Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר כלי דם מהונדסים בכל גודל. טכניקה זו מאפשרת הנדסה אמינה ויעילה של כלי הדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר כלים בכל גודל בקלות ובאמינות.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשדנו כיצד להנדס צינור של רקמה והשווינו את השיטה שלנו לבניית מנהרות כבישים, מקטע אחד בכל פעם. כדי להכין את התוספות המודפסות בתלת מימד הוסף תחילה שכבה דקה של שניים, ארבעה או שישה מ"ל של סיליקון לא נרפא לתחתית צלחת פטרי בגודל 35, 60 או 100 מילימטר, בהתאמה. כדי ליצור עמודים ללוחות 35 מ"מ, שפכו PDMS לתוך צלחת אחרת של 100 מ"מ לגובה של שבעה מ"מ, וחממו את ה-PDMS על פלטה חמה ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש.

כאשר ה-PDMS נרפא, השתמש באגרוף ביופסיה של חמישה מ"מ כדי ליצור עמודים גליליים. שימוש בכמות קטנה של PDMS לא נרפא כדי להדק את הצילינדרים למרכז כל צלחת 35 מ"מ. הנח מעטפת חיצונית מודפסת בתלת מימד בקוטר של כ-66.7 מ"מ במרחק שווה מהעמוד בלוחות 100 מ"מ.

לפני שה-PDMS בתחתית לוחות ה-60 וה-100 מ"מ נרפאים, הנח עמודים מודפסים בתלת מימד בקוטר 10 ו-20 מ"מ במרכז כל לוחות 60 ו-100 מ"מ בהתאמה. הניחו לכלים להתרפא באוויר הפתוח על משטח החימום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש, ולאחר מכן שמונה עשרה שעות של הסרת גז פולימר. בתום הסרת הגז יש לעקר את החלק הפנימי של כל הצלחות באתנול 70% ולכסות כל צלחת למשך 30 דקות.

לאחר מכן שאפו בזהירות את האתנול מכל צלחת כדי לאפשר ייבוש באוויר. כאשר הצלחות יבשות, העבירו אותן לארון בטיחות ביולוגי ליד המכסים המתאימים שלהן עם הפנים כלפי מעלה. ולחשוף את החומרים לאור UV למשך 30 דקות להשלמת העיקור.

להכנת פיברין הידרוג'ל יש להוסיף תחילה 0.5, 1.1 ו-1.81 מ"ל של מדיום גידול בתוספת ג'ל פיברין ו-TGF בטא 1 עד 35, 60 ו-100 מ"מ בהתאמה. לאחר מכן, הוסף 40, 88.4 ו-145 מיקרוליטר תרומבין ללוחות 35, 60 ו-100 מ"מ בהתאמה, וסובב בעדינות כל צלחת ביד. כאשר התרומבין מפוזר באופן שווה מוסיפים 160, 354 ו-580 מיקרוליטר של פיברינוגן בתנועה מעגלית טיפתית לתערובת המדיום תרומבין בצלחות 35, 60 ו-100 מ"מ, בהתאמה, ומערבבים בעדינות את הצלחות כדי לפזר את ההידרוג'ל באופן שווה.

הניחו להידרוג'ל להתרפא במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נסה את תאי השרירים החלקים המעניינים, מורחב בלוחות תרבית תאים של 150 מ"מ, ואסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגליזציה. השעו מחדש את הכדורים בשלושה מ"ל של מדיום התמיינות והשתמשו בפיפטה של שני מ"ל כדי לשלול במרץ את התאים כדי לפרק כל גושי תאים.

לאחר הספירה, פצלו את התאים ל -2/10 10 עד ה-6, 1/10 10 עד ה-7 ו-1.4 x 10 לתאים השביעיים לכל מ"ל בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל, המסומנים על פי לוחות התרבות המתאימים להם. הוסף מדיום בידול לכל צינור כדי לקבל נפחי זריעה סופיים של שניים, ארבעה וחמישה מ"ל עבור כל צלחת של 35, 60 ו-100 מ"מ בהתאמה לאחר מכן, הוסף בזהירות את תמיסות התאים טיפה על ההידרוג'ל המוכן בכל צלחת מתאימה להרחבה בחממת תרבית התאים. לאחר יומיים עד ארבעה ימים הטבעות יתכווצו לחלוטין לכיוון העמדות שלהן.

אז הוסף 10, 20 או 35 מ"ל של TGF Beta 1 לכל טבעת 35, 60 ו-100 מ"מ, בהתאמה. כדי להרכיב את מבנה כלי הדם לכלי 35 מ"מ, חתכו קטע של שני אינץ' מהחלק העליון של 50 מ"ל של צינור חרוטי מפוליקרבונט ו-PDMS הדביקו את הקצה העליון לצלחת של 35 מ"מ כדי ליצור צלחת גבוהה לערימת טבעות. עבור הכלי בגודל 60 ו-100 מ"מ, לוחות ערימת טבעות גבוהים חותכים צינור פוליקרבונט בקוטר 1.75 אינץ' למקטעים בגודל 2.5 אינץ' לאורכו כדי לשמש כקירות הצלחת הגבוהים.

עבור תחתית הצלחת הגבוהה, חותכים יריעת פוליקרבונט בעובי 0.125 אינץ 'לחתיכות עיגול בקוטר שני אינץ '. בעזרת מלט ממס אקרילי קושרים את חלקי צינור הפוליקרבונט לחתיכות החתוכות העגולות. הדפס בתלת מימד עמודים בקוטר חמישה, עשרה ו-20 מ"מ באורך 50 מ"מ.

לאחר מכן הוסף 10 מ"ל של סיליקון לא נרפא לכל מיכל, והנח במרכז כל עמוד מודפס בתלת מימד בכל מיכל 35, 60 ו-100 מ"מ לפני שה-PDMS נרפא לחלוטין. והניחו את הכלים על פלטה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש. כאשר ה-PDMS נרפא, יש לעקר את הצלחות עם 70% אתנול כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן לחשוף את מיכלי האתנול המיובשים לאור UV למשך 30 דקות.

כעת, השתמש בשני זוגות מלקחיים עדינים מאוד כדי להרים בזהירות תחילה צד אחד, ולאחר מכן את הצד השני, של טבעת הידרוג'ל חלקה מגולגלת היטב מהעמוד שלה. לאחר מכן החלק בזהירות צד אחד של הטבעת ולאחר מכן את הצד השני על העמוד הגבוה של המיכל הגדול יותר בגודל הבא. עבודה היקפית, בתנועות הדרגתיות עדינות, דחף לאט את הטבעת במורד העמוד, ולאחר מכן ערם טבעות רקמה נוספות עד לקבלת אורך הכלי הרצוי.

כאשר כל הטבעות נערמו סובב את הלוחות כך שהעמודים יהיו מקבילים למשטח העבודה, והוסף בעדינות 40, 80 ו-160 מיקרוליטר תרומבין למשטח החיצוני של כל כלי 35, 60 ו-100 מ"מ בהתאמה תוך סיבוב איטי של הלוחות. לאחר מכן, הוסף 40, 80 ו-160 מיקרוליטר של פיברינוגן לכל מבנה של 35, 60 ו-100 מ"מ בהתאמה, במהירות ובאופן שווה ככל האפשר תוך סיבוב מהיר של המבנה. התרומבין והפיברינוגן יתייצבו במהירות לג'ל יציב עם הערבוב.

לאחר מכן הוסיפו 20 מ"ל של מדיום התמיינות לכל מיכל בנייה והניחו את הכלים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. ניתוח היסטולוגי מגלה תאיות גבוהה בכל הגדלים הטבעתיים, עם כמות קטנה של שאריות ג'ל פיברין שנצפתה בקצוות החיצוניים של הטבעות הקטנות. בטבעות הגדולות יותר חלק מג'ל פיברין משובץ בתכולת התאים, עם סימנים לייצור קולגן הניכרים הן בטבעות הביניים והן בטבעות הגדולות.

ניתוח טבעת רקמות לביטוי אקטין וטרופומיוזין בשריר חלק אלפא מגלה כי כל גדלי הטבעות חיוביים לשני הנוגדנים המאמתים כי פנוטיפ השריר החלק נשמר. בדיקת מתיחה מצביעה על מגמה עקבית של עלייה בחוזק בקורלציה עם הגדלת הטבעת וגודל הכלי בכל שלושת גדלי הטבעות. מספרי זריעת תאים ליצירת גדלי הטבעות השונים תואמים גם לשטח הפנים של הזריעה.

מבני כלי דם אלה מסוגלים גם לעמוד בזרימה עד חמש דקות בקצבי זרימה בין 100 ל-417 מ"ל לדקה, כאשר נצפתה דליפה קלה בלבד במקום שבו הכלים מתחברים למערכת השפע. לאחר השליטה, ניתן להנדס את הטבעות תוך שעה אחת אם הטכניקה מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לערבב היטב את רכיבי ההידרוג'ל כדי להבטיח את הגדרת הג'ל והיווצרות טבעת נכונה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו יצירת טבעות של סוגי תאים אחרים, להנדסת סוגים אחרים של רקמות. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיטת ערימת הטבעות כדי להנדס רקמות כלי דם בגדלים שונים.