Name: הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למדו להעריך את מיקום מיני חמצן תגובתי בתאי זרע של Solea senegalensis באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה משתמש בצבעי פלואורסצנציה DCFH-DA, MitoTracker ו-DAPI כדי לדמות את האינטראקציה בין מיטוכונדריה לגרעין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.

הערה: דגירה Fluorochrome וניתוח קונאפוקלית ייקח לפחות 2-3 h עבור פקד, מדגם שטופלו. חישוב זמן זה אינו כולל עיבוד נתונים. חומרים הדרושים ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. פרוטוקול זה ניתן ליישם טריים או cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis הוא מין דג שמשריץ במים קרים, עבודה תמיד בתנאים קרים (4-7 ° C). ראה איור 1 מראה כללי של הפרוטוקול.
1. עבודת הכנה לפני הניסוי
<ol><li>הכן 1 מ מ המיטוכונדריה כתם מניות פתרון אנליטי כיתה דימתיל סולפוקסיד.</li>
	<li>להכין עם 4 ′ 1 μg/mL, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) פתרון מלאי במים יונים.</li>
	<li>להכין פתרון דומה מאוד mOsm/kg 200 (116 מ"מ NaCl, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 1.8 מ"מ CaCl2, 5 מ מ. HEPES, pH 7.7)</li>
	<li>להכין 2 ′ 4 מ מ, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) מניות פתרון אנליטי כיתה מתנול. הערה: שמור את הפתרונות מניות aliquots ב-20 ° C עד שהוא נדרש.</li>
	<li>להגדיר את microcentrifuge ב 4-7 ° C.</li>
</ol>2. דגימה ההכנה לפני Fluorochrome דגירה
הערה: טיפול עדין spermatozoa רצוי, כאשר pipetting ו- resuspending.
<ol><li>אם עובדים עם תאים cryopreserved, להכין אמבט מים מפשיר ב 40 מעלות צלזיוס Solea senegalensis spermatozoa10. לטבול את הדגימות קש באמבט מים עבור 7 s.</li>
	<li>באמצעות מספריים לחתוך, לרוקן את הדגימה לתוך צינור microfuge, צנטריפוגה ב g x 1000, 4-7 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.</li>
	<li>הסר פלזמה הזרע או פלזמה הזרע עם cryoprotectants מדגם cryopreserved על ידי pipetting כדי למחוק את רכיב כלשהו שעלולה להפריע פרוטוקול מוכתמים.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 50-100 μL של 4 ° C 200 mOsm/kg פתרון דומה מאוד.</li>
	<li>לקבוע ריכוז הזרע נויבאואר או חדר הספירה דומה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.</li>
	<li>לדלל התליה תא עד ל- 1-2 x 106 תאים למ"ל באמצעי אחסון הסופי של 0.5 מ ל 4 ° C הכפיל פתרון.</li>
</ol>3. fluorochrome דגירה
הערה: חייבים להיות מטופלים Fluorochromes בתנאי אור נמוך, במיוחד כאשר בפתרון.
<ol><li>להוסיף 3.125 μL של DCFH-DA פתרון מניות (הריכוז הסופי במדגם: 25 μM) כדי דילול דגימת עבודה. דגירה ב 4-7 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות חושך10.</li>
	<li>לאחר 30 דקות, להוסיף 0.5 μL של הפתרון מניות דאפי (הריכוז הסופי במדגם: 2 μM) ו- 0.5 μL של המיטוכונדריה כתם פתרון מניות (הריכוז הסופי במדגם: 100 ננומטר) לדגימת. דגירה בשני fluorochromes 10 דקות בחשכה.</li>
</ol>4. לדוגמה כהכנה מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>לאחר זמן הדגירה, centrifuge התליה תא ב g x 1000, 4-7 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.</li>
	<li>הוסף של 10-20 μL של mOsm/kg 200 פתרון דומה מאוד.</li>
	<li>מקום 5 μL של השעיה תא מרוכז ירידה בשקופית.</li>
	<li>. בזהירות, לשים שקופית כיסוי על ההכנה, לאטום אותו עם פולין. ברגע הפולני הוא יבש, ההכנה הוא מוכן מיקרוסקופיה קונפוקלית.</li>
</ol>5. קונאפוקלית ההתקנה לפני הניסוי
הערה: בהתאם המיקרוסקופ, DCFH-DA יכול להיות "שרוף". ליצור את התנאים הטובים ביותר עם מדגם שאינו יקר קודם.
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ, לייזרים, מצלמה, המחשב פועל המיקרוסקופ.</li>
	<li>הגדר לייזרים עירור לוקח בחשבון את ערכים מרביים עירור, פליטה של כל fluorochrome:<ol>
<li>. דאפי, לשימוש של עירור היותר 358 nm ומקסימום של פליטה של 465 nm.</li>
		<li>לשימוש הכתם מיטוכונדריאלי, עירור של לכל היותר 644 nm ומקסימום של פליטה של 662 ננומטר.</li>
		<li>לשימוש DCFH-DA, מקסימום של עירור של 504 nm ומקסימום של פליטה של 525 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התחל לעבוד במטרה X 25 למקד spermatozoa. בחרו בערוץ דאפי להתרכז בגלל fluorochrome הזה מדווח העוצמה הגבוהה ביותר. ברגע התאים ממוקדים, להשתמש 63 X או המטרה X 100 הערכה יסודית מכיוון Solea senegalensis spermatozoa גודל הוא כ-2 μm.</li>
	<li>בכל אחד מהערוצים, למטב את חריר, לרווח את המתח. באותו אופן, כוונון ההיסט של דיגיטלי כדי להפחית את הרקע. לאחר כל הפרמטרים הממוטבות את fluorochrome להשתמש, לשמור את ההגדרות. עבור ניסוי שגרתי בודד תא הזרע Solea senegalensis השתמשנו הבאות (פרמטרים אלה עשויים להשתנות ניסוי): חריר 1 ואת המתח רווח של 750 V.</li>
</ol>6. רכישת תמונות
<ol><li>בחר את התנאים באיכות הרצויה עבור רכישת התמונה. להגדיר הגדרות רכישה כמו עומק סיביות, פורמט התמונה, עובי גיליון האור ובחרו תאורה צדדית יחיד. עבור ניסוי שגרתי בודד Solea senegalensis spermatozoa השתמשנו הבאות (פרמטרים אלה עשויים להשתנות ניסוי): מסגרת בגודל 1024 px; סיביות לפיקסל 16; מהירות סריקה של 2-4).</li>
	<li>פתח, מרכז את אזור הסריקה כדי להתחיל לקחת תמונה של השדה.</li>
	<li>באמצעות הכלי ' חיתוך ', בחר את האזור עניין והקש בשידור חי.</li>
	<li>בעזרת הכלי מחוון טווח, כוונון ההיסט של דיגיטלי כדי להפחית את הרקע. לעשות את זה בכל אחד מהערוצים ולקחת את התמונה.</li>
	<li>בדוק את האיכות של ערוצים נפרדים עבור כל fluorochrome ושילובים שלהם.</li>
</ol>7. יצירת וידאו תמונה תלת-ממדית
<ol><li>Z-מחסנית רכישה הגדרות.<ol>
<li>בחר באפשרות Z-מחסנית בתוכנה.</li>
		<li>בחר בתא יחיד, קבוצה של תאים או אזור עניין ולהתמקד זה.</li>
		<li>מפריד את Z-המחסנית עם האפשרויות 'הראשון פרוסה' ו- 'הוגן' ולהקים הצעד z מרווח 0.2 מיקרומטר עם העזרה של המוקד משובחים. בחרו ' ערוץ דאפי כדי להתרכז בגלל fluorochrome הזה עשוי לדווח על העוצמה הגבוהה ביותר, באפשרותך לבחור בקלות את כל הראש spermatozoa. לבחור את הפרמטרים רכישה אופטימלית עבור כל ערוץ, להפעיל את הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את הניסוי Z-מחסנית. לפצל את הערוצים ולצפות הלוקליזציה של כל אות בתוך התאים.</li>
	<li>Z-מחסנית תהליך.<ol>
<li>רינדור נפח: לאחר סיום הניסוי, בחר את האפשרויות של התוכנה לעיבוד Z-מחסנית ובחרו אמצעי האחסון רינדור אפשרות. בחר את מספר צעדים, את מעלות סיבוב (360 מעלות). שמור את הקובץ עם סיומת. וידאו.</li>
		<li>טכנולוגיית סטריאו: לבחור את טכנולוגיית סטריאו אפשרויות חלון תהליך. כלי זה מאפשר ליצור תמונה 3D וידאו עם פצל ערוצים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12. גורם מכריע אחד זה יכול להיות מכריע לקראת אפקט חיובי או שלילי הוא לא רק רמות ROS, אלא גם לוקליזציה תאיים ROS. אחת ההשפעות המזיקות של ROS מפיק DNA נזק9 , ולכן נוכחו...

ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-2-3.
הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג'ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפקוד הרבייה אצל אנשים נולדו בשבי עקב מחסור של חיזור. עובדה זו הופכת את הזרע הקפאה קריוגנית חייב להיות זמינות הזרע להפריה מלאכותית. עם זאת, הקפאה קריוגנית יכול להיות מקור של סטרס חמצוני זה יכול להיות מזיקה spermatozoa4 כמו מחקרים דיווחו על השפעה מיטיבה של תוספי נוגדי חמצון. ROS עיכוב באמצעות נוגדי חמצון מיטוכונדריאלי במיקוד היה מועיל הדיווחים על הקפאה קריוגנית זרע שפמנון צהוב5.
לכן, הרמות של ROS דגימות זרע חשובים לדעת, במיוחד לאחר הקפאה קריוגנית6,7 כי מולקולות אלה הוכרו חיסרון זרע הישרדות, פוריות8. יתר על כן, לומד את ההפצה של ROS בתוך התא יכול להיות מכריע להסיק שרמת נזק פוטנציאלי. לדוגמה, רמות נמוכות של ROS בתוך המיטוכונדריה יכול להניח נורמלי ולא תואם עם פונקציית זרע, אך רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יכול להיות סממנים של נזק לדנ א spermatozoa. H2O2 הוא אחד האבחון הרלוונטיים ביותר יכול להשתחרר מן המיטוכונדריה, לחדור לגרעין כי הוא מולקולה קטנה, תשלום-פחות9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) באופן ספציפי יכול לחשוף מי חמצן תאיים פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק. במאמר זה, מוצג עבור מזהה H2O2 לוקליזציה תאיים Solea senegalensis הזרע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול מפורט.

<table><tbody><tr><td>2&פריים;,7&פריים;-דיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>החלקות כיסוי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, כיתה אנליטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>מתנול, כיתה אנליטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerאדום עמוק&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה (מקוררת)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- solea senegalensis spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג'ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .

מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה אידיאלית להערכה ROS תאיים זרע teleost. השילוב של שלוש fluorochromes (דאפי, הכתם המיטוכונדריה, DCFH-DA) שהוצגו במחקר זה (איור 1) מספק הרבה מידע שימושי, זה יכול להיות מיושם במחקר בסיסי ויש יישומים לשיפור תהליכי בשימוש חקלאות מים תעשייתי צמחים, כגון פרוטוקולים הקפאה קריוגנית. סוגים שונים של ניתוח עשוי להתבצע על מנת לתאם תאיים ROS בנוכחות ופרמטרים אחרים: תנועתיות, הכדאיות, דפוסים שונים בין טוב ורע מגדלים, הפעלה של תנועתיות או וריאצי...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את המיקום התוך-תאי של רדיקלים חופשיים של חמצן (reactive-oxygen species) בתוך תאי זרע של Solea senegalensis באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. לרדיקלים חופשיים של חמצן יש השפעות על תקינות תפקוד הזרע, והם גורמים לנזק תאי ברמות שונות. תאי זרע עשויים להיות רגישים במיוחד לעקה חמצונית, כיוון שפרוקסידציה של ליפידים עלולה להשפיע לרעה על הניידות ועל ההפריה.מיני חמצן ריאקטיביים יכולים אף לעורר מסלול אפופטוטי פנימי. פרוקסיד משתחרר מהמיטוכונדריה, והוא מסוגל לחדור לגרעין ולהשפיע על ה-DNA, מכיוון שהוא מולקולה קטנה ללא מטען.לפיכך, ניתן לדעת בדיוק את המיקום של מיני חמצן רבטיביים. בסרטון זה אנו עובדים עם תאי זרע של Solea senegalensis, אך ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מינים קרובים בעלי עניין מסחרי, או עם דגים מסוג Sibrifis או Mirica. להלן מספר דוגמאות לשימוש בטכניקה זו בתחומי הביולוגיה הפיזיקלית-ריאקטיבית או בדבוראות.הערכה של שיקוע קריוגני (cryprecipitation) בהתאם לפרוטוקולים. השוואה של סמני מיני חמצן רהאקטיביים (ROS) לפני ואחרי הפעלת זרע זו. או שניתן לבצע קורלציה בין סמני מיני חמצן רהאקטיביים לבין נושמים טובים וגרועים.ראשית, הכין את תמיסות המלאי (stocks) של הפלואורוכרומים שלך. קח בחשבון כי יש לבצע את הטיפול בפלואורוכרומים בהתאם להמלצות גיליון נתוני הבטיחות (safety-data-sheet). יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת השקילה וההכנה של תמיסות המלאי.שמרו את תמיסות המלאי באליקוטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בשלושה פלואורוכרומים. הצבע הפלואורסצנטי באור אדום רחוק צובע מיטוכונדריה בתאים חיים, וניתן להשתמש בו לצורך לוקליזציה מיטוכונדריאלית.DAPI הוא גשש הנמצא בשימוש נרחב במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצביעת DNA. הוא נקשר בעוצמה לאזורים עשירים באדנין-תימין ב-DNA. כמו כן, 27-dichlorofluorescein diacetate הוא גשש שאינו פלואורסצנטי וחודר תאים.הוא עובר דה-אסטריפיקציה תאית, והופך ל-27-dichlorofluorescein בעל פלואורסצנציה גבוהה בעת חמצון. ניתן להתחיל פרוטוקול זה עם תאי זרע טריים או כאלו שנשמרו בהקפאה. במקרה זה, השתמשנו בדגימה שנשמרה בהקפאה.הכינו אמבט להפשרה בטמפרטורה של 40 °C. נקו את החומרים. תוך שימוש במיגון גוף מתאים, בחרו את הקש הקריו-משומר שלכם.טבול את הקש באמבט למשך שבע שניות. בעזרת מספריים, רוקן את הדגימה שהופשרה לתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה. עבוד תמיד בטמפרטורה של 4 °C.סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך דקה אחת. הסר בזהירות את חומרי ההגנה מהקפאה מבלי לפגוע בתשקובית התאים (sowels). השהה מחדש בנפח קטן של 50 או 100 microliters של תמיסת RINGA.העבר לתא ספירה מסוג bower או לתא ספירה דומה דילול של תרחיף התאים שלך, וספור את התאים. חשב את ריכוז הדגימה. דלל את תרחיף התאים עד למיליון עד שני מיליון תאים למסמיליטר בנפח סופי של 0.5 milliliters בתמיסת RINGA שקולל מראש.יש לטפל בתאי הזרה בעדינות בעת פיפטור ותליה. הוסף 3.125 microliters של תמיסת סטוק של dichlorofluorescein diacetate לתמיסת הדגימה לעבודה. הריכוז הסופי בדגימה הוא 25 micromolar.דגרו בטמפרטורה של ארבע עד שבע מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. לאחר 30 דקות, הוסיפו לדגימה 0.5 µL של תמיסת הסטוק של DAPI ו-0.5 µL של תמיסת הסטוק לצביעת מיטוכונדריה. לשני הפלואורוכרומים זמן דגירה של 10 דקות.הנח טיפה של 5 µL של תרחיף תאים מרוכז על תבנית. הנח בזהירות זכוכית כיסוי על הדגימה ואטום אותה. הפעל את המכשיר ובחר בעדשה עם הגדלה של 100 בלוח הבקרה.אתר את הדגימה במיקרוסקופ והדלק את המנורה. תוכנת המערכת מאפשרת לבחור את הפלואורוכרומים הדרושים ישירות מרשימה. בחר את הסט.DAPI, עם שיא פליטה של 465 nanometers, MitoTracker Deep Red עם שיא פליטה של 662 nanometers, ו-DCF עם שיא פליטה של 525 nanometers. הפנו את הקרן לעיניות. התמקדו בשדה עניין.בחזרה לתוכנה, בחרו את גודל המסגרת. הגדירו מצב סריקה דו-כיוונית לרזולוציה טובה יותר. בחרו את מהירות הסריקה הרצויה.פתחו ומרכזו את אזור הסריקה כדי להתחיל. צלמו תמונה של השדה. בעזרת כלי החיתוך (crop), בחרו את האזור הרלוונטי, ולחצו על Live.לאחר מכן, תבחר את אזור העבודה שלך. בעזרת כלי מחוון הטווח (range-indicator), כוונן את ההיסט הדיגיטלי (digital offset) כדי להפחית את הרקע. בצע זאת עבור כל ערוץ, וצלם את התמונה.זוהי דוגמה לתוצאות. עבור תמונת מיזוג (merge), ערוצים בודדים עבור כל פלואורוכרום, והשילובים ביניהם. זוהי תוכנית סימון של תא זרע של Solea senegalensis.לאחר צפייה בתמונות שנקלטו, ניתן להבחין כי DAPI ו-MitoTracker ממוקמים, כצפוי, בתוך הגרעין ובטבעת המיטוכונדריאלית, בהתאמה. השלב הראשון הוא ביצוע ניסוי z-stack. עברו לחלון ה-z-stack, ובעזרת כפתור המיקוד העדין (fine focus), בחרו את מיקום הרכישה הראשון ואת מיקום הרכישה האחרון.בחרו את פרמטרי הרכישה האופטימליים והריצו את הניסוי. תקבלו תמונות עבור כל סלייד. זוהי דוגמה לתוצאה של zed-stack.ניתן להפריד את הערוצים ולבחון את מיקומו של כל אות בתוך התאים. במעבר לחלון התלת-ממד, ניתן לבחור אפשרויות גרף שונות. ניתן להתאים אישית פרמטרים רבים, ולהפריד או למזג ערוצים.זוהי דוגמה לתצוגות בתלת-ממד המראות דפוסים שונים של מיקום מיני חמצן רבטיביים (ROS) בתוך זרע של Solea senegalensis. בשדה העליון, DCF ממוקם יחד בעיקר עם המיטוכונדריה; לעומת זאת, בשדה למטה, האות מתפשט אל הגרעין. לאחר צפייה בסרטון זה, תדעו כיצד להעריך את הלוקליזציה התוך-תאית של פראוקסיד בתאי זרע אלו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.ניתן למצוא עצות לפתרון בעיות ומידע נוסף בטקסט.

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני ויעיל לבדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז בזרע תוך 60 דקות בסך הכל, ובכך לשפר ביעילות את היעילות של מעבדה אנדרולוגית ואנדרולוגים.

בדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

למדו להעריך את מיקום מיני חמצן תגובתי בתאי זרע של Solea senegalensis באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה משתמש בצבעי פלואורסצנציה DCFH-DA, MitoTracker ו-DAPI כדי לדמות את האינטראקציה בין מיטוכונדריה לגרעין.

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa

גלה סרטונים נוספים