חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח
May 17th, 2017
מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.
המטרה הכוללת של מערכת הדמיה זו היא להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי לצפות בהתפתחות איברי הצמח לאורך מספר ימים ברזולוציה תת-תאית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במורפוגנזה של צמחים, כגון כיצד תאים של אורגניזמים רב-תאיים מתאמים את דפוסי הגדילה וההתפשטות שלהם במהלך אורגנוגנזה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה להתקנה ואינה מסתמכת על הציוד המומחה המשמש לעתים קרובות בהדמיית זמן, כמו מערכות שפע.
הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשקראנו את הפרסום של Littlejohn and Love, ב-New Phytologist המתאר את היתרונות של פרפלואורודקלין להדמיה בתוך רקמות עלים. כדי להתחיל, השתמש בחותך זכוכית כדי ליצור רצועות זכוכית ברוחב שלושה מילימטר ממגלשה בעובי מילימטר אחד. לאחר מכן, בעזרת דבק ציאנואקרילט או סרט דו צדדי, אבטח את הרצועות במרחק של כ-45 מילימטרים זו מזו לרוחב שקופית חדשה.
הכינו שקופית נוספת באותם מידות שתשמש כתבנית. כעת, הכינו אטם באותו גובה ממסטיק PDMS חדיר לגז. הרטיבו שקופית שנייה עם מעט אתנול מוחלט ושטחו את ה-PDMS על המגלשה עד לגובה רצועות הזכוכית.
לאחר מכן, הרטיבו להב עם אתנול מוחלט וחתכו את כל ה-PDMS העודפים. זה קריטי מכיוון שכלים רטובים באתנול לא ידבקו ל-PDMS. לאחר מכן, שטח מחדש את ה-PDMS עד לגובה הרצועה.
לאחר מכן, חותכים חלל לתוך ה-PDMS שיחזיק את השתיל ולוח האגר. כדי לייצר גודל חלל עקבי, אנו משתמשים בחותך תוצרת בית בהתאמה אישית הבנוי מפרטים אך ניתן להשתמש בסכין גילוח במקום. לאחר מכן, חתוך סביב הקצה החיצוני כדי להפוך את האטם לעובי של כשני מילימטרים.
כעת, על מגלשה ללא אטם ה-PDMS, הנח כיסוי על שתי רצועות הזכוכית. ואז לחלל שמתחת לכיסוי, פיפטה כמיליליטר אחד של אגר נוזלי חם בינוני מספיק כדי למלא את החלל. האגר יכול להכיל תרכובות ניסיוניות מעניינות.
לאחר מכן, איזון אוויר חלק מה-PFD על ידי ניעור נפח קטן של PFD בצינור. לאחר שהאגר התייצב, טען כ-200 מיקרוליטר של ה-PFD לאטם ה-PDMS, אך אל תמלא אותו לחלוטין. הסר את הכיסוי מלוח האגר, וחתוך אותו לצורה שתתאים לבאר אטם הג'ל PDMS.
השאירו פער של שניים עד ארבעה מילימטרים בין האגר לקיר האטם. לאחר מכן, מלא לחלוטין את החדר ב- PFD מאוזן אוויר. כדי לדמות שורשים ראשוניים גרביטרופיים, קרום תאית משמש כמחסום פיזי על פני לוח האגר
.לוח האגר חייב להיות גם רך יותר עם 0.8% אגר ולא 1.5% אגר. חותכים חתיכה מהקרום שהיא בערך אותם מידות כמו גוש האגר. לאחר מכן, עקרו אותו עם 80% אתנול והניחו לו להתייבש באוויר.
לאחר הייבוש, יש להשרות את הממברנה במצע גידול נוזלי ולאחר מכן להעביר אותה למשטח האגר. כדי להתחיל, הניחו בזהירות עד שלושה שתילים על האגר. המיקום שלהם הוא קריטי.
הקוטילדון וההיפוקוטיל חייבים להיות תלויים מעל קצה האגר, צפים ב- PFD. יש לספק מרווח בין השתילים כדי לאפשר צמיחה. ניתן לסלסל שתילים אם הם גדולים מכדי להשתלב בתא.
לאחר מכן, סגור את החדר באמצעות כיסוי בעובי התואם את המטרה שנבחרה. לחץ בעדינות לאורך הקצה כך שייווצר מגע עם רצועות הזכוכית. השתמש בשקופית זכוכית נוספת כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה את הכיסוי כך שהוא מונח באופן שווה על שתי רצועות הזכוכית.
לאחר מכן, אבטח את הכיסוי באמצעות סרט כירורגי מיקרופורי שנחתך לשניים לאורכו. כעת, הניחו לדגימה להתיישב כחצי שעה לפני ההדמיה. להכנת שתילי arabidopsis thaliana לתאים, יש לעקר תחילה את הזרעים עם אתנול 70%.
ואז לשתול אותם על מדיום משלים. שכבו את הזרעים הנטועים במשך יומיים-ארבעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הזרעים הנטועים ל -22 מעלות צלזיוס, וגדלו אותם בכיוון אנכי תחת מחזור אור יומי של 16 שעות.
כדי לדמות את השורשים הצדדיים, גדלו את הצמחים במשך שבעה עד 10 ימים ולאחר מכן העבירו אותם לתאי הדמיה. שורשים רוחביים הגדלים בקצב פיזיולוגי בתאי הדמיה תועדו כל חצי שעה. שורשים רוחביים גודלו גם על לוחות פטרי סטנדרטיים באותו מדיום לשם השוואה.
קצב הצמיחה של שורשים בודדים השתנה מאוד בשני המערכים, אך הטווח היה דומה בשני התנאים. בסך הכל, קצב הגידול גדל עם האורך. לא ניתן היה להבחין בקצב הגידול של צמחים בתאי הדמיה או על צלחות במהלך 27 השעות הראשונות של הצמיחה.
שתי הקבוצות התחילו עם אותו אורך שורש רוחבי ממוצע. שורשים רוחביים המבטאים במשותף סמן קרום פלזמה וסמן מיקרו צינוריות צולמו במרווחים של שעה בתאי ההדמיה. השורשים היו יציבים מאוד במיקומם, מה שאפשר מספר שעות של הדמיה קונפוקלית.
אינדיקטורים חזותיים של התפשטות נצפו לאורך כל הניסוי. בתאים המריסטמטיים ניתן היה לזהות רצועות קדם-פרופאזה, צירים מיטוטיים ופרגמופלסטים. במשך שלושה ימים, צמיחת השורשים הרוחבית לא הייתה שונה באופן משמעותי בתאי ההדמיה בהשוואה לצלחות פטרי במהלך 48 השעות הראשונות, אך ב-72 שעות קצב הגדילה הממוצע ירד.
עם זאת, חלק ניכר מהשורשים בתאים עדיין גדלו בשיעורים דומים לשורשים על צלחות במשך 72 שעות. לאחר השליטה, ניתן ליצור שתי שקופיות תוך 15 דקות אם הכל הולך חלק. אפשר להשתמש במערכת הדמיה זו כדי לחקור את ההשפעה של טיפולים תרופתיים, אם כי נדרשות שיטות מורכבות יותר כמו מערכות זלוף לניסויי שטיפה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סיפקה אמצעי זול ופשוט לעקוב אחר אירועים תאיים העומדים בבסיס מורפוגנזה של צמחים, במיוחד כדי לחקור את תפקידם של קצוות התאים, של דרישות מרחביות החולקות אורגנוגנזה בשורשים הצדדיים של Arabidopsis thaliana.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה לצילום זמן-תלפס בעלת רזולוציה גבוהה של התפתחות שורשים והיפוקוטילים בצמחים. השיטה מאפשרת תצפית במשך מספר ימים, ומספקת תובנות למורפוגנזה של הצמחים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של הצמח
- טכניקות הדמיה
- מורפוגנזה של הצמחים
רקע
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית משמשת לצפייה בהתפתחות איברים בצמחים.
- השיטה מתייחסת לשאלות מרכזיות באורוגנזה ובתיאום תאי.
- פרפלואורו-דקאלין מודגש בזכות היתרונות שלו בהדמיית רקמות עלים.
- התקנה פשוטה בהשוואה לשיטות צילום זמן-תלפס מסורתיות.
מטרת המחקר
- לפתח מערכת הדמיה פשוטה להתפתחות איברים בצמחים.
- לחקור את דפוסי הצמיחה וההתרבות של תאי הצמחים.
- לספק שיטה לחקר אירועים תאיים במורפוגנזה של הצמחים.
שיטות ששימשו
- הכנת תאי הדמיה באמצעות רצועות זכוכית וחותמי PDMS.
- שימוש במדיום אגר כדי לתמוך בשתילים במהלך ההדמיה.
- פרפלואורו-דקאלין באוויר מאוזן להדמיית שורשים.
- תצפית בצמיחה רוחבית של השורשים במרווחים קבועים.
תוצאות עיקריות
- שורשים רוחביים הראו דפוסי צמיחה עקביים בתאי ההדמיה.
- שיעורי הצמיחה היו דומים לאלו בצלחות פטרי סטנדרטיות.
- נוכחו אינדיקטורים ויזואליים להתרבות תאים במהלך המחקר.
- השיטה הוכחה כיעילה למעקב אחר אירועים תאיים לאורך זמן.
מסקנות
- מערכת ההדמיה היא שיטה חסכונית לחקר התפתחות הצמחים.
- היא מאפשרת תצפית מפורטת של תהליכים תאיים בשורשים.
- פוטנציאל ליישום נוסף במחקרים פרמקולוגיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Long-term confocal imaging of plant root and hypocotyl development addresses a critical need for sustained, high-resolution observation of morphogenetic processes under physiological conditions. This capability enables mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for studies requiring quantitative, time-resolved cellular data. The simple chamber system supports scalable, reproducible workflows relevant to translational plant biology and compound screening pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of developmental hypotheses in plant organogenesis.
- Supports functional validation of cellular coordination and proliferation mechanisms.
- Facilitates biological de-risking by maintaining physiological growth rates during imaging.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and standardization through parallel chamber setup.
- Delivers quantitative outputs on root growth and cellular events over multiple days.
- Enables reliable evaluation of compound effects via agar-mediated administration.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant plant models for translational biomarker studies when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting long-term observation.
- Provides predictive de-risking for developmental and morphogenetic research questions.
Pipeline & Workflow Integration
This chamber-based imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation in plant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of organogenesis and cellular proliferation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging conditions for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides quantitative growth measurements and subcellular readouts for comparative studies.
- Translational Research: Enables continuity in developmental studies across time scales and experimental conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, low-complexity platform adaptable to various plant organs and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental studies.
- Operational Value: Simplifies setup, enhances reproducibility, and supports parallelization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust, long-term imaging without specialized equipment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and plant tissue handling.
- Needs access to standard microscopy infrastructure and basic slide preparation tools.
- Demands cross-team standardization for chamber assembly and imaging protocols.
- Adaptable to different plant organs and experimental compounds via agar slab modification.
- Limited washout capability compared to perfusion systems; not suited for rapid compound exchange studies.
