מיזוג קיטוב ריכוז יון בין חופפי Ion Exchange ממברנות כדי לחסום את ההתפשטות של אזור הקיטוב
23 בפברואר 2017
הפרוטוקול עבור קיטוב ריכוז יון רומן (ICP) פלטפורמה שיכולה לעצור את ההתפשטות של אזור ICP, ללא תלות בתנאי ההפעלה מתוארת. יכולת הייחודית זו של הפלטפורמה נמצאת בשימוש של התמזגות דלדול יון והעשרה, שהן שני קטבים של תופעת ICP.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לרכז מראש ביו-סוכנים על ידי הגבלת אזור הקיטוב של ריכוז היונים בין שני ממברנות חילופי יונים זהות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון כיצד לזהות ביומולקולה בשפע נמוך כאשר הריכוז שלה נמוך מגבול הזיהוי של החיישן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים ליצור אזור ICP וביו-סוכן מרוכז מראש בהתנגשות מאוד ספציפית ללא קשר לתנאי הפעולה.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בפוטוליתוגרפיה קונבנציונלית או בתחריט יונים תגובתי עמוק כדי לייצר מאסטרים של סיליקון עבור מיקרו-ערוץ פולידימתילסילוקסן ותבניות ממברנה סלקטיביות. הנח את אדוני הסיליקון במייבש ואקום עם כ -30 מיקרוליטר טריכלורוסילן. סגרו את חומר הייבוש והמליחו את אדוני הסיליקון למשך 30 דקות.
לאחר מכן, ערבבו יחד בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי ביחס של 10 לאחד לפי משקל כדי לקבל PDMS לא נרפא. הסר את התערובת בוואקום למשך 30 דקות. לאחר מכן שפכו את ה-PDMS הלא מרופאים על אדוני הסיליקון.
הסר בועות מה-PDMS בעזרת מפוח כף יד ולאחר מכן רפא את תבניות ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הפרד את רכיבי ה-PDMS שנרפאו מעמודי הבסיס של הסיליקון. השתמש בסכין כדי לעצב כל רכיב למלבן.
לאחר מכן, חותכים שני קווים בתבנית הממברנה הסלקטיונית מקצה התבנית למיקרו-תעלות הטרומיות. השתמש באגרוף ביופסיה של שני מילימטרים כדי לנקב חור בקצה כל תעלה בצורת L. נקה שקופית זכוכית במשטח המיקרו-מכונה של תבנית הממברנה להחלפת קטיון בעזרת סרט דבק אקרילי ומפוח.
הנח את הפנים הנקיות של התבנית על מגלשת הזכוכית כדי לאטום את התבנית למגלשה באופן הפיך. הנח 10 מיקרוליטר של שרף חילופי קטיון על מגלשת הזכוכית במגע עם קצות התעלות בצורת L. הנח את קצה המזרק מעל חורי המיקרו-ערוצים ומשוך בעדינות את הבוכנה כדי למשוך את השרף לתוך התעלות.
תוך דקה אחת ממילוי תעלות השרף, נתק בזהירות את התבנית מבלי לגעת בשרף המעוצב בשקופית. מחממים את השקופית בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לאדות את הממס מהשרף. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר חלקים מיותרים של שרף חילופי קטיונים מהמגלשה ליצירת ממברנות סלקטיביות בצורת L.
לאחר מכן, השתמש באגרוף הביופסיה כדי לנקב מאגר של 2.0 מילימטר בכל קצה של המיקרו-ערוץ הטרומי ברכיב המיקרו-ערוץ PDMS. לאחר מכן נקב שני חורים נוספים ב-PDMS המתאימים לקצות הממברנות בצורת L. טפל ברכיב המיקרו-ערוץ PDMS ובמצע בדוגמת הממברנה בפלזמת חמצן למשך 40 שניות ב-100 וואט ו-50 הנח את הפנים המטופלות של המצע על הפנים המטופלות של המיקרו-ערוץ PDMS וודא שהממברנות הסלקטיביות חוצות את המיקרו-ערוץ ומרופדות בחורים ב-PDMS.
הפעל לחץ עדין לפי הצורך כדי לאטום את רכיב ה-PDMS למצע כדי להשלים את הרכבת ההתקן. כדי להתחיל בניסוי, השג מספר פתרונות יוניים לבדיקה עם ריכוזים ו-pH משתנים. הכן תמיסת חיץ של אשלגן כלורי טוחנת אחת או נתרן כלורי
.הוסף כמות קטנה של צבע פלואורסצנטי טעון שלילי לכל תמיסת בדיקה וודא שריכוז הצבע נמוך מספיק כדי שתרומתו לתמיסת זרם חשמלי תהיה זניחה. טען את תמיסת הבדיקה הראשונה למאגר אחד של המיקרו-ערוץ. משוך את התמיסה לתוך המיקרו-ערוץ על ידי הפעלת לחץ שלילי עדין על מאגר המיקרו-ערוץ השני.
הנח טיפה גדולה של תמיסת הבדיקה על שני מאגרי המיקרו-ערוצים כדי למנוע כל שיפוע לחץ בערוץ. לאחר מכן מלאו את מאגרי הממברנה הסלקטיונית בתמיסת החיץ שנבחרה כדי לפצות על אפקט ה-ICP. טען את שבב ה-ICP על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במצלמת מכשיר מצמד מטען.
חבר אנודה למאגר הממברנה השמאלי וקתודה למאגר הממברנה הימני. חבר את האלקטרודות ליחידת מדידת מקור. השתמש ביחידת מדידת המקור כדי להפעיל כרךtage על המכשיר ולמדוד את תגובת הזרם.
רכוש תמונות פלואורסצנטיות של השבב במהלך הפעלת מתח. לאחר הניסוי, נתח את עוצמת הקרינה עם תוכנת ההדמיה המתאימה. בשיטה זו, נוצר רכז קדם-נוזלי מיקרופלואידי, ונחקרו תגובות זמן מתח הזרם בפרופילי עוצמת הקרינה המתאימים לפתרונות בדיקה שונים.
כמו ברכזי ממברנה בודדת קונבנציונליים, נצפו שלושה משטרי מתח שונים. במהלך המשטרים האוהמיים והמגבילים, שיפוע הריכוז הליניארי התפתח בממברנות הסלקטיביות של הקטיונים והתמזג לאחר כשנייה. בניגוד לרכזי ממברנה בודדת, במשטר הגבלת יתר, אזורי ה-ICP התמזגו תוך פחות משנייה עם הלם דלדול שניתן היה להבחין בו על ידי הדמיית פלואורסצנטיות.
הירידה המקבילה במוליכות באה לידי ביטוי בתגובת הזמן הנוכחית. הזמן הנוכחי התאושש לאחר מכן. זה נצפה במספר מתחים במשטר הגבלת יתר.
ההתאוששות הנוכחית יוחסה להובלת חיבור על ידי אזורי ICP בשילוב בין הממברנות הסלקטיביות המבודדות את פקקי הריכוז המקדים לאורך יישום המתח. התאוששות זרם זו לא נצפתה ברכזי ICP קונבנציונליים מכיוון שאזור הדלדול ותקע הריכוז המקדים מתפשטים בחופשיות לאורך המיקרו-ערוץ. בעוד שחוזק יוני מוגבר, חומציות ובסיסיות הפחיתו את העוצמה היחסית של פקקי קדם-ריכוז ברכז הקדם-זמני המוגדר מרחבית-זמנית, התקעים עדיין היו מוגבלים.
בדיקות נוספות המתקרבות לריכוז מוקדם הצביעו על כך שממברנות חילופי קטיונים רחבות יותר בתעלה צרה יותר יכולות להקל על ריכוז מוקדם של ICP בתנאים שליליים אלה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האלקטרוקינטיקה לחקור יישומים במערכות מיקרופלואידיות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב חומרים להחלפת יונים בין מערכות מיקרופלואידיות וכיצד להשתמש בפלטפורמה זו כדי לרכז מראש ביו-סוכנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פלטפורמה חדשנית של קיטוב ריכוז יונים (ICP), שנועדה לעצור את התפשטות אזור ה-ICP תחת תנאי הפעלה שונים. היכולת הייחודית של הפלטפורמה נובעת מהמיזוג של תהליכי דלדול והעשרה של יונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- הנדסה ביומדית
רקע
- קיטוב ריכוז יונים הוא תופעה שניתן לנצל לצורך ריכוז מקדים של סוכנים ביולוגיים.
- זיהוי של ביו-מולקולות בריכוז נמוך מציב אתגרים משמעותיים בביוסנסינג.
- שיטות קונבנציונליות מתקשות לעיתים קרובות לפעול ביעילות תחת תנאים משתנים.
- מחקר זה בוחן גישה חדשה לשיפור יכולות הגילוי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לריכוז מוקדם של סוכנים ביולוגיים באמצעות קיטוב ריכוז יונים.
- בדיקת דרכים לגילוי ביו-מולקולות בריכוזים הנמוכים מגבולות הגילוי של החיישן.
- הדגמת היתרונות של פלטפורמת ה-ICP החדשה בתרחישי תפעול שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור תבניות מאסטר מסיליקון באמצעות פוטוליטוגרפיה או חריטה עמוקה של יונים ריאקטיביים (deep reactive ion etching).
- יצירת מיקרו-ערוצים מפולידימيثילסילוקסאן (PDMS) ותבניות לקרומי ברירה קטיונית.
- סליליזציה (Salinization) של תבניות המאסטר מסיליקון בתוך דסיקטור ואקום באמצעות טריכלורוסיליאן.
- הגבלה של אזור ה-ICP בין שני קרומי חילוף יונים זהים.
תוצאות עיקריות
- ניתן להפיק ולשמר ביעילות את אזור ה-ICP ללא קשר לתנאי התפעול.
- ניתן לבצע ריכוז מוקדם של סוכנים ביולוגיים באופן מבוקר.
- השיטה מבטיחה שיפור בגילוי של ביו-מולקולות בריכוז נמוך.
- התוצאות מעידות על ביצועים משופרים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- פלטפורמת ה-ICP החדשנית מציעה יתרונות משמעותיים עבור ריכוז מוקדם של חומרים ביולוגיים.
- גישה זו עשויה להוביל לפיתוחים בטכנולוגיות של חיישנים ביולוגיים.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את מלוא הפוטנציאל שלה ביישומים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בביו-חשיפה (biosensing): הקושי בשימור אזורי ריכוז מוקדם יציבים תחת תנאי הפעלה משתנים, המגביל זיהוי מהימן של סמנים ביולוגיים בריכוזים נמוכים. באמצעות מיזוג של אזורי דלדול והעשרה יונית, השיטה מאפשרת הצטברות של מטרות במיקומים ובזמנים קבועים לאורך טווחים רחבים של מתח, חוזק יוני ו-pH, ובכך משפרת את עמידות הבדיקה. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים על ידי שיפור יחסי אות לרעש עבור אנליטים בריכוזים נמוכים, ובכך מגבירה את הביטחון בזיהוי פגיעות (hits) ומפחיתה את כמות התוצאות השליליות השגויות בקמפיינים של סריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ביו-מולקולות בריכוז נמוך על ידי ייצוב אזורי ריכוז מוקדם, ובכך משפר את רגישות הגילוי עבור בדיקות תיקוף של מטרות.
- ערך תפעולי: פועל בטווחים רחבים של מתח (0.5-100 V), חוזק יוני (1-100 mM) ו-pH (3.7-10.3), ובכך מפחית את הצורך באופטימיזציה של תנאים ומגביר את התפוקה.
- ערך ניבוי: פלאגים (plugs) מוגבלים של ריכוז מוקדם מאפשרים קריאות אות עקביות, התומכות במדידות מהימנות של מעורבות המטרה (target engagement) והפחתת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלאגים מרוכזים של מטרה בממשק הממברנה, ובכך יוצר מיקרו-סביבה ביוכימית מוגדרת עבור בדיקות קישור או בדיקות אנזימטיות סטנדרטיות.
- ערך תפעולי: מונע התפשטות של אזורי קיטוב, מה שמבטיח מיקומי ריכוז מקדימים הניתנים לשחזור, שהם קריטיים לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולעקביות בין פלטות שונות.
- יכולת הרחבה: הפורמט המיקרופלואידי תומך בהקבלה ובשילוב עם מערכות גילוי עבור תהליכי סריקה בתושבה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על נאמנות הריכוז המוקדם תחת שינויים של pH ועוצמה יונית הרלוונטיים פיזיולוגית, ובכך תומכת בזיהוי סמנים ביולוגיים במטריצות של דגימות הרלוונטיות למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבודדת אנליטים מרוכזים מפיזור הנגרם מזרימה, מה שמאפשר קורלציה ברורה יותר בין עוצמת האות לריכוז המטרה לצורך פרופילינג פרמקוקינטי או פרמקודנמי.
- רלוונטיות למודלים פרה-קליניים: תואמת לקריאות פלורסצנטיות או לומניסצנטיות המשמשות נפוץ כסממנים לדימוי in vivo, ובכך מקלה על תיקוף בין-פלטפורמי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ובאופן ספציפי משפרת את מוכנות הבדיקה במהלך זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) על ידי אספקת שלב ריכוז מוקדם הניתן לשחזור לפני הגילוי, מבלי לדרוש ניסוח מחדש של זרימות העבודה האנליטיות הבאות.
- ביולוגיה של הגילוי: מייצב את קיטוב ריכוז היונים כדי לאפשר זיהוי מהימן של מטרות בשפע נמוך, ובכך תומך בבדיקת היפותזות בבירור מסלולים ובדה-קונבולוציה של מטרות.
- סריקה: מספק פלט עקבי של ריכוז מקדים ללא תלות בסחף פלואידי או בתנודות מתח, ובכך משפר את שיעורי אישור הפגיעות (hits) בסריקות ראשוניות ומשניות.
- אנליזה: מייצר פרופילי עוצמת פלואורסצנציה כמותיים מפלקים מוגבלים, המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים שונים ומספרי תרכובות.
- מחקר תרגומי: שומר על הריכוז המקדים תחת תנאי באפר משתנים, בהתאם לדרישות הטיפול בדגימות פיזיולוגיות לצורך אימות ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפלטפורמה, המיוצרת באמצעות ליטוגרפיה רכה סטנדרטית, ניתנת לשימוש חוזר בפרויקטים שונים וניתנת להתאמה לממברנות סלקטיביות ליונים שונות עבור פאנלים של מטרות מרובות (multiplexed).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לגילוי של ביו-מולקולות הנמצאות מתחת לסף הגילוי, באמצעות שיפור יעילות הריכוז המוקדם.
- ערך תפעולי: מפחית את השונות בבדיקה על ידי קיבוע מיקום הריכוז המוקדם, ובכך משפר את השחזוריות בין הרצות שונות ומשתמשים שונים.
- ערך אסטרטגי: מוריד את שיעורי התוצאות השליליות הכוזבות הביולוגיות בסריקה מוקדמת, דבר התומך בקבלת החלטה טובה יותר לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) ומפחית השקעה מבוזבזת במטרות שאינן תקפות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות המותאם לסיכון בהתבסס על נתונים אמינים של ריכוזים נמוכים, ובכך משפר את יעילות ההמרה משלב ה-hit לשלב ה-lead.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מיקרופלואידי, כולל פוטוליתוגרפיה או תכריסום וטיפול ב-PDMS.
- תלוי בגישה לשרפי חילוף יונים, משאבות מזריקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם יכולות דימות CCD.
- מחייב סטנדרטיזציה של יישור הממברנה ומילוי המאגרים כדי להבטיח מיזוג עקבי של אזורי ה-ICP.
- התאמה לביומולקולות חלופיות עשויה לדרוש אופטימיזציה של סימון פלואורסצנטי או של אורך גל הגילוי.
- הביצועים עשויים להשתנות במקרים של צמיגות דגימה קיצונית או עומס חלקיקים, אם כי מנגנון הכליאה המרכזי נותר יציב תחת תנאי ה-pH והיונים שנבדקו.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Fabrication of a Spatiotemporally Defined Ion Concentration Polarization (ICP) Preconcentration Device
3:56
Visualization of Preconcentration Dynamics
5:32
Results: ICP Phenomenon in a Spatiotemporally Defined Preconcentration Device
7:21
Conclusion
