Name: בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור את תהליך הביוגנזה והתנועה של ריסים ראשיים בתאי גזע עצביים באמצעות שיטות תרבית neurosphere. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסלולים ציליאריים בהקשר של תאי עצב פרימריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה של ס.מ. ממומנת על ידי מענקי גיוס מ-CPRIT (R1220) ו-NIH (1R01GM113023-01).

1. ניתוק של Neurospheres ממוח העכבר למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מבוגר (סביב 2 חודשים) ממנת יתר של isoflurane. בדוק היטב כי העכבר הפסיק נשימה לנתח מיד לאחר מותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לעשות חתך קו האמצע כדי לפתוח את הגולגולת. הסר את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח קר PBS בצלחת 10 ס&quot;מ על הקרח. בצע את השיטה לנתיחה כל ההר להשיג את SVZ מן החדר לרוחב 48. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר לרוחב לתוך צינור מ&quot;ל 1.5, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, ו דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 15 דקות, להוסיף 500 μL של המדיום לעצור בעדינות pipet 20 - 30 פעמים עם טיפ מ&quot;ל 1. הימנע ויוצרים בועות אוויר במהלך בפיפטה. הערה: שלב זה הוא קריטי להישרדות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את התאים ב 500 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS, ו גלולה tהוא התאים על ידי pipetting 5x בעדינות עם קצה מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) אם פסולת הסלולר הם נצפו, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer; באופן כללי, על 30,000 - 60,000 תאים / SVZ מתקבלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים מן SVZ אחד לתוך צלחת 10 ס&quot;מ עם 10 מ&quot;ל של מדיום ותרבות המל&quot;ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי למנוע היתוך בין תחומי 49, לשים 1000 תאים הבאר אחד של צלחת אולטרה-נמוכה מחייב 6-היטב, כי הוא מלא מראש עם 1.5 מ&quot;ל של מדיום ותרבות המל&quot;ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: לאחר 5-7 ימים, neurospheres ניתן לראות (איור 2A). תקופת culturing עשויה להיות שונה עם הגיל של עכבר או הרקע הגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום NSC כל 3-4 ימים כדי לשמור על התרבות(לא להסיר את המדיום הקיים). </li></ol> ניתוח 2. לחוק הכשרות דיפרנציאציה של בדיקות Neurospheres ו Ciliogenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את יכולת הבידול, לנתח את neurospheres בתנאים חסידים במדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 12 מ&quot;מ עגול coverslips ידי מעוקר או עם חשיפה UV לפני השימוש. לקבלת תרבית תאים חסידה, לשים מכסת זכוכית עגולה מעוקרת 12 מ&quot;מ לתוך באר של צלחת 24-היטב בתנאים מזוהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל זכוכית המכסה עבור 10 s עם 500 μL של 0.002% פולי- L- ליזין (PLL). לשאוב את הפתרון ולייבש אותו במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פתרון laminin (5 מיקרוגרם / μL). דגירת זכוכית הכיסוי עבור 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את laminin ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול או בינוני NSC (שליטה מובחנת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay בידול, להרים 100 - כדור מיקרומטר 200 עם טיפ 200 μL תחת מיקרוסקופ. לְהוֹסִיף5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 7-10 ימים במדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח neurospheres מובחן, להוסיף 5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 1-2 ימים במדיום המל&quot;ל. Neurospheres Attached להתפשט ולגדול כמו בשכבה (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת בינוני בקפידה, לתקן את התאים עם 4 paraformaldehyde% (PFA) ב PBS עבור 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים עבור 5 דקות ב RT. הצלחת ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים. הערה: כדי להמחיש תאי גזע / ובתאים עצביים במדיום NSC ותאי בדיל במדיום בידול, לבצע immunostaining נגד Nestin (גזע עצבי / ובתאי סמן תא), β טובולין III (monoclonal Tuj1, סמן עצבי), GFAP (חלבון גליה fibrillary חומצי astrocyte, סמן), ולאחר O4 (סמן oligodendrocyte) (איור 2B-E). כדי לנתח את הריסים, לבצע immunostaining נגד Arl13b (CI העיקריליה סמן) ו Gpr161 (GPCR ריסי) (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מכסה זכוכית עם פתרון הרכבה על גבי זכוכית שקופית. הטה את הכוס השקופית להסיר פתרון עודף. </li></ol> 3. ניתוח של Ciliogenesis ב Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תאים neurospheres שלמים ידי immunostaining, העברת 1 מ&quot;ל של מדיום culturing המכיל neurospheres מרובים כדי צינור 1.5 מ&quot;ל ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. תקן את התחומים עם 4% (PFA) לאחר ההסרה הבינונית עבור 15 דקות ולשטוף עם PBS. ספין למטה תחומי XG ב 500 במשך 8 דקות, להסיר supernatant, דגירה בתחומי O / N עם סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות קצה מ&quot;ל 1 ולהוסיף 500 μL של פתרון אוקטובר באמצעות קצה מ&quot;ל קיצוץ 1. חותך את קצה הקצה כדי להרחיב את הפתח, כמו אוקטובר הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון אוקטובר המכיל את neurospheres לתוך תבנית הקפאה פלסטיק חד פעמיות (10 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את מ &#39;הישן על קרח יבש דקות 15 לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את התבנית במקפיא C -80 ° עד 1 שנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלקים עם cryostat; עובי סעיפים צריך להיות 15-30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הריסים העיקריים בתוך neurosphere, לבצע immunostaining נגד Arl13b (איור 4). </li></ol> תרבות Passage 4. Neurospheres ו NSCs חסיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסדרון, neurospheres בעוד בגודל כדור הוא בין 100-200 מיקרומטר; כאשר neurospheres גדול מדי (300 מיקרומטר ומעלה), הם לא אידיאליים עבור ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת neurospheres לתוך צינור 50 מ&quot;ל באמצעות קצה מ&quot;ל 1 ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות aspirator, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמות טריפסין משתנה בהתאם למספר תחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של המדיום בסרום בעדינות צינורt 20 פעמים עם טיפ מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) אם neurospheres פסולת או undissociated הסלולר נראים, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים בצלחת 10 ס&quot;מ בצפיפות של 10,000 תאים / ס&quot;מ 2 במדיום המל&quot;ל; התא יהיה מוכן לקטע הבא אחרי שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי להקפיא את התאים, להוסיף מקפיא בינוני לייצר 500,000 עד 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​ההשעיה. להקפיא את התאים באמצעות מכולות מקפיאות-קריו; neurospheres undissociated אפשר להקפיא גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התרבות החסידה, dillute לתאי 50,000 תאים / סנטימטר 2 על PLL- ו Laminin מצופה coverslips עם מדיום NSC, ותרבות במשך 1-2 ימים. </li></ol> 5. רעב וניתוח של צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני רעב (לוח 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ימים לאחר pl הראשוניתating של תאים חסידים לאחר ניתוק, שינוי המדיום המל&quot;ל גם אחד (שליטה) ובינוני לרעב אחר היטב (ניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים החסידים עבור 24 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 4% PFA ב PBS עבור 15 דקות ב RT ולשטוף פעמיים עם PBS עבור 5 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את צלחות 24-היטב עם coverslips PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פרוטוקול immunofluorescence מכתים 7, 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות פתרון גובר. יבש את O זכוכית שקופית / N ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות על מיקרוסקופ מתחם בהגדלה ההכרחית. שימוש במיקרוסקופ, מצלמה, ויעדים (40X / 1.3 נפט 63X / 1.4 נפט), הנשלט באמצעות התוכנה המלווה. קח z-סעיפים מספיק על 0.5-0.8 מיקרומטר במרווחים (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כמותי של לוקליזציה ריסים בתאים חסידים, לרכוש ערימות של תמונות מתוך 3-8 שדות רצופים עם תאים ומחוברים ע&quot;י הסתכלות לתוך ערוץ DAPI. לכמת את מספר הריסים העיקריים באמצעות ImageJ / פיג&#39;י. בדרך כלל, להשתמש בכלי &quot;מונה Cell&quot; של תוספי ImageJ&gt; לנתח בתיבת הדו-שיח כדי לספור את התאים עם ריסי GPCR חיוביים; תחזיות מקסימליים מארובות של תמונות ניתן גם לייצא מ עוצמת תמונה ופרמטרי ניגוד דומה ImageJ / Fiji.Use עבור כל תמונות מאותו הניסוי לספירה ועניין יצוא. </li></ol> 6. Transfection של Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד תאים ניתק כדי coverslips עבור 24 h. השתמש צפיפות תאים בדרך כלל בין 75,000 ו 150,000 תאים 500 μL של המל&quot;ל בינוני באר אחד של צלחת 24-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 25 μL של המדיום סרום מופחת 1.5 μL של מגיב transfection בתוך microtube 0.5 מ&quot;ל על ידי vortexing עבור 5 ים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ&quot;א רעלן פנימי חופשית microtub 0.5 מ&quot;ל נפרדדואר המכיל 25 μL של תקשורת סרום המופחתת ומערבבים ידי vortexing עבור 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 μL של מגיב transfection ל- DNA המכיל שני microtube ומערבב ידי vortexing עבור 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת מהצינור המכילים DNA אל microtube הראשון ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 10-15 דקות ב RT. לאחר הדגירה, בעדינות ומוסיפים את תערובת transfection dropwise אל בארות על גבי מדיום NSC (500 μL / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום 24 h-transfection פוסט לשלוט (מדיום NSC) בינוני או בינוני רעב (500 μL / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי שינוי בינוני עד 4% PFA לאחר 24 h ולבצע immunostaining; בדרך כלל, עד יעילות transfection 10% מתקבל באמצעות פרוטוקול זה. </li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן, אנו מתארים שיטה להפקה ולשמור תרבויות neurosphere מן SVZ עכבר המבוגר. כמה נקודות רלוונטיות לגבי התרבויות הן כדלקמן. ראשית, בגדלים של הספירות הם בדרך כלל בין 50 ל - 200 מיקרומטר. מניסיוננו, כאשר neurosphere מקבל גדול יותר 300 מיקרומטר קוטר, הזמן האופטימלי עבור passaging הוחמץ. תחומים גדולים אלה מכילים תאים מתים בתוך הליבה. שנית, כפי neurospheres משמשת ללמוד בתאי גזע / ובתאים עצביים, חשוב להשתמש EGF ו FGF-בסיסי (bFGF) כדי לשמור על stemness של תאים אלה. לכן, הגורמים להשרות התמיינ...

Cilium העיקרי הוא תא התת-תאי דינמי המבוסס microtubule שמתפקד אנטנה חושית בתיאום מסלולי איתות הסלולר, כולל סוניק הקיפוד (ששש) מסלול במהלך ההתפתחות העצבית עובריים 1, 2, ו איתות התת-תאי ממודרת פונקציה 3 העצבית מבוגר, 4 . איתות רכיבים של מסלולים אלה, כגון קולטן ששש טלוא 5; מסלול מפעיל smoothened (SMO) 6; ו Gpr161 7, גידול G יתום חלבון בשילוב קולטן (GPCR) כי באופן שלילי מסדיר את מסלול ששש, למקם את הריסים באופן דינמי. GPCRs המרובה דווח למקם את הריסים בנוירונים במוח 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. פגמי ריסי מסלולי איתות שנוצר ריסים להשפיע רקמות מרובות נקראים ביחד כמו ciliopathies 17, 18, 19. הספקטרום המחלה ciliopathy קרובות כולל ליקויים נוירו-התפתחותיות, כגון הפרעות craniofacial 20, 21, 22. בנוסף, cilia העיקרי בנוירונים ההיפותלמוס לווסת מסלולי שובע מרכזיים, ופגמים לגרום להשמנה מרכזית 23, שיקוף השמנת ciliopathies syndromic כגון תסמונת Bardet Biedel 24. בנוסף, קולטן ונוירופפטידים איתות הריסים מסדיר centrשובע אל מסלולי 11, 14. לוקליזציה ריסי adenylyl cyclase III (ACIII) ו GPCRs כגון קולטן סומטוסטטין 3 ב נוירונים בהיפוקמפוס לגרום למומים זיהוי האובייקט הרומן וגירעונות זיכרון 25, 26 ו- Parallels חוסר שלמות ריסי 27. היבטים התפתחותיים של איתות שנוצר הריסים קשורות בטבורן הומאוסטזיס רקמות; בפרט, הריסים חשובים להתקדמות ומדולובלסטומות ששש-תת הנובעים אבות גרגיר של 28 המוחון, 29. לפיכך, cilia העיקרי ממלא תפקידים חשובים במהלך עוברית, לאחר הלידה, ואת ההתפתחות עצבית מבוגרת ותפקוד. בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזור subventricular (SVZ) של החדר הלטרלי, אזור subgranular של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס, ואתאזור חדרית של החדר השלישי בהיפותלמוס ביונקים 30, 31, 32. NSCs הם מולטיפוטנטיים, בעלי יכולת התחדשות עצמית, והם חשובים להתפתחות המוח ורפואה רגנרטיבית 30. רוב NSCs ב SVZ הם שקטים ובעלי cilium העיקרי בודד כי, במקרים רבים, משתרע אל החדר לרוחב 33. אותות cilium העיקריים באמצעות הלוקליזציה של קולטנים שונים, להמרצת תגובה תאית במורד זרם, במיוחד ביחס ששש, TGFβ, ומסלולי טירוזין קינאז קולטן 2, 34, 35, 36. מאז cilia העיקרי להאריך לתוך החדר לרוחב, משערים כי cilia העיקרי לזהות ציטוקינים בנוזל השדרה (CSF) כדי להפעיל NSCs 37 </sעד&gt;. מחקרים אחרונים מראים כי מסלול איתות ששש ו הריסים העיקריים הם קריטיים עבור הפעלת תאי גזע של תיקון והתחדשות של רקמות מרובות, כולל אפיתל ההרחה, ריאות, כליות 38, 39, 40, 41. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם CSF מתקשר עם NSCs והאם cilia העיקרי מעורבים אינם ידועים. NSCs החסיד בתרבות הוא ריסים; למקם רכיבים מסלולים ששש, כגון SMO ו Gpr161 ב ריסים; והם ששישה 42 תגובה. לפיכך, NSCs יכול לשמש כמערכת מודל חשובה ללמוד את המסלול שהשישה, סחר ריסים, ומסלולי בידול עצביים. בנוסף, נוירונים נבדלים NSCs יכולים לשמש גם עבור מבחני סחר ריסים. Neurospheres הם היוו של צבירי תאי &quot;פנויות&quot; הנובעים מההפצה של neural גזע / ובתאי תאים שגדלים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיות ומשטחי nonadhesive 43, 44. Neurospheres לשמש חשובה דגמים בתרבות במבחנה ללמוד גזע עצביים / ובתאים בפיתוח נורמלי למחלה 31, 45, 46, 47. כאן, אנו מתארים assay מבוסס-neurosphere עבור culturing גזע עצביים / ובתאים ו לבידול לתוך הנוירונים / גליה. אנחנו במיוחד להדגיש את הסחר של איתות רכיבי ריסים של גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל (איור 1). בניגוד נוירונים culturing העיקרי, neurospheres העיקרי הם יחסית קל תרבות, ניתנים קטעים מרובים להקפיא להפשיר מחזורים, והוא יכול לעבור התמיינות לתוך הנוירונים / גליה. חשוב לציין, קבענו כי עצבי נגזר neurosphereתאי גזע / ובתאים נוירונים בדיל הם ריסים בתרבות LOCALIZE מולקולות איתות רלוונטיות לתפקוד ריסים בתאים אלה. Neurosphere מבוסס שיטות culturing יכולות לשמש כמערכת מודל אידיאלית ללימוד סחר ciliogenesis ואת הריסים ב NSCs נוירונים בדיל.

<table><tbody><tr><td>זכוכית כיסוי עגול 12 מ"מ</td><td>פישרברנד</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>פלקון</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי, מכסה ניתן להחלקה</td><td>פישרברנד</td><td>FB0875714G</td><td>צלחת 10 ס"מ</td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים M</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 נוגדן משני</td></tr><tr><td>Arl13B, Clone N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף תזונה (50X),</td><td></td><td></td><td></td> צנטריפוגה B27 17504001 ThermoFisher Scientific ללא סרום</tr><tr><td></td><td>תרמו מדעי</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון קריוגני</td><td>קורנינג</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר</td><td>סיגמא</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>תבניות דגימת ויניל חד פעמיות</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ</td></tr><tr><td>תמיסת מלח 10X עם חוצץ פוספט של Dulbecco, שונה, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td> <td>Fluoromount-GSouthern Biotech</td><td>0100-01</td><td>פתרון הרכבה</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG1 נוגדן משני, Alexa Fluor 555 מצומד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>עז נגד עכבר IgG1, Alexa 555 נוגדן</td></tr><tr><td>משני עז נגד עכבר IgG2a נוגדן משני, Alexa Fluor 555 מצומד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>עז נגד עכבר IgG2a, Alexa 555 נוגדן משני</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>תוצרת בית</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>אנושי bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 מ"מ נויבאואר משופר עמוק 0.100 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>איזותזיה</td><td>הנרי שיין</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>איזופלואורן</td></tr><tr><td>למינין מקרום הבסיס של אנגלברת-הולם-נחיל סרקומה</td><td>סיגמא</td><td>L2020</td><td>למינין</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>סיגמא</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>מר פרוסטי</td><td>נלג'ן&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N-2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת OCT</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>חלבון EGF אנושי רקומביננטי,</td><td>מערכות CF R ו-D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>EGF מספריים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>שקופית סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ</td><td>פישר מדעי</td><td>12-550-15</td><td>שקופיות</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>ביו-ראד</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td> צלחת 6 בארות <td>טריפסין</td></tr><tr><td>COSTAR, עם מכסה תחתון שטוח משטח חיבור נמוך במיוחד פוליסטירן,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>3471</td><td>צלחת 6 בארות מחייבת נמוכה במיוחד</td></tr> <tr><td>ובטא;-tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

הסיליום הראשוני חשוב באופן בסיסי לשגשוג תאי גזע/אב עצביים ולהתמיינות עצבית במהלך החיים העובריים, לאחר הלידה והבוגרים. בנוסף, לרוב הנוירונים המובחנים יש ריסים ראשוניים המכילים קולטני איתות, כגון קולטנים מצומדים לחלבון G, ומולקולות איתות, כגון אדניליל ציקלאזות. הסיליום הראשוני קובע את פעילותם של מסלולי התפתחות מרובים, כולל מסלול הקיפוד הקולי במהלך ההתפתחות העצבית העוברית, ומתפקד גם בקידום איתות תת-תאי ממודר במהלך תפקוד עצבי בוגר. באופן לא מפתיע, פגמים בביוגנזה ובתפקוד ראשוניים של ריסים נקשרו לחריגות התפתחותיות של המוח, השמנת יתר מרכזית וליקויי למידה וזיכרון. לפיכך, הכרחי לחקור ביוגנזה ראשונית של ריסים וסחר ריסים בהקשר של תאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים. עם זאת, שיטות תרבית לתאי עצב ראשוניים דורשות מומחיות רבה ואינן ניתנות למחזורי הקפאה-הפשרה. בפרוטוקול זה, אנו דנים בשיטות תרבית עבור אוכלוסיות מעורבות של תאי גזע/אב עצביים באמצעות נוירוספרות ראשוניות. שיטות התרבות המבוססות על נוירוספרה מספקות את היתרונות המשולבים של חקר תאי גזע / אב עצביים ראשוניים: התאמה למעברים מרובים ומחזורי הקפאה-הפשרה, פוטנציאל התמיינות לנוירונים/גליה, ויכולת טרנספקטיביות. חשוב לציין, קבענו שתאי גזע/אב עצביים שמקורם בנוירוספירה ונוירונים מובחנים ריסניים בתרבית וממקמים מולקולות איתות הרלוונטיות לתפקוד הריסי בתאים אלה. תוך שימוש בתרבויות אלה, אנו מתארים עוד שיטות לחקר ריסים וסחר ריסים בתאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים. שיטות מבוססות נוירוספירה אלה מאפשרות לנו לחקור מסלולים תאיים המווסתים על ידי ריסים, כולל קולטן מצומד לחלבון G ואיתות קיפוד קולי, בהקשר של תאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים.

לאחר ציפוי התאים מן SVZ במדיום המל&quot;ל במשך שבוע, neurospheres צף נצפו (איור 2 א). הגדלים של התחום נעים בין 50 לבין 200 מיקרומטר. כדי לבחון אם הספירות היו שמקורם בתאי גזע / ובתאים עצביים, את neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים. לאחר מכן הם היו immunostained נגד סמן תא גזע / ובתאים העצביים, Nestin. יומיים נדרשו כדי לאפשר את הכדורים אל לצרף את coverslips לגדול כמו בשכבה של תאים. בשכבה ש...

Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות.

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להשתמש בשיטות תרבית מבוססות נוירוספירה לתאי גזע ותאי פרוגניטור עצביים ראשוניים כדי לחקור את הביוגנזה של השליש הראשוני ואת התעבורה בתוכו. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השלישי הראשוני, כגון ביוגנזה של השליש ותעבורה של מולקולות לשליש הראשוני, בתאי גזע עצביים ראשוניים, תאי פרוגניטור עצביים ונוירונים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בקריטריונים של תאים ראשוניים של תאי גזע עצביים, תאי אב עצביים ונוירונים כדי לנתח ביוגנזה ומסלולי סיליאריים בהקשר של השערה ראשונית. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שגידול של תאי גזע עצביים הוא מאתגר מבחינה טכנית עבור מתחילים. נראה כי הדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן ניתן ללמוד בקלות את שלבי הדיסקציה של המערך הצדי (lateral ventricle) ושלבים כגון גידול נוירוספירות וכימות של שערות ראשוניות על ידי צפייה בשלבים המכריעים.התחל את הפרוצדורה עם אזור סוב-ונטריקולרי (subventricular zone) של המדור הצדי שבודד מעכבר בוגר באמצעות שיטת דיסקציה של הרקמה כולה (whole mount dissection). העבר את הרקמה המכילה את ה-SVZ לתוך מבחנה של 1.5 ml. הוסף 500 µL של 0.05% Trypsin-EDTA ב-PBS והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C באמבט מים.לאחר הדגירה, הוסף 500 µL של תמיסת עצירה וערבב בעדינות באמצעות פיפטינג 20 עד 30 פעמים עם טיפ של 1 mL. הימנע מיצירת בועות אוויר במהלך הפיפטינג. לאחר מכן, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך שמונה דקות.שפכו את הנוזל העליון (supernatant), לאחר מכן הוסיפו 1 milliliter של PBS והשביו את התאים למצב של סספנסיות על ידי פיפוט עדין חמש פעמים באמצעות טיפ של 1 milliliter. סבבו בצנטריפוגה ב-500 times G למשך שמונה דקות. לאחר מכן, שאבו את המצע באמצעות טיפ של 1 milliliter והוסיפו 1 milliliter של basal medium.לאחר ספירת התאים, זרע את התאים מאזור SVZ אחד לצלחת של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר של מצע NSC ותרבל אותם ב-37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide. לאחר חמישה עד שבעה ימים, ניתן להבחין בנוירוספירות. כדי לנתח תאים בנוירוספירות צמודות באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית, העבר 1 מיליליטר של מצע המכיל מספר נוירוספירות לשפופרת של 1.5 מיליליטר וסבב בצנטריפוגה במהירות של 500 times G למשך שמונה דקות.לאחר הסרת המצע, קבעו את הספירות באמצעות 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות. לאחר הסרת ה-paraformaldehyde, הדגרו את הספירות ב-30% sucrose למשך לילה. לאחר מכן, ביצעו צנטריפוגה פעם נוספת.שטפו עם PBS. לאחר מכן, לאחר סבב צנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, התאימו פפטה עם טיפ של 1 milliliter חתוך והעבירו 500 microliters של תמיסת OCT על גבי הנוירוספירות.העבר את תמיסת ה-OCT המכילה את הנוירוספירות לתבנית הקפאה פלסטית חד-פעמית. לאחר מכן, הקפא את התבנית על קרח יבש למשך 15 דקות לפחות. חתוך סריקות באמצעות קריוסטט.כדי להדמיאן את תאי הגזע בתוך הנוירוספירה, בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית נגד הסמן של תאי הגזע Nestin. כדי להדמיאן את הריסונים הראשוניים (primary cilia) בנוירוספירה, בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית נגד ARL13B. התחילו בניסוי זה יום עד יומיים לאחר זריעת תאי גזע עצביים מפוהקים ואדהרנטיים על לוחות כיסוי מצופים ב-Poly-L-Lysine וב-Laminin.החליפו את המצע בבארות הניסוייות למצע הרעבה, ובבארות הביקורת למצע NSC טרי. דגרו למשך 24 שעות נוספות. למחרת, קבעו את התאים באמצעות 4%paraformaldehyde ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבוע, שטפו עם PBS פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו אימונופלואורסצנציה (immunofluorescence) בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. הצמידו את הזכוכיות כיסוי באמצעות תמיסת הצמדה.לאחר מכן, ייבשו את זכוכית העצית למשך לילה בטמפרטורת החדר ובחושך. למחרת, רכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ אורינומי (compound microscope) בהגדלה הנדרשת. יש לשלוט במצלמת המיקרוסקופ ובעדשות באמצעות התוכנה הנלווית.יש לבצע מספיק חתכי-z במרווחים של 0.5 עד 0.8 מיקרון. לצורך ניתוח כמותי של לוקליזציה שומית בתאים דבקים, יש לבחור בין שלושה לשמונה שדות עוקבים של תאים בצפיפות גבוהה (confluent) באמצעות צפייה בערוץ ה-DAPI. יש לרכוש מחסניות תמונות (stacks) מכל שדה.כמת את מספר השלישיות הראשוניות באמצעות ImageJ. פתח את תיבת הדו-שיח Plugins Analyze ובחר בכלי Cell Counter כדי לספור את התאים עם שלישיות חיוביות ל-GPCR. השתמש בפרמטרי עוצמת תמונה וניגודיות דומים עבור כל התמונות מאותו ניסוי לצורכי ספירה וייצוא.24 שעות לאחר גידול תאים מפוצלים במצע NSC או במצע הרעבה, התאים קובעו ונצבעו בשיטת אימונופלואורסצנציה נגד GPR161 המופיע בירוק, ARL13B המופיע באדום, ו-DNA המופיע בכחול. שרישונים (cilia) חיוביים ל-GPR161 נצפים בתאי ביקורת משמאל, ובתאים מורעבים מימין, כפי שניתן לראות בתמונות המוגדלות הללו.החצים הלבנים וראשי החצים מצביעים על שלשולות חיוביות ושליליות ל-GPR161, בהתאמה. תמונה זו מציגה כימות של תאים בעלי שלשולות חיוביים ל-ARL13B. הכימות בוצע משני שדות ראייה, כל אחד משני חזרות טכניות של ניסוי בודד.אחוז התאים המצויים עם שריש החיוביים ל-ARL13B עולה בעקבות הרעבה. תמונה זו מציגה כימות של GPR161 הממוקם בשרישים חיוביים ל-ARL13B בתאי ביקורת ובתאים מורעבים. אחוז ה-GPR161 הממוקם בשרישים חיוביים ל-ARL13B עולה אף הוא בעקבות הרעבה.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בפחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטה נוספת לתרבית של תאים המופקים מגידול ראשוני כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תפקידם של הריסונים (cilia) בתהליך היווצרות הגידול. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הריסונים הראשוניים לחקור את הביוגנזה והתעתוק של הריסונים במערכות ראשוניות מבוססות נוירוספירה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ניתוח של cilia ראשוניים בתאי גזע עצביים, בתאי אב עצביים ובנוירונים המופקים מתרביות המבוססות על נוירוספירות.

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

השימוש בבינה מלאכותית (Ai) לניתוח תמונות מתגלה כגישה חזקה, פחות מוטה ומהירה בהשוואה לשיטות נפוצות. כאן אימנו את Ai לזהות אברון תאי, ריסים ראשוניים, ולנתח תכונות כגון אורך ועוצמת הכתמים באופן קפדני ושחזורי.

גישות בינה מלאכותית להערכת ריסים ראשוניים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

שיטה זו מתארת את ניצול האות האנדוגני במודל עכבר טרנסגני ARL13B-CENTRIN-2 להדמיית ריסים ראשוניים באתרם, בתלת מימד על פני שטחים גדולים של רקמה מינרלית, מאיסוף רקמות ועד לניתוח ארגון הריסים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על סוגים אחרים של רקמות.

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

חקור את תהליך הביוגנזה והתנועה של ריסים ראשיים בתאי גזע עצביים באמצעות שיטות תרבית neurosphere. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסלולים ציליאריים בהקשר של תאי עצב פרימריים.

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

גלה סרטונים נוספים