חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח
17 במאי 2017
מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.
המטרה הכוללת של מערכת הדמיה זו היא להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי לצפות בהתפתחות איברי הצמח לאורך מספר ימים ברזולוציה תת-תאית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במורפוגנזה של צמחים, כגון כיצד תאים של אורגניזמים רב-תאיים מתאמים את דפוסי הגדילה וההתפשטות שלהם במהלך אורגנוגנזה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה להתקנה ואינה מסתמכת על הציוד המומחה המשמש לעתים קרובות בהדמיית זמן, כמו מערכות שפע.
הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשקראנו את הפרסום של Littlejohn and Love, ב-New Phytologist המתאר את היתרונות של פרפלואורודקלין להדמיה בתוך רקמות עלים. כדי להתחיל, השתמש בחותך זכוכית כדי ליצור רצועות זכוכית ברוחב שלושה מילימטר ממגלשה בעובי מילימטר אחד. לאחר מכן, בעזרת דבק ציאנואקרילט או סרט דו צדדי, אבטח את הרצועות במרחק של כ-45 מילימטרים זו מזו לרוחב שקופית חדשה.
הכינו שקופית נוספת באותם מידות שתשמש כתבנית. כעת, הכינו אטם באותו גובה ממסטיק PDMS חדיר לגז. הרטיבו שקופית שנייה עם מעט אתנול מוחלט ושטחו את ה-PDMS על המגלשה עד לגובה רצועות הזכוכית.
לאחר מכן, הרטיבו להב עם אתנול מוחלט וחתכו את כל ה-PDMS העודפים. זה קריטי מכיוון שכלים רטובים באתנול לא ידבקו ל-PDMS. לאחר מכן, שטח מחדש את ה-PDMS עד לגובה הרצועה.
לאחר מכן, חותכים חלל לתוך ה-PDMS שיחזיק את השתיל ולוח האגר. כדי לייצר גודל חלל עקבי, אנו משתמשים בחותך תוצרת בית בהתאמה אישית הבנוי מפרטים אך ניתן להשתמש בסכין גילוח במקום. לאחר מכן, חתוך סביב הקצה החיצוני כדי להפוך את האטם לעובי של כשני מילימטרים.
כעת, על מגלשה ללא אטם ה-PDMS, הנח כיסוי על שתי רצועות הזכוכית. ואז לחלל שמתחת לכיסוי, פיפטה כמיליליטר אחד של אגר נוזלי חם בינוני מספיק כדי למלא את החלל. האגר יכול להכיל תרכובות ניסיוניות מעניינות.
לאחר מכן, איזון אוויר חלק מה-PFD על ידי ניעור נפח קטן של PFD בצינור. לאחר שהאגר התייצב, טען כ-200 מיקרוליטר של ה-PFD לאטם ה-PDMS, אך אל תמלא אותו לחלוטין. הסר את הכיסוי מלוח האגר, וחתוך אותו לצורה שתתאים לבאר אטם הג'ל PDMS.
השאירו פער של שניים עד ארבעה מילימטרים בין האגר לקיר האטם. לאחר מכן, מלא לחלוטין את החדר ב- PFD מאוזן אוויר. כדי לדמות שורשים ראשוניים גרביטרופיים, קרום תאית משמש כמחסום פיזי על פני לוח האגר
.לוח האגר חייב להיות גם רך יותר עם 0.8% אגר ולא 1.5% אגר. חותכים חתיכה מהקרום שהיא בערך אותם מידות כמו גוש האגר. לאחר מכן, עקרו אותו עם 80% אתנול והניחו לו להתייבש באוויר.
לאחר הייבוש, יש להשרות את הממברנה במצע גידול נוזלי ולאחר מכן להעביר אותה למשטח האגר. כדי להתחיל, הניחו בזהירות עד שלושה שתילים על האגר. המיקום שלהם הוא קריטי.
הקוטילדון וההיפוקוטיל חייבים להיות תלויים מעל קצה האגר, צפים ב- PFD. יש לספק מרווח בין השתילים כדי לאפשר צמיחה. ניתן לסלסל שתילים אם הם גדולים מכדי להשתלב בתא.
לאחר מכן, סגור את החדר באמצעות כיסוי בעובי התואם את המטרה שנבחרה. לחץ בעדינות לאורך הקצה כך שייווצר מגע עם רצועות הזכוכית. השתמש בשקופית זכוכית נוספת כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה את הכיסוי כך שהוא מונח באופן שווה על שתי רצועות הזכוכית.
לאחר מכן, אבטח את הכיסוי באמצעות סרט כירורגי מיקרופורי שנחתך לשניים לאורכו. כעת, הניחו לדגימה להתיישב כחצי שעה לפני ההדמיה. להכנת שתילי arabidopsis thaliana לתאים, יש לעקר תחילה את הזרעים עם אתנול 70%.
ואז לשתול אותם על מדיום משלים. שכבו את הזרעים הנטועים במשך יומיים-ארבעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הזרעים הנטועים ל -22 מעלות צלזיוס, וגדלו אותם בכיוון אנכי תחת מחזור אור יומי של 16 שעות.
כדי לדמות את השורשים הצדדיים, גדלו את הצמחים במשך שבעה עד 10 ימים ולאחר מכן העבירו אותם לתאי הדמיה. שורשים רוחביים הגדלים בקצב פיזיולוגי בתאי הדמיה תועדו כל חצי שעה. שורשים רוחביים גודלו גם על לוחות פטרי סטנדרטיים באותו מדיום לשם השוואה.
קצב הצמיחה של שורשים בודדים השתנה מאוד בשני המערכים, אך הטווח היה דומה בשני התנאים. בסך הכל, קצב הגידול גדל עם האורך. לא ניתן היה להבחין בקצב הגידול של צמחים בתאי הדמיה או על צלחות במהלך 27 השעות הראשונות של הצמיחה.
שתי הקבוצות התחילו עם אותו אורך שורש רוחבי ממוצע. שורשים רוחביים המבטאים במשותף סמן קרום פלזמה וסמן מיקרו צינוריות צולמו במרווחים של שעה בתאי ההדמיה. השורשים היו יציבים מאוד במיקומם, מה שאפשר מספר שעות של הדמיה קונפוקלית.
אינדיקטורים חזותיים של התפשטות נצפו לאורך כל הניסוי. בתאים המריסטמטיים ניתן היה לזהות רצועות קדם-פרופאזה, צירים מיטוטיים ופרגמופלסטים. במשך שלושה ימים, צמיחת השורשים הרוחבית לא הייתה שונה באופן משמעותי בתאי ההדמיה בהשוואה לצלחות פטרי במהלך 48 השעות הראשונות, אך ב-72 שעות קצב הגדילה הממוצע ירד.
עם זאת, חלק ניכר מהשורשים בתאים עדיין גדלו בשיעורים דומים לשורשים על צלחות במשך 72 שעות. לאחר השליטה, ניתן ליצור שתי שקופיות תוך 15 דקות אם הכל הולך חלק. אפשר להשתמש במערכת הדמיה זו כדי לחקור את ההשפעה של טיפולים תרופתיים, אם כי נדרשות שיטות מורכבות יותר כמו מערכות זלוף לניסויי שטיפה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סיפקה אמצעי זול ופשוט לעקוב אחר אירועים תאיים העומדים בבסיס מורפוגנזה של צמחים, במיוחד כדי לחקור את תפקידם של קצוות התאים, של דרישות מרחביות החולקות אורגנוגנזה בשורשים הצדדיים של Arabidopsis thaliana.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה לדימיון בזמן אמת (time-lapse) ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי של התפתחות שורשים והיפוקוטיל בצמחים. שיטה זו מאפשרת תצפית לאורך מספר ימים ומספקת תובנות לגבי מורפוגנזה של צמחים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- טכניקות דימוי
- מורפוגנזה של צמחים
רקע
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית משמשת לצפייה בהתפתחות איברי צמחים.
- הטכניקה נותנת מענה לשאלות מרכזיות באורגנוגנזה ובתיאום תאי.
- היתרונות של Perfluorodecalin מודגשים עבור דימות של רקמות עלים.
- הגדרה פשוטה בהשוואה לשיטות מסורתיות של דימות Time-lapse.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת דימוג פשוטה למעקב אחר התפתחות איברי צמחים.
- בחינה של דפוסי הגדילה והשכפול של תאי צמחים.
- אספקת שיטה למחקר של אירועים תאיים במורפוגנזה של צמחים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תאי דימות באמצעות רצועות זכוכית ואטמי PDMS.
- שימוש במצע אגר לתמיכת נבטים במהלך הדימות.
- שימוש בפרפלואורדקלין מאוזן באוויר לצורך דימות של שורשים.
- תצפית על צמיחת שורשים צדדיים במרווחי זמן קבועים.
תוצאות עיקריות
- שורשים צדדיים הראו דפוסי גדילה עקביים בתאי ההדמיה.
- שיעורי הגדילה היו דומים לאלו שנצפו בצלחות פטרי סטנדרטיות.
- מדדים ויזואליים של שגשוג תאים נצפו במהלך המחקר.
- הטכניקה הוכחה כיעילה לניטור אירועים תאיים לאורך זמן.
מסקנות
- מערכת הדימות היא שיטה יעילה מבחינת עלויות לחקר התפתחות צמחים.
- היא מאפשרת תצפית מפורטת על תהליכים תאיים בשורשים.
- פוטנציאל ליישומים נוספים במחקרים פרמקולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי קונפוקאלי לטווח ארוך של התפתחות שורשי צמחים וההיפוקוטיל מענה לצורך קריטי בתצפיות מתמשכות וברזולוציה גבוהה של תהליכים מורפוגנטיים בתנאים פיזיולוגיים. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון תחזורי בשלבי גילוי מוקדמים, ובמיוחד עבור מחקרים הדורשים נתונים תאיים כמותיים בעלי רזולוציית זמן. מערכת התא הפשוטה תומכת בזרימות עבודה ניתנות להרחבה ולשחזור, הרלוונטיות לביולוגיה תרגומית של צמחים ולמסלולי סריקת תרכובות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של היפותזות התפתחותיות באורגנוגנזה של צמחים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מנגנוני תיאום תאי ושכפול.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שמירה על קצבי גדילה פיזיולוגיים במהלך הדמיה.
- מספק פלטפורמה לניתוח השוואתי של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות רקמות צמחים שעברו תיקוף עבור בדיקות מבוססות דימוג בהמשך התהליך.
- מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות הגדרה של תאים מקבילים.
- מספק תוצאות כמותיות על צמיחת שורשים ואירועים תאיים לאורך מספר ימים.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות באמצעות ה administration באמצעות אגר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של צמחים הרלוונטיים למחלה עבור מחקרים של סמנים ביולוגיים תרגומיים, במידה ורלוונטי.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לאישור הפרה-קליני על ידי תמיכה בתצפית ארוכת טווח.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה עבור שאלות מחקר התפתחותיות ומורפוגנטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת דימוי זו המבוססת על תא משלבת את רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לזיהוי מובילים (leads) ותיקוף פרה-קליני במערכות צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בניתוח מונחה-השערה של אורגנוגנזה ות proliferation תאי.
- סריקה: מספק תנאי דימוי הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור סריקות של תרכובות או סריקות גנטיות.
- אנליטיקה: מספק מדידות צמיחה כמותיות וקריאות תת-תאיות עבור מחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מאפשר רציפות במחקרי התפתחות לאורך סקאלות זמן ותנאים ניסיוניים שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה, בעלת מורכבות נמוכה, הניתנת להתאמה לאיברים שונים של הצמח ולצרכים ניסיוניים מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות.
- ערך תפעולי: מפשט את ההקמה, משפר את השחזוריות ותומך בהקבלה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי אפשור דימות איתן לטווח ארוך ללא ציוד ייעודי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות גילוי מבוססות צמחים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית וטיפול ברקמות צמחים.
- נדרשת גישה לתשתית מיקרוסקופיה סטנדרטית וכלים בסיסיים להכנת סמניות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להרכבת התא ולפרוטוקולי דימות.
- ניתן להתאמה לאיברים שונים של הצמח ולתרכובות ניסיוניות באמצעות שינוי של לוח האגר.
- יכולת שטיפה מוגבלת בהשוואה למערכות פרפוזיה; אינו מתאים למחקרי חליפה מהירה של תרכובות.
