זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות חלבונים חדשים קושרי קרח או IBPs מצמחים על ידי בדיקת פעילות קשירת קרח ובידוד פפטידים מקומיים באמצעות טיהור זיקה לקרח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסבילות להקפאת צמחים, במיוחד חלבונים קושרי קרח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לבודד חלבונים קושרי קרח מתמציות מקוריות ללא שימוש בשיטות טיהור מסובכות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהגדרת המנגנון יכולה להיות קשה להמשגה. התחל פרוטוקול זה עם הגדרת מכשיר splat כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לגרום לביטוי של חלבונים קושרי קרח, או IBPs, בעשבים עמידים להקפאה או במיני צמחים אחרים עמידים להקפאה, צמחים מתאקלמים בקור עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס בתנאי תאורה חלשים.

השג כ-0.1 גרם רקמת עלה על ידי חיתוך בבסיס הגבעול ולאחר מכן הנחתו בצינור של 1.5 מיליליטר. הקפיאו מיד את הדגימה בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי ליז את התאים, טוחנים את דגימת הרקמה לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי מתחת לחנקן נוזלי.

ודא שהחנקן הנוזלי לא יתאדה במהלך תהליך ההומוגניזציה. הניחו מיד את דגימות הקרקע על קרח ואפשרו לחנקן הנוזלי להתאדות לחלוטין. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר מיצוי חלבון מקומי ופיפטה לערבוב.

יש לנער בעדינות את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ולבצע את השלבים הנותרים באותה טמפרטורה. למחרת, הסר פסולת סלולרית על ידי צנטריפוגה של הדגימות בערך פי 1,600 G למשך חמש דקות. שמור על החלק המסיס והצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות אם הפסולת התאית נמשכת.

ניתן לאחסן דגימות מובהרות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יוצקים 100 מיליליטר הקסאן לתא החיצוני שהוגדר עם הסרט המקוטב ומוסיפים חמישה עד שישה חרוזי ייבוש כדי למנוע הצטברות לחות על המגלשות. לאחר מכן הוסף כמות קטנה של שומן ואקום לצלחת המכסה את האמבטיה וסובב כדי להבטיח אטימה הדוקה ולמנוע אידוי של הקסאן.

40 דקות לפני תחילת הניסוי, הניחו את גוש הקירור בקופסת פוליסטירן ישירות מתחת לצינור הפלסטיק וכסו אותו לחלוטין בקרח יבש. לפני תחילת הבדיקה, ודא שהצינור ישר. לאחר מכן הסר את הקרח היבש מהחלק העליון של הגוש הקר.

ראשית, בדוק הליך זה עם מים כדי לקבוע היכן על בלוק הקירור הדגימה תיפול. טבלו את הקצה החד פעמי המודבק לפיפטה אוטומטית בשמן טבילה, מה שיאפשר לדגימה ליפול במקום להיצמד לחלק החיצוני של הפיפטה. השתמש במגבת נייר כדי להסיר עודפי שמן.

לאחר מכן שאפו 10 מיקרוליטר מים. הנח את הפיפטה ישירות מעל צינור הפלסטיק לפני שחרור המים. יש לשמוע צליל ספלאט מובהק כאשר המים פוגעים בגוש הקירור, ויוצרים שכבה אחת של גבישי קרח.

לאחר מכן, הנח שקופית כיסוי מיקרוסקופ זכוכית על סימן הטיפה שנקבע במים. מיד לפני תחילת הבדיקה, הפעל את מקור האור וגרד את כל הקרח שנוצר בתחתית תא הזכוכית. לאחר מכן בצע את בדיקת ה-splat עם הדגימה, כפי שנעשה עבור המים, ושחרר 10 מיקרוליטר מהדגימה על שקופית כיסוי הזכוכית כדי ליצור שכבה אחת של גבישי קרח.

הסר במהירות ובזהירות את שקופית המיקרוסקופ מהבלוק הקר באמצעות פינצטה והניח באמבט הקסאן על גבי הסרט המקטב. בהסתכלות מתחת למיקרוסקופ, הכנס את שקופית המיקרוסקופ לשדה הראייה והתאם את עדשת האובייקט כך שהקיטוב הצולב יאפשר הדמיה של גבישי קרח בעלי ניגודיות גבוהה. חבר את המצלמה למיקרוסקופ והתאם את ההגדרות למאקרו כדי לאפשר הדמיה ברורה של גבישי קרח וללכוד את התמונה.

חזור על שלבים אלה עבור כל הדוגמאות. בדרך כלל הנח עד שש שקופיות עם דגימה אחרת בתא ההקסאן. לאחר שתסיים, כבה את מקור האור.

לאחר מכן הניחו צלחת פלסטיק מעל אמבט ההקסאן, הבטיחו אטימה הדוקה, ואפשרו לגבישי קרח להתחסל למשך הלילה. לאחר הדגירה, צלמו תמונות של סרטי הקרח כמו קודם. לאחר התאקלמות קר של רקמת הצמח כמו קודם, אספו כ-100 עד 150 גרם מהביומסה הקרקעית בצינורות של 20 מיליליטר.

הקפיאו מיד את הדגימות, ושמרו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הכן את הדגימה כמו קודם, תוך שימוש ביחס של אחד לאחד להשעיה מחדש של רקמת העלה. השתמש בטבליות מעכבות פרוטאז נוספות כדי למנוע פירוק של IBPs על ידי פרוטאזות אנדוגניות.

כדי להסיר פסולת סלולרית, מנפים את הליזאט דרך שתי שכבות של בד גבינה שלוש פעמים. גלולה את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב 30, 000 פעמים G למשך 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הגדל את נפח הדגימה ל-120 מיליליטר באמצעות מאגר מיצוי חלבון מקומי והשתמש בליסאדה מיד לטיהור זיקה לקרח כדי למנוע אובדן של פעילות קשירת קרח.

לאחר קירור אצבע הקרח למינוס 0.5 מעלות צלזיוס, לאחר מכן טבלו אותה בצינור של 50 מיליליטר המכיל מים מזוקקים קרים. הוסיפו כמה שבבי קרח כדי להקל על התגרענות הקרח ואפשרו לשכבה דקה של קרח להיווצר על האצבע. תהליך זה אורך בדרך כלל בין 20 ל-30 דקות.

מניחים את הדגימה בכוס זכוכית של 150 מיליליטר המכילה מוט ערבוב מגנטי קטן, המונח במיכל פוליסטירן על גבי המערבל המגנטי. ודא שאצבע הקרח מרוכזת ומונמכת לפחות באמצע הדרך לתוך הדגימה הנוזלית. ואז אטום את המיכל.

אפשר לתוכנית לפעול במשך כיומיים, ובדוק כל 24 שעות. לאחר ש-50% מהדגימה מוקפאת, הפסק את התוכנית. שילוב של IBPs בחצי הכדור הקרח יביא לחריטת קרח.

כדי להסיר את חצי הכדור של הקרח, יש לחמם את הגשושית לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את חצי הכדור במים מזוקקים כדי להסיר חלבון לא קשור ולהפשיר בארבע מעלות צלזיוס. אם חצי הקרח עדיין מכיל פיגמנט, או כדי להגביר את טיהור הדגימה, חזור על שלבי הטיהור פעמיים עד שלוש.

מוצגים כאן תמציות שנאספו מבקרת חיץ חסרה IBPs ותמציות מ-Arabidopsis thaliana מסוג בר שאינן מכילות IBPs. לאחר 18 שעות, בקרת החיץ ותמציות A.thaliana אינן מסוגלות להגביל את צמיחת גבישי הקרח. לעומת זאת, גבישי הקרח הקטנים שנראו עם תמציות של A.thaliana טרנסגני המבטא IBPs מ-Lolium perenne שעבר אקלים קר מגבילים את צמיחת גבישי הקרח באופן משמעותי.

לאחר סבב הטיהור הראשון, הדרגה הגבוהה של תחריט קרח על פני השטח של חצי הכדור מצביעה על כך ש-IBPs נספגו לקרח ושינו את הצמיחה של גבישי הקרח. כדי להסיר מומסים נוספים, פיגמנטים וחלבונים מזהמים, נעשה שימוש בסבב שני של זיקה לקרח, וכתוצאה מכך חצי כדור קרח ברור יותר. בעקבות הליך זה, ניתן להעריך את עיצוב הקרח והיסטרזיס תרמי באמצעות אוסמומטר ננו-ליטר על מנת לאפיין עוד יותר חלבונים קושרי קרח.

בנוסף, ניתן לשלוח שברים מבודדים לספקטומטריית מסה על מנת לזהות את רצפי הפפטידים.