זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לאפיין פרוגניטורים המטופואטיים של שקיק החלמון ואת צאצאיהם in vivo, באמצעות מערכת מיפוי גורל בעכברים המושרה על ידי טמוקסיפן ובאמצעות ציטומטריה זרימה. דבר זה עשוי לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה הנוגעים לפיתוח ולבידול של פרוגניטורים המטופואטיים המובחנים מתאי גזע המטופואטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב במהלך הפיתוח ובבגרות אחר הפרוגניטורים ההמטופואטיים שסומנו בחלון זמן מוגבל ואחרי צאצאיהם, כגון מקרופאגים תושבים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בשל כמות התאים עבור רקמת עוברים והנפח הגדול של הדגימות המטופלות בו-זמנית. כדי להתחיל את הניסוי, העבירו תחילה קרני רחם מנותחות של עכבר לתוך צלחת פטרי של 10 מ"מ המולאית בכ-30 מיליליטר של PBS קר מאוד. מיד לאחר מכן, אחזו בשכבות השריר של הרחם בקצה הצווארי של הקרן והחליקו מספריים עדינים בין שכבת השריר לרקמה דסידואלית כדי לשחרר את העוברים.

לאחר מכן, הסר בעזרת פינצטה עדינה את קרום רייכרט (Reichert's membrane) והסר את השליה. בצע דיסקציה עדינה של שקיק החלמון והעבר אותו לפלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות הממולאת ב-0.5 milliliters של תמיסת העיכול. לאחר חיתוך כלי הטבור וכלי הוויטלין, העבר מיד את העובר לפלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות הממולאת ב-2 milliliters של 10 millimolar EDTA קר בטמפרטורת קרח.

לאחר הסרת הראש מהעובר באמצעות מספריים דקים וחדים, דגרו את הגוף ואת הראש על קרח למשך 10 עד 15 דקות, ולאחר מכן הוציאו את העובר ואספו את ה-EDTA המכיל את הדם. לאחר מכן, הסירו את השק השליה (amnion) המקיף את העובר. לאחר מכן, הסירו את הגפיים האחוריות ואת הגפיים הזרות מהעובר.

בעזרת זוג פינצטות עדינות, פתחו את בית החזה. לאחר מכן, אחזו בחלק הקדמי של הלב ומשכו בעדינות את הרקמה תוך שחרור האיברים הפנימיים מהגוף באמצעות זוג פינצטות שני. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הפרידו את כבד העובר מהלב ומהמעי.

העבירו את האיבר לפלטת 24 בארות הממולאה ב-0.5 milliliters של תמיסת העיכול. הקשר האנטומי עם מערכת הלב וכלי הדם הוא קריטי לזיהוי כבד העובר. כבד העובר נמצא בשלב התפתחותי זה, וככל שהעוברים צעירים יותר, כך הנתיחה עשויה להיות קשה יותר.

להכנת תרחיפי תאים ראשוניים, הדגרי את האיברים שנאספו בתמיסת העיכול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות. העבירי את הרקמה שבתוך התמיסה האנזימטית למסנן של 10 micrometer המותקן על אחת מבארות ה-six-weld של פלטת תרביות רקמה הממולאת ב-1 milliliter של FACS buffer. השתמשי בבוכנה גומית שחורה ממזרק של 2 millimeter כדי להפריד את הרקמה על ידי ריסוק עדין, במטרה לקבל תרחיף של תאים בודדים.

לאחר מכן, שאבו את תרחיף התאים באמצעות פיפט פסטור והעבירו אותו למבחנה בנפח 15 מיליליטר. סובבו את התרחיף בצנטריפוגה ב-320 $\times$g בטמפרטורה של 4 °C למשך 7 דקות. לאחר הסבוב, שאבו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant).

בשלב הבא, הכין תמיסת חסימה של Fc טרייה וסספנד מחדש את המשקע ב-60 microliters. לאחר מכן, העבר 50 microliters של סספנסיית תאים בודדים לבאר בלוחית 96-well בעלת תחתית עגולה. הדגר את הלוחית על קרח למשך 15 דקות לפחות.

לאחר מכן, העבירו את 10 µL שנותרו מהסספנסיה לתוך נבובת FACS מפוליסטירן בנפח 5 mL כדי לקבל מאגר של דגימות המופקות מרקמות שונות. העבירו 50 µL מהמאגר עבור בקרות FMO עבור כל פלואורוכהום לתוך פלטת 96 בארות. כדי להמשיך לצביעת פני השטח של האנטיגן, השתמשו בסט של שישה נוגדנים פלואורוכרומיים להכנת תמיסת נוגדנים ובאפר FACS.

לאחר מכן, הכין שש תמיסות נוגדנים ובאפר FACS המשמשים לצביעת בקרת FMO. לאחר מכן, הוסף 50 µL מתמיסות הנוגדנים לדגימות בפלטת 96 הבארים. ערבב את הדגימות על ידי פיפטור כפול עדין, ולאחר מכן הדגר את הפלטה על קרח למשך 30 דקות.

סובב את פלטת 96 הבארים בצנטריפוגה ב-320 ×g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות והסר את הנוזל העליון. שטוף את התאים ב-200 µL של FACS buffer וסובב את הפלטה פעם נוספת. יש לנקוט משנה זהירות בעת הסרת הנוזל העליון על ידי היפוך הפלטה.

יש להפוך את פלטת 96 הבארים בתנועה חדה אחת של שורש כף היד כדי למנוע ניתוק של התאים. לבסוף, בעזרת מסננת של 70 מיקרון, יש לסנן את דגימות הרקמה והביקורת אל תוך פרועיות פוליסטירן של 6 מילימטר. כעת ניתן לבצע ניתוח של ציטומטריה זרימה.

אוכלוסייה של תאים בודדים חיים שאינם תאי דם אדומים נותחה לבדיקת הביטוי של סמן הפרוגניטור KIT ושל סמן התאים ההמטופואטיים CD45. בתוך האוכלוסייה הממוקדת, הובחנו שלוש תתי-אוכלוסיות תאים שונות: KIT חיובי CD45 שלילי, KIT חיובי CD45 נמוך, ו-KIT שלילי CD45 חיובי.

מבין התאיים הפרוגניטורים החיוביים ל-kit של שק החלמון, הן אוכלוסיית התאים השלילית ל-CD45 והן האוכלוסייה עם רמות נמוכות של CD45 הכילו תאים חיוביים ל-AA4.1 המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב (YFP), מה שמעיד כי פרוגניטורים לא בשלים החיוביים ל-KIT מבטאים תחילה AA4.1 ללא קשר לביטוי CD45. תאים חיוביים ל-AA4.1 וחיוביים ל-YFP בכבד ובמוח נמצאו רק באוכלוסיית הפרוגניטורים החיוביים ל-KIT עם רמות נמוכות של CD45, וסביר להניח שהם תואמים לפרוגניטורים במחזור הדם שמקורם בפרוגניטורים של שק החלמון. מקרופאגים נמצאו באוכלוסייה השלילית ל-kit והחיובית ל-CD45, וזוהו כתאים חיוביים ל-CD11 B עם ביטוי גבוה (bright) של F480.

מקרופאגים בשק החלמון, בכבד ובמוח סומנו ביעילות באמצעות מתן בודד של 4-hydroxy tamoxifen, מה שעשוי להעיד על מקורם כ-ENP. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הליך בידוד התאים והצביעה תוך שלוש עד ארבע שעות, אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשאיר את הדגימות תמיד על קרח מיד עם איסופם.

יש להכין ולסנן באפרים טריים ל-FACS מדי יום. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בזני reporter או flux אחרים של mash, כגון קווי Rosa MTMG או Rosa confetti, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לפוטנציאל של דה-דיפרנציאציה ושלב הפרוטו של התאים המסומנים.