זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין אבות המטופויאטיים של שק חלמון וצאצאיהם in vivo באמצעות מערכת מיפוי גורל המושרה על ידי טמוקסיפן עכבר וזרימה ציטומטרית. זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה הנוגעות להתפתחות והתמיינות של אבות המטופויאטיים הנבדלים מתאי גזע המטופויאטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב אחר האבות ההמטופויאטיים המסומנים בחלון זמן מוגבל ואחר הצאצאים כגון מקרופאגים תושבים במהלך ההתפתחות והבגרות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל עסקת התאים לרקמה עוברית והנפח הגדול של הדגימות המטופלות בו זמנית. כדי להתחיל בניסוי, העבירו תחילה קרני רחם עכברים מנותחות לצלחת פטרי בגודל 10 מילימטר מלאה בכ-30 מיליליטר PBS קר כקרח. מיד לאחר מכן, אחוז בשכבות שריר הרחם בקצה צוואר הרחם של הקרן והחלק מספריים עדינים בין שכבת השריר לרקמה עשרונית כדי לשחרר את העוברים.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים עדינים הסר את הקרום של רייכרט והסר את השליה. מנתחים בעדינות את שק החלמון ומעבירים אותו לצלחת תרבית רקמות בת 24 ריתוך מלאה ב -0.5 מיליליטר מתמיסת העיכול. לאחר ניתוק כלי הטבור והוויטולין, העבירו מיד את העובר לתוך צלחת תרבית רקמה בת 12 ריתוכים מלאה ב-2 מיליליטר של 10 מילי-מולרי קר כקרח EDTA.

לאחר הוצאת הראש מהעובר בעזרת מספריים עדינים וחדים, דגרו את הגוף ואת הראש על קרח למשך 10 עד 15 דקות ולאחר מכן הסירו את העובר ואספו את ה-EDTA המכיל את הדם. לאחר מכן, הסר את מי השפיר המקיפים את העובר. לאחר מכן הסר את הגפיים האחוריות והגפיים הזרות מהעובר.

בעזרת זוג מלקחיים עדינים, פתח את בית החזה. לאחר מכן, אחזו בחלק הקדמי של הלב ומשכו בעדינות את הרקמה תוך שחרור האיברים הפנימיים מהגוף בעזרת זוג מלקחיים שני. תחת מיקרוסקופ מנתח, הפרד את כבד העובר מהלב והמעיים.

והעבירו את האיבר לצלחת 24 באר מלאה ב -0.5 מיליליטר מתמיסת העיכול. הקשר האנטומי עם מערכת הלב וכלי הדם הוא קריטי לזיהוי כבד העובר. הכבד העוברי עדיין בשלב התפתחותי זה וככל שהעוברים צעירים יותר, כך הדיסקציה יכולה להיות קשה יותר.

להכנת תרחיפי תאים ראשוניים, דגרו את האיברים שנאספו בתמיסת העיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טען את הרקמה בתמיסה האנזימטית למסננת של 10 מיקרומטר המותקנת מעל ריתוך אחד של צלחת תרבית רקמה בעלת שישה ריתוכים מלאה ב-1 מיליליטר של מאגר FACS. השתמש בבוכנת גומי שחורה ממזרק של 2 מילימטר כדי לנתק את הרקמה על ידי ריסוק עדין לקבלת תרחיף תא בודד.

לאחר מכן, שאפו את תרחיף התא בעזרת פיפטה של פסטר והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלה ב -320 פעמים G ב -4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף ולהשליך את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הכינו מאגר חסימת Fc טרי ואת התלייה מחדש של הגלולה ב-60 מיקרוליטר. לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר של מתלה התא היחיד לבאר של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. דגרו את הצלחת על קרח למשך 15 דקות לפחות.

לאחר מכן, העבירו את 10 המיקרוליטרים הנותרים של המתלה לתוך צינור FACS מפוליסטירן בנפח 5 מיליליטר כדי לקבל מאגר דגימות שמקורן ברקמות שונות. העבר 50 מיקרוליטר מהבריכה עבור בקרות FMO עבור כל פלואורוכרום לצלחת 96 בארות מרובות. כדי להמשיך בצביעת פני האנטיגן, השתמש בקבוצה של שישה נוגדנים פלואורוכרום להכנת תמיסת נוגדנים ומאגר FACS.

לאחר מכן הכן שש תמיסות נוגדנים ומאגר FACS המשמש לצביעה של בקרת FMO. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסות הנוגדנים לדגימות בצלחת 96 בארות מרובות. מערבבים את הדגימות על ידי פיפטינג כפול עדין ולאחר מכן מדגרים את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.

צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות הרב-בארות ב-320 פעמים G ב-4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות והסר את הסופרנטנט. שוטפים את התאים ב -200 מיקרוליטר של מאגר FACS וסובבו את הצלחת פעם נוספת. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת הסרת הסופרנטנט על ידי היפוך צלחת.

יש להפוך את הצלחת מרובת הבארות 96 בתנועת שורש כף היד חדה אחת כדי למנוע התרופפות התאים. לבסוף, בעזרת מסננת 70 מיקרו, מסננים את הרקמה ושולטים בדגימות לצינורות פוליסטירן בגודל 6 מילימטר. כעת ניתן לבצע ניתוח ציטומטרי זרימה.

אוכלוסייה של תאים בודדים ציטיים חיים שאינם אריתרוציטים נותחה לביטוי ערכת סמני האב וסמן התאים ההמטופויאטיים CD45. בתוך אוכלוסיית היעד, הובחנו שלוש תת-אוכלוסיות תאים שונות. KIT חיובי CD45 שלילי, KIT חיובי CD45 נמוך ו-KIT שלילי CD45 חיובי.

מבין האבות החיוביים של ערכת שק החלמון, גם אוכלוסיות התאים השליליות CD45 וגם CD45 הכילו תאים חיוביים AA4.1 המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב או YFP, מה שמצביע על כך שאבות חיוביים ל-KIT לא בשלים מבטאים תחילה AA4.1 ללא קשר לביטוי CD45. תאים חיוביים ל-AA4.1 חיוביים ל-YFP בכבד ובמוח נמצאו רק באוכלוסיית האב הנמוך CD45 חיובי ל-KIT ומתאימים ככל הנראה לאבות במחזור שמקורם באבות שק החלמון. מקרופאגים נמצאו באוכלוסייה חיובית CD45 שלילית לערכה וזוהו כתאים חיוביים ל-CD11 B בהירים F480.

מקרופאגים בשק החלמון, בכבד ובמוח סומנו ביעילות על ידי מתן טמוקסיפן יחיד של 4-הידרוקסי שעשוי להצביע על מקורם ב-ENP. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההליך לבידוד תאים וצביעה תוך שלוש עד ארבע שעות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לשמור דגימות על קרח ברגע שהן נאספות.

יש להכין מאגרי FACS טריים מדי יום ולסנן אותם. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בזני מחית או שטף אחרים כמו Rosa MTMG או קווי קונפטי רוזה על מנת לענות על שאלות נוספות על פוטנציאל ההתמיינות ושלב הפרוטו של התאים המסומנים לאחר התווית.