בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בשיטות תרבות מבוססות נוירוספרה עבור תאי גזע עצביים ראשוניים ותאי אב כדי לחקור ביוגנזה ראשונית וסחר בסיליום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריסים הראשוניים כגון ביוגנזה של ריסים וסחר של מולקולות ריסים לריסים הראשוניים. בתאי גזע עצביים ראשוניים, אבות עצביים ונוירונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להשתמש בקריטריונים התאיים הראשוניים של תאי הגזע העצביים, האבות העצביים והנוירונים כדי לנתח ביוגנזה ומסלולי ריסים בהקשר של הריסים הראשוניים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שגידול תאי גזע עצביים הוא מאתגר מבחינה טכנית למתחילים. נראה שהדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן דיסקציה של החדר הצדדי ושלבים כמו תרבית נוירוספרות וכימות של ריסים ראשוניים נלמדים בקלות על ידי התבוננות בשלבים הקריטיים.

התחל הליך זה עם אזור תת חדרי של החדר הצדדי שנותח מעכבר בוגר בשיטת דיסקציה של כל הרכבה. הנח את הרקמה המכילה את ה-SVZ בשפופרת של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ב-PBS ודגר 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

לאחר הדגירה, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום עצירה ופיפטה בעדינות 20 עד 30 פעמים בעזרת קצה של 1 מיליליטר. הימנע מהיווצרות בועות אוויר במהלך פיפטינג. לאחר מכן, סובב את התאים ב -500 פעמים G למשך שמונה דקות.

השליכו את הסופרנטנט ואז הוסיפו 1 מיליליטר PBS והשעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג עדין חמש פעמים באמצעות קצה של 1 מיליליטר. צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 פעמים G למשך שמונה דקות. לאחר מכן שאפו את המדיום בעזרת קצה של 1 מיליליטר והוסיפו 1 מיליליטר של מדיום בסיסי.

לאחר ספירת התאים, צלחו את התאים מ-SVZ אחד לצלחת של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר של מדיום NSC ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר חמישה עד שבעה ימים ניתן לצפות בנוירוספרות. כדי לנתח תאים בנוירוספרות מחוברות על ידי צביעה חיסונית, העבירו 1 מיליליטר של מדיום המכיל מספר נוירוספרות לצינור של 1.5 מיליליטר וסובבו מטה ב-500 פעמים G למשך שמונה דקות.

לאחר הסרת המדיום, יש לתקן את הכדורים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. לאחר הסרת פרפורמלדהיד דגרו על הכדורים עם 30% סוכרוז, למשך הלילה. ואז שוב צנטריפוגה.

שטפו עם PBS. לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה כמו קודם, הסר והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, התקן פיפטה עם קצה חתוך של 1 מיליליטר ופיפטה 500 מיקרוליטר של תמיסת OCT על הנוירוספרות.

העבירו את תמיסת ה-OCT המכילה את הנוירוספרות לתבנית הקפאה חד פעמית מפלסטיק. לאחר מכן, הקפיאו את התבנית על קרח יבש למשך 15 דקות לפחות. חותכים קטעים עם קריוסטט.

כדי לדמיין את תאי הגזע בנוירוספירה, בצעו צביעה חיסונית כנגד סמן תאי הגזע נסטין. כדי לדמיין את הריסים הראשוניים בנוירוספירה, בצע צביעה חיסונית כנגד ARL13B. התחל את הניסוי הזה יום עד יומיים לאחר זריעת תאי גזע עצביים מנותקים דביקים על גבי תלושי כיסוי מצופים פולי-L-ליזין ולמינין.

לשנות את המדיום בבארות הניסוי למדיום רעב, ולמדיום NSC טרי בבארות הבקרה. דגירה למשך 24 שעות נוספות. למחרת, תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הקיבוע יש לשטוף עם PBS פעמיים למשך חמש דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר. ואז לבצע אימונופלואורסצנציה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. הרכיב את החלקות הכיסוי עם תמיסת הרכבה.

לאחר מכן, יבש את השקופיות למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. למחרת, רכשו תמונות במיקרוסקופ מורכב בהגדלה הנדרשת. יש לשלוט במצלמת המיקרוסקופ ובמטרות באמצעות התוכנה הנלווית.

קח מספיק חתכי z במרווחים של 0.5 עד 0.8 מיקרון. לניתוח כמותי של לוקליזציה ריסנית בתאים דבקים, בחר שלושה עד שמונה שדות רצופים עם תאים מתכנסים על ידי צפייה בערוץ DAPI. רכוש ערימות של תמונות מכל שדה.

כמת את מספר הריסים העיקריים באמצעות ImageJ. פתח את תיבת הדו-שיח ניתוח תוספים ובחר בכלי מונה תאים כדי לספור את התאים עם ריסים חיוביים של GPCR. השתמש בפרמטרים דומים של עוצמת תמונה וניגודיות עבור כל התמונות מאותו ניסוי למטרות ספירה וייצוא.

24 שעות לאחר תרבית תאים מנותקים במדיום NSC או במדיום רעב תאים התקבעו וצבועים חיסונית כנגד GPR161 המוצג בירוק, ARL13B שנראה אדום ו-DNA מוצג בכחול. ריסים חיוביים ל-GPR161 נצפים בתאי ביקורת משמאל, ותאים מורעבים מימין. כפי שניתן לראות בתצוגות המוגדלות הללו.

החצים הלבנים וראשי החצים מצביעים על ריסים חיוביים ושליליים של GPR161, בהתאמה. תמונה זו מציגה כימות של תאים ריסניים חיוביים ARL13B. הכימות מבוצע משני שדות ראייה, כל אחד משני שכפולים טכניים של ניסוי יחיד.

אחוז התאים הריסים החיוביים ל-ARL13B עולה עם הרעב. תמונה זו מציגה כימות של GPR161 המתמקם בריסים חיוביים של ARL13B בתאי ביקורת ותאי רעב. אחוז ה-GPR161 המתמקם בריסים חיוביים ל-ARL13B, עולה גם הוא עם הרעב.

לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך פחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה נוספת לתרבית תאים ראשוניים שמקורם בגידול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תפקיד הריסים ביצירת הגידול. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הריסים הראשוניים לחקור ביוגנזה ריסנית וסחר במערכות מבוססות נוירוספרה ראשונית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח ריסים ראשוניים בתאי גזע עצביים, אבות עצביים ונוירונים שמקורם בתרבויות מבוססות נוירוספרה.