וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

המטרה הכוללת של בדיקת HS-MRM היא להפחית את תופעת ההפרעות של MRM המשפיעה על כימות פפטיד או חלבון על ידי שילוב של הפרדת ניידות יונים של מבשרי פפטיד עם זיהוי ספקטרומטרי מסה ברזולוציה גבוהה של יוני שברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיון הביו-תרפי, כמו גם כימות סמנים ביולוגיים של חלבונים או פפטידים ופרוטאומיקה כמותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי של חלבוני תא מארח בשפע נמוך שעשויים להימצא בחלבונים ביו-פרמצבטיים.

ראשית, לחץ על צור שיטת ניתוח בתוכנת רכישת הנתונים ובחר שיטת יצירה ורכישה ועיבוד. הקלד את שם השיטה ותיאורה, דפדף לתיקיית השיטה ולחץ על הבא. עבור סוג ניתוח, בחר IMS של מפת פפטידים ולחץ על הבא.

לאחר מכן בחר את תצורת המערכת הנוכחית ולחץ על הבא וסיום. בשיטה החדשה שנוצרה, לחץ על לשונית המכשירים, בחר את מנהל הממס הבינארי וערוך את הגדרות השיפוע כדי להשיג הפרדת פפטידים בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. השתמש בדילול שיפוע מ-1 ל-40% ממס B תוך 30 דקות ואחריו שטיפת עמודות של שתי דקות ושיווי משקל של 10 דקות עם זמן ריצה כולל של 45 דקות.

לאחר מכן, בחר את מנהל הדגימה והגדר את טמפרטורת הדגימה ל-10 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת העמודה ל-60 מעלות צלזיוס. בכרטיסיית המכשירים, בחר את מכשיר Vion IMS QTof. בסעיף ההגדרות, בחר רגישות למצב מנתח והזן שלושה קילו-וולט למתח נימי, 100 מעלות צלזיוס לטמפרטורת המקור, 250 מעלות צלזיוס לטמפרטורת המסה, 50 ליטר לשעה לזרימת גז חרוט ו-500 ליטר לשעה לזרימת גז המסה.

לחץ על לשונית הניסוי ובחר MSE בחדות גבוהה למצב. לאחר מכן הזן 100 עבור מסה נמוכה, 2000 עבור מסה גבוהה ו- 0.4 שניות עבור זמן סריקה. בסעיף אנרגיית ההתנגשות, הקלד שישה וולט אלקטרונים להגדרת האנרגיה הנמוכה ובחר רמפה באנרגיה גבוהה בין 15 ל-40 אלקטרון וולט.

עבור זמן הרכישה, השתמש בזמן ריצה מותאם אישית בין חמש ל-30 דקות. לאחר מכן, לחץ על לשונית האפשרויות ובחר את מצב תיקון הנעילה האוטומטי עם מרווח תיקון נעילה אוטומטי של חמש דקות. לאחר מכן בחר באפשרות המשך עם תיקון הנעילה וכדי לוודא שבדיקת הגלאי האוטומטית מושבתת.

בתפריט תצורת המערכת הנוכחית, בחר במכשיר Vion IMS QTof ולחץ על כלים. הזן שלושה קילו-וולט למתח נימי, 40 וולט לדגימת חרוט, 100 וולט לקיזוז מקור, 100 מעלות צלזיוס לטמפרטורת מקור, 250 מעלות צלזיוס לטמפרטורת המסה, 50 ליטר לשעה לזרימת גז חרוט, 500 ליטר לשעה לזרימת גז המסה, ושלושה קילו-וולט למתח נימי ייחוס. נתח דגימה מלאכותית של 10 ננו-מולרית שהוכנה בעבר באמצעות מבחן LC-HDMSE שתואר זה עתה על ידי הזרקת 10 מיקרוליטר של דגימה למכשיר.

הרצפים הבודדים של שישה תקני פפטיד זרחן B הכלולים בתערובת הפפטידים המלאכותית מוצגים כאן יחד עם זמני השמירה שלהם וקודמיהם הנפוצים ביותר שנצפו בניסוי HDMSE. ספקטרום ה-HDMSE שנרכש עבור אחד מהפפטידים המזויפים המופיעים בתקציר Infliximab מוצג כאן. בתוכנת רכישת הנתונים, לחץ על צור שיטת ניתוח ובחר שיטת יצירה ורכישה ועיבוד.

הקלד את שם השיטה ותיאורה, דפדף לתיקיית השיטה ולחץ על הבא. לסוג ניתוח, בחר כמות, בחר Quantify Assay Tof 2D Chromatographic ולחץ על הבא. לאחר מכן בחר את תצורת המערכת הנוכחית ולחץ על הבא וסיום.

לחץ על לשונית המכשירים בשיטה החדשה שנוצרה. בחר את מנהל הממס הבינארי וערוך את הגדרות השיפוע כדי להשיג הפרדת פפטידים בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. השתמש בדילול שיפוע מ-1 עד 40% ממס B תוך 30 דקות ולאחר מכן שטיפת עמודות של שתי דקות ושיווי משקל של 10 דקות עם זמן ריצה כולל של 45 דקות.

בכרטיסייה מכשירים, בחר את מנהל הדגימה והגדר את טמפרטורת הדגימה ל-10 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת העמודה ל-60 מעלות צלזיוס. כעת בחר את מכשיר Vion IMS QTof ובקטע ההגדרות, בחר רגישות למצב מנתח. לאחר מכן הזן שלושה קילו-וולט למתח נימי, 100 מעלות צלזיוס לטמפרטורת המקור, 250 מעלות צלזיוס לטמפרטורת המסה, 50 ליטר לשעה לזרימת גז חרוט ו-500 ליטר לשעה לזרימת גז המסה.

לחץ על כרטיסיית הניסוי ועבור סוג הניסוי, בחר טבלת פונקציות אחת או יותר MS, MSMS או MRM. מחק את פונקציית הרכישה המוגדרת כברירת מחדל, לחץ על הוסף פלוס MRM וערוך את הפרמטרים של חלון השמירה במקטע זמן הריצה. בעורך הפונקציות Tof MRM, הזן את יחס הטעינה הראשי של מבשר הפפטיד, בחר נמוך לרזולוציית המבשר והיכנס למצב הטעינה של המבשר.

לאחר מכן הזן את יחס הטעינה הראשי של המוצר 16 אלקטרון וולט עבור אנרגיית ההתנגשות ההתחלתית, 0.1 שניות עבור זמן הסריקה הקבוע ורחב עבור עמודת הספקטרום. באמצעות כפתור השכפול, הוסף עוד 10 מעברי MRM והשתמש בערכי אנרגיית התנגשות שונים בטווח של 18 עד 36 אלקטרון וולט. לאחר קביעת שלושת המעברים הטובים ביותר עבור כל פפטיד, בוצע ניסוי Tof MRM כדי למצוא את אנרגיית ההתנגשות האופטימלית כדי למקסם את האותות שנוצרו עבור כל פפטיד.

לאחר מכן, הגדר שיטת HS-MRM המכילה רק יון שבר אחד לכל פפטיד. שנה את שיטת Tof MRM שנוצרה בעבר על-ידי בחירת הפונקציה HS-MRM במקום הפונקציה Tof MRM. בעורך הפונקציות HS-MRM, הזן את יחס הטעינה הראשי, בחר נמוך לרזולוציית המבשר והיכנס למצב הטעינה המבשר.

לאחר מכן הזן את ערך ה-CCS הקודם ובחר נמוך עבור רזולוציית CCS קודם. עבור יון המוצר, הזן את יחס המטען הראשי שלו, בחר את אנרגיית ההתנגשות האופטימלית, בחר זמן סריקה של 0.4 שניות ובחר הגדרת ספקטרום רחב שתכלול את כל האיזוטופים שלו. בדיקת HS-MRM הסופית שומרת רק על המעבר הטוב ביותר עבור כל פפטיד ומשמשת לניתוח כל הדגימות הקוצניות.

בשיטת הניתוח שנוצרה לשיטת רכישת הנתונים HS-MRM, לחץ על לשונית המטרה ובחר ניהול רכיבים. מהתפריט הנפתח תחת סוג ניסוי, בחר באפשרות HS MSMS/HS MRM. לחץ על צור והזן את שם הרכיב, זמן השמירה הצפוי, חלון זמן החילוץ ויחס הטעינה הראשי של המבשר.

בחר מצב חילוץ XIC והקלד את ערך ה-CCS הצפוי. עבור יון השבר, הזן את מצב הטעינה שלו ואת יחס הטעינה הראשי שלו. לאחר מכן הזן את כל רכיבי הפפטיד המנוטרים על ידי בדיקת HS-MRM.

בכרטיסיית המטרה של אותה שיטת רכישה HS-MRM, לחץ על כמויות ברירת המחדל והזן 0.1, אחד, 10 ו-100 ננו-מולרי עבור כל רכיבי הפפטיד המלאכותי. לאחר הזנת הערך הראשון, לחץ לחיצה ימנית ובחר באפשרות המילוי למטה כדי להזין את אותו ריכוז עבור כל הרכיבים. חזור על אותו הליך עבור כל ארבעת הריכוזים של עקומת הכיול.

כעת עבור ללשונית העיבוד ולחץ על הגדרות חילוץ. הזן 10 עמודים לדקה לסובלנות מסה. לאחר מכן לחץ על סובלנות זמן סחיפה של CCS והזן 5% עבור סובלנות CCS.

בכרטיסייה עיבוד, בחר את הגדרות העיבוד המרבי. באזור ההחלקה, בחרו mean כאלגוריתם ההחלקה, אחד כחצי הרוחב ואחד כאיטרציות. בקטע האינטגרציה, ודא שרוחב השיא האוטומטי ואפשרויות הזיהוי האוטומטי מסומנות.

לאחר מכן, בחר את הגדרות המסך הממוקדות בכרטיסיית העיבוד ובחר באפשרות הקרובה ביותר ל-RT בחלון RT. לאחר מכן הזן 0.2 דקות לסובלנות זמן השמירה. בחר הגדרות כימות ובתפריט הכיול, בחר ליניארי עבור סוג התאמת עקומת הכיול, אחד מעל x בריבוע עבור סוג המשקל, ריכוז עבור סוג ערך רכיב, מילימול לליטר עבור יחידות ערך רכיב, ואף אחד עבור חישוב נקודות כיול לפי ממוצע.

בתפריט הכמות, בחר אזור כערך התגובה. דוגמאות לכרומטוגרמות HS-MRM שנוצרו עבור הפפטידים המלאכותיים על פני כל הריכוזים מוצגות כאן. עקומות הכיול המתקבלות עבור כל פפטיד לאחר השילוב של פסגות HS-MRM מוצגות כאן.

סטיית התקן היחסית של שטח השיא המחושבת על סמך ארבע זריקות שכפול מסוכמת כאן. מכיוון שבדיקת MRM הסלקטיביות הגבוהה משלבת הן הפרדת מבשר ניידות יונים והן זיהוי ספקטרומטרי מסה ממוקד ברזולוציה גבוהה, יש לה פוטנציאל גדול להפוך לבדיקת ניטור מהירה ותפוקה גבוהה עבור חלבונים מרובים של תא מארח על פני קבוצות של ביו-פרמצבטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר בדיקת MRM סלקטיביות גבוהה במכשיר Vion IMS QTof.