המכילים את הפלסמיד pKE1-lacI-bioB. ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן לבצע הנדסה גנטית לתאים בתוך יומיים, בעוד שניתן לבצע את טכניקות הפונקציונליזציה הישירה והעקיפה של המשטח בתוך חמש שעות כל אחת, אם הן מבוצעות כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מזיהום של תרבית התאים הבקטריאלית ולכסות את המשטחים במהלך הפונקציונליזציה כדי למנוע הבהרה פוטוכימית (photo bleaching).לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע פונקציונליזציה של משטחים עבור סכימות הבקרה הישירה והעקיפה. זכרו כי עבודה עם אתידיום ברומיד (ethidium bromide) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

כאן מוצג פרוטוקול לתכנון, בנייה ואספקה של מעגל סינתטי מבוסס טטרציקלין מבוקר טטרציקלין. ניתן ללמוד את השפעת המעגלים הסינתטיים על סילוק טפילים וביטוי ציטוקינים על ידי תיעול הצינור המוצג. פרוטוקול זה רלוונטי לחוקרים החוקרים טיפולים מבוססי מעגלים סינתטיים במחלות זיהומיות.

מעגלים אימונומטבוליים בזיהום לקידום טיפולים מכווני מארח

מאמר זה מתאר גישה biofabrication: בתצהיר של גירויים, תגובה סוכרים בנוכחות אלקטרודות משוחדים ליצור סרטים ביולוגית אשר יכולה להיות פונקציונליות עם תאים או חלבונים. אנחנו מדגימים אסטרטגיה הספסל העליון לדור של סרטים כמו גם השימושים הבסיסיים ליצירת משטחים biofunctionalized אינטראקטיביים עבור מעבדה על שבב יישומים.

גישור ממשק ביו אלקטרונית עם Biofabrication

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

למדו שיטות לשליטה במשטחים מתוכנתים באמצעות E. coli מהונדסת גנטית. טכניקות שילוב שינוי גנטי ופונקציונליזציה של משטחים מאפשרות יצירת חיישנים דינמיים ליישומים רפואיים וסביבתיים.

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

גלה סרטונים נוספים