Name: חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למדו שיטת הדמיה קונפוקלית פשוטה לטווח ארוך לפיתוח שורשים והיפוקוטיל בצמחים. השיטה מאפשרת מעקב אחר אירועים תאיים ומורפוגנזה ב-Arabidopsis thaliana ברזולוציה תת-תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ &#39;ג&#39; פרי ווסטנייס, אוניברסיטת בריטיש קולומביה, על זרע להביע RFP-TUB6 ו סוקר אנונימי עבור תיקונים מועיל. אנו אסירי תודה לפרופ &#39;יו דיקינסון על כך שהזהיר אותנו להשתמש בסרט תאית כתמיכה מכנית ולג&#39;ון בייקר לצילום. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר BBSRC מעניק BB / G013993 / 1 ו- BB / D004055 / 1 ל- IM, וכן פרס BBSRC הדרכה דוקטורנט מלגות קלרנדון CK

1. יצירת החדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך זכוכית, לחתוך 3 מ&quot;מ רצועות רחב מקצה שקופית מיקרוסקופ 1 מ&quot;מ עבה. באמצעות דבק סופר cyanoacrylate או קלטת דו צדדית, דבק אלה רצועות זכוכית כ 45 מ&quot;מ בנפרד על פני רוחב של שקופית מיקרוסקופ השני ( איור 1 א ). שקופית אחת לכל חדר נדרש, בתוספת שקופיות נוספות לשפוך לוחות אגר (שקופית אחת תניב 2-3 אגר לוחות). שקפים ניתן לעשות בה שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין רצועות הזכוכית, אופנה אטם של גובה זהה מתוך גומי חדיר פול (dimethylsiloxane) מסטיק. מניחים כדור של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) על השקופית ( איור 1B ), רטוב שקופית השני עם כמות קטנה של אתנול מוחלט 100%, ולשטח את הכדור (dimethylsiloxane) מסטיק הכדור עם השקופית השנייה עד שהוא הגיע לגובה של רצועות זכוכית ( איור 1 ג ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, לקצץ עודף פולי (שקלThylsiloxane) מסטיק עם להב סכין גילוח חוזר שטוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת חותך מתאים או סכין גילוח הרטבו באתנול מוחלט, להסיר את החלק הפנימי של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) כדי ליצור את חלל כי יהיה מאוחר יותר להחזיק את השתיל ואת לוח אגר ( איור 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקצץ את הג &#39;ל עם להב גילוח ליצור אטם עם עובי דופן הסופי של כ 2 מ&quot;מ ( איור 1E ). חדירות של גזים דרך מחסום פולי (dimethylsilaxane) הוא עצמאי של עובי מעל 50 מיקרומטר 11 . </li></ol> 2. יצירת אגר- solidified לוח של צמיחה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על שקופית מיקרוסקופית עם שתי רצועות זכוכית, במקום coverslip (22 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) כך שהוא נשען על שתי רצועות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נמס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני צמיחה המכיל 1% w / סוכרוז v ו 1.5% w / v אגר (½ MS) לתוך החלל וכתוצאה מכךמתחת coverslip עד האחרון הוא מלא לגמרי (כ 1 נפח נפח מלא) ולהשאיר עד אגר מוגדר (כ 5 דקות). הערה: תרכובות פרמקולוגיות ניתן לנהל באמצעות לוח אגר על ידי הוספת ריכוזים מתאימים למדיום נוזלי לפני הלוח הוא שפך. זה נבדק בהצלחה עבור dexamethasone 12 , isoxaben, 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), אוריזלין, ו latrunculin B. </li></ol> 3 . מסיים את ההגדרה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון האוויר PFD על ידי רעד נפח קטן של PFD בצינור 7 . הוסף כמות קטנה (כ 200 μL) של אוויר PFD equilibrated אל הבאר של אטם ג &#39;ל, אבל לא למלא את החדר לחלוטין. זה PFD יסייע למנוע את השמנה של בועות אוויר מתחת ללוח אגר כפי שהוא ממוקם לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip מן לוח אגר (בשלב 2.2 לעיל) ולהשתמש סכין גילוח לחתוך חלק של דהגודל וצורה. ואז למקם אותו לתוך הבאר של אטם ג&#39;ל ( איור 1F ). צריך להיות פער של 2-4 מ&quot;מ על אטם מסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את החדר לחלוטין עם אוויר equilibrated PFD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד או יותר שתלי thaliana A. (עד 3 שתילים עבור הדמיה מעל 2-3 ימים) על גבי לוח אגר עם cotyledons ו hypocotyl תלוי מעל הקצה, צף PFD ( איור 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג שתילים, לעקר זרעים עם אתנול 70%, צמח על בינוני MS בינוני ½ בתוספת סוכרוז 1% ו אגר 0.8%, stratify עבור 2-4 ימים ב 4 ° C, ולגדול על לוחות בכיוון אנכי ב 22 ° C ב 16 שעה בהיר / 8 שעות משטר כהה. לקבלת הדמיה שורשים לרוחב, לגדל צמחים 7-10 ימים לפני העברת לתאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסגור את החדר, להחיל coverslip מתאימים את אופטיקה של המטרה, בעדינות לחיצה על זה עם קצה של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עד coverslipנשענת על שתי רצועות זכוכית ( איור 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את coverslip עם רצועות של 1.25 ס&quot;מ micropore רחב חיתוך סרט קלטת בחצי אורך חכם על כל קצה אם רוצים ( איור 1I ). אפשר הדגימה להסתפק כ 30 דקות לפני ההדמיה. זה ממזער את תנועת הדגימה במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף כדי לשמור על מצע מבוקר לצמיחה. השתמש 20X / 0.7NA או 63X / 1.2NA מטרות CS2. </li></ol>

<ol><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22(2015).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/245021280_Solubility_of_oxygen_and_carbon_dioxide_in_water">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li>
<li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update%3A+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology%2C+physiology%2C+development+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140(2014).</li>
<li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378381204002717">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li>
<li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li>
<li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0376738814009466">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li>
<li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li>
<li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li>
<li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li>
<li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430(2011).</li>
<li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li>
<li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li>
<li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044(2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה הדמיה confocal של פיתוח שורשים לרוחב עבור שניים עד שלושה ימים. בתקופות של עד 48 שעות, לא נצפו תופעות לוואי של מערכת ההדמיה על התפתחות שורש לרוחב. לאחר 48 שעות, הצמיחה השורשית הממוצעת החלה להאט, אם כי תת-קבוצה משמעותית של השורשים (37%) המשיכה לצמוח בקצב דומה לצמיחת השורש הממוצעת בצלחות. לכן, באמצעות הדמיה מספר גדול מספיק של שורשים, שורשים אשר הצמיחה איטית לאחר 48 שעות ניתן להרחיק. בדיקות סיסטמטיות של תאי ההדמיה לא בוצעו לתקופות ארוכות יותר מ -72 שעות, אך מומלץ להשתמש באסטרטגיות חלופיות אם יש צורך בתקופות הדמיה מורחבות. תאי הדמיה עשויים להישאר על הבמה מיקרוסקופ ברציפות, אם בתנאי הסביבה מתאימים מסופקים, או מוסר למתקן הצמיחה ומדי פעם חזר למיקרוסקופ. זה מאפשר חדרים רבים להיות צילמו במקביל/ P&gt; אחד היתרונות של החדרים המתוארים כאן הוא כי שורשים לרוחב קבועים במצבם והוא יכול להיות צילמו באמצעות ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יציבות מרחבית ביקורתית תלוי ריכוז אגר בשימוש לוח אגר תמיכה. בתחילה נבדקו ריכוזים שונים של אגר 0.8% ל אגר של 2%, ומצאו כי ריכוזים גבוהים בטווח זה קבועים בשורשים קבועים בחלל, אך שורש הצמיחה הואט מהר יותר וחלק מהשורשים הראו סימני לחץ מכני, כולל התארכות תא מופחתת. לעומת זאת, ריכוזי אגר נמוכים לא סיפקו את התמיכה והשורשים הנדרשים ב- x, y ו- z במהלך ההדמיה. אופטימלית 1.5% אגר לוח מתקן את המיקום של הדגימה ללא תופעות מכניות שליליות. בתנאים אלה, לאחר ההתיישבות ב 30 דקות הראשונות או כך, שורשים יציבים על פני שעות רבות, המאפשר רכישת נתונים לילה. במהלך רכישת נתוני 4D, טווחי ערימת z היו בדרך כלל במחוררים על ידי 5-10 מיקרומטר נוסף אבל זה היה בעיקר כדי להתאים לצמיחה מחוץ לגובה של שורשים לרוחב ולא z- להיסחף או לנענע. למרות ריכוז אגר סטנדרטי מספק התנגדות מסוימת נגד חדירה, שורשים gravitropically גדל בסופו של דבר לחדור את אגר. עם זאת, באמצעות שינוי קטין של החדר הדמיה, שורש הצמיחה יכולה להישמר מקביל coverslip, המאפשר שורשים לרוחב מבוגר השורשים העיקריים להיות צילמו. יתר על כן, חדר הדמיה בסיסי יכול בקלות להיות מותאם אישית עבור hypocotyls. Hypocotyls הם יותר חופשי צף במערכת זו כך Z- ציר סוגר לרכישת התמונה הוגדלה בדרך כלל על 20 מיקרומטר. במחקר זה, מיקרוסקופ זקוף שימש בכל רחבי, אשר אפשרה את מאפייני המצע להיות נשלט. תא הדמיה יכול להיות מותאם לתצורות מיקרוסקופ הפוכה אבל ההשפעה תלוי זמן של coverslip נוקשה על מיירט איברים יהיה צורך להעריך. </p&gt; Littlejohn ועמיתיו יש לציין כי PFD עצמו אינו בקלות להמיס מולקולות ביולוגיות, כלומר זה לא ניתן להשתמש עבור ישירות עבור משלוח של תרכובות פרמקולוגיות 7 . בעיה זו היה להתגבר על ידי אספקת תרכובות כאלה דרך לוח של המדידה הצמיחה מוצק שבו מוטלת אגר. בעוד מערכות זלוף יישארו השיטה של ​​בחירה עבור לשטוף- out ניסויים, תא הדמיה שימש בהצלחה עבור ניהול של dexamethasone 12 ותרכובות אחרות. הערה אחת, בעוד מאמר זה היה בהכנה פון Wagenheim ועמיתיו 18 תיאר חדר הדמיה פיתוח שורש לרוחב באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון.

כדי לחקור את התהליכים הסלולר והתת-קרקעיים המונחים ביסוד פיתוח הצומח, יש ביקוש גובר לפתרונות הדמיה לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה. האתגר העיקרי בניסויים הדמיה כזו היא שמירה על תנאים פיזיולוגיים כולל חילופי גזי מספיק בתוספת אספקת מים וחומרים מזינים 1 , 2 , 3 . כדי לנצל את היעדים עם פתחים מספריים גבוהים עבור רזולוציה אופטית אופטימלית, דגימות צריך להיות ממוקם בקירבה מקבילה בכיוון מקביל coverslip. התנועה x, y, ו- z כיוונים צריך אידיאלי להיות מינימלי במהלך הדמיה. בעוד שתילים הם רכוב לעתים קרובות במים או תמיסה מימית עבור הדמיה לטווח קצר, מים יש קיבולת נמוכה עבור המסת CO2 ו O 2 (1.54 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה ב 20 ° C, 0.1 מגפ&quot;ס) 4 , מה שהופךזה לא מתאים עבור זמן ארוך לשגות ניסויים. מערכות זלוף כי לשמור על רמות קבועות של חמצן וחומרים מזינים הם פתרון אחד לבעיה זו פותחו עבור מיקרוסקופיה לייזר סריקה confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 ו מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) 5 . מערכות כמו RootChip 2 ו RootArray 3 תוכננו במיוחד עבור זמן לשגות הדמיה של השורשים המתפתחים לערב נביטה זרעים במודל מותאם אישית לבנות רב הדגימה. סידורים אלה מבטיחים הפרעה מכנית מינימלית ומעוצבים לניתוח מקבילי של שתילים מרובים, אך אינם מותאמים להדמיה של מבנים תת-תאיים. קאלדר ועמיתיו עיצבו תא מורכבת יותר זלוף מבוסס הדמיה אופטימיזציה עבור הדמיה של מבנים subcellular שבו הדגימה מוחזקת בעמדה על ידי רשתכדי לאפשר את השימוש של עדשות טבילה הגדלה גבוהה 1 . הציג כאן פתרון חלופי, פשוט לבעיה זו אשר אינו מבוסס על מערכות זלוף, אך מנצל perfluorodecalin (PFD), perfluorocarbon כי זכה לאחרונה הפופולריות כמדיום גובר עבור הדמיה ארבידופסיס 6 , 7 , 8 . ביישומים כאלה, קיבולת גבוהה של PFD עבור המסת CO 2 ו O 2 (1.9 גרם / מ&quot;ל ​​עבור O 2 ב PFD לעומת 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים) 9 , מאפשר החלפת גזי ידי הרקמה שקוע. יתר על כן, PFD הוא לא פלואורסצנטי ומדד השבירה שלו (1.313) הוא דומה לזה של מים (1.333) והוא קרוב יותר לזה של cytosol (~ 1.4) מאשר אוויר (1.000) 6 . Fluluorocarbons דווחו יש השפעה מינימלית פיזיולוגית על מגוון רחב של צמחים צמח לאבעיות 6 , עם זרעי צנון נובטים בקלות כאשר שקוע PFD ומציג צמיחה נורמלית ופיתוח לפחות שני ימים מלאים, כאשר מסופק עם מים 10 . תצפיות דומות נעשו עבור נביטה של זרעי ארבידופסיס . בהתבסס על גירוי ראמאן פיזור ישיר לתמונה הפצה של PFD ב רקמות ארבידופסיס עלה לאחר חדירת, ליטג&#39;ון ועמיתיו למסקנה כי PFD סביר להניח לא נלקח על ידי תאים חיים 8 . PFD בעבר שימש בעיקר כדי התמונה רקמות אוויר, שבו זה מגדיל באופן משמעותי את עומק הדמיה כפי שהוא בקלות חדירת מרחבי האוויר עקב מתח נמוך שלה משטח 6 . הנה, PFD הוא אימץ עבור הדמיה confocal לטווח ארוך של פיתוח שורשים לרוחב. בתצורה זו, שתילים אחד או יותר ממוקמות על לוח של בינונית צמיחה מוצק עם אגר ו שקוע PFD. PFD מאפשר gחילופי אדים בתא הדמיה, מניעת anoxia. PFD הוא נדיף מאוד ולכן הוא נשמר על ידי אטם של מסטיק פולי (dimethylsiloxane), כי יש גם חדירות גז גבוהה (1.5 x 10 -12 pmol מ -1 -1 s -1 אבא -1 עבור CO 2 ) 11 . חומרים מזינים ומים מסופקות על ידי לוח של solidified בינוני עם אגר. במקביל, זה לוח אגר בעדינות לוחץ את השורש נגד coverslip, ובכך לתקן את המיקום היחסי שלה בחדר הדמיה ומאפשר את השימוש ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יתר על כן, לוח אגר ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון של טיפולים תרופתי, כולל dexamethasone, oryzalin, ו isoxaben. תאי הדמיה ניתן להרכיב במספרים גדולים מן שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות ציוד מינימלי. תאי ההדמיה פותחו ואופיינו ללימוד התפתחות שורש לרוחב, אך ניתנים להתאמה לדמיית איברים אחרים, כגון שורש ראשוני,היפוקוטילים.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly (dimethylsiloxane) gum&nbsp;</td><td>אספקה ביולוגית של קרוליינה; ברלינגטון, קרוליינה הצפונית, ארה"ב</td><td>פריט # 132700</td><td>קרוליינה תצפית ג'ל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth, &nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>החלל הוא בקוטר 13 מ"מ ובעומק 0.2-0.4 מ"מ. כל שקופית חלל כנראה תספיק</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>לוקטיט</td><td>604753</td><td>כל 'דבק-על' המתאים לזכוכית כנראה יספיק</td></tr><tr><td>קרום צלופן תאית</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P סרט תאית 80 מ"מ</td></tr></tbody></table>

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

כמה היבטים של פיתוח צמחים, כגון מורפוגנזה שורש לרוחב, להתרחש על פני זמן של כמה ימים. כדי לחקור את התהליכים הבסיסיים התאים הסלולר, זמן ברזולוציה גבוהה לשגות אסטרטגיות מיקרוסקופיה כי לשמר תנאים פיזיולוגיים נדרשים. רקמות הצמח חייב להיות מזין נאותה אספקת מים עם חילופי גזי מתמשכת אבל, כאשר שקוע משותק תחת coverslip, הם רגישים במיוחד anoxia. אסטרטגיה אחת אשר הועסק בהצלחה היא השימוש במערכת זלוף כדי לשמור על אספקה ​​מתמדת של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, הסדרים כאלה יכול להיות מסובך, מסורבל, ודורשים ציוד מיוחד. מוצג כאן היא אסטרטגיה חלופית עבור מערכת הדמיה פשוטה באמצעות perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. מערכת זו היא קלה להתקנה, דורש ציוד מינימלי, והוא רכוב בקלות על הבמה מיקרוסקופ, המאפשר מספר חדרי הדמיה להיות מוגדר הדמיה שווהאלל. במערכת זו, שיעורי הצמיחה שורש לרוחב הם נבדלים משיעורי צמיחה בתנאים סטנדרטיים על צלחות אגר במשך היומיים הראשונים, וצמיחה שורש לרוחב ממשיך בשיעורים מופחתים לפחות עוד יום. רקמות הצמח מסופקים עם חומרים מזינים דרך אגר לוח זה יכול לשמש גם כדי לנהל מגוון של תרכובות פרמקולוגיות. המערכת הוקמה כדי לפקח על התפתחות שורש לרוחב, אבל הוא להתאמה בקלות התמונה איברים צמח אחרים כגון hypocotyls השורשים העיקריים.

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

המטרה הכללית של מערכת דימוי זו היא להשתמש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית כדי לצפות בהתפתחות של איברי צמחים לאורך מספר ימים ברזולוציה סוב-תאית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במורפוגנזה של צמחים, כגון כיצד תאים של אורגניזמים רב-תאיים מתאמים את דפוסי הגדילה והשגשוג שלהם במהלך אורגנוגנזה? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה להקמה ואינה מסתמכת על הציוד המקצועי המשמש לרוב בדימוי בזמן אמת (time lapse), כגון מערכות פרופיוזיה (profusion systems).הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר קראנו את הפרסום של Littlejohn ו-Love ב-New Phytologist, המתאר את היתרונות של perfluorodecalin עבור דימוי בתוך רקמות עלה. לתחילתו של התהליך, השתמשו בחיתוך זכוכית כדי להכין רצועות זכוכית ברוחב 3 מילימטרים מתוך זכוכית להכנה בעובי 1 מילימטר. לאחר מכן, בעזרת דבק cyanoacrylate או סרט דביק דו-צדדי, קבעו את הרצועות במרווחים של כ-45 מילימטרים לרוחבה של זכוכית הכנה חדשה.הכינו שקופית נוספת באותם ממדים שתשמש כתבנית. כעת, הכינו אטם באותו גובה מגומי PDMS חדיר לגז. הרטיבו שקופית שנייה במעט אתנול מוחלט והשטיחו את ה-PDMS על השקופית עד לגובה של פסי הזכוכית.לאחר מכן, הרטב להב באתנול מוחלט וגזז את עודפי ה-PDMS. שלב זה קריטי, שכן כלים הרטובים באתנול לא יידבקו ל-PDMS. לאחר מכן, השטח שוב את ה-PDMS עד לגובה הפס.לאחר מכן, חתכו חלל ב-PDMS שיכיל את השתיל ואת פלחת האגר. כדי להשיג גודל חלל עקבי, אנו משתמשים בחותך ביתי מותאם אישית העשוי מפרספקס, אך ניתן להשתמש בלהב תער במקומו. בשלב הבא, גזרו מסביב לקצה החיצוני כדי להפוך את האטם לעובי של כ-2 מילימטרים.כעת, על גבי זכוכית נושאת ללא אטם PDMS, הניחו מכסה זכוכית (coverslip) על שני פסי הזכוכית. לאחר מכן, לתוך החלל שמתחת למכסה הזכוכית, טפטפו בעזרת פיפט כ-1 ml של מצע אגר מונמס וחמים, בכמות המספיקה למילוי החלל. האגר יכול להכיל תרכובות ניסיוניות רלוונטיות.בשלב הבא, בצעו שיווי משקל של PFD עם האוויר על ידי ניעור של נפח קטן של PFD במבחנה. לאחר שהאגר התגבש, טענו כ-200 microliters של PFD לתוך אטם ה-PDMS, אך אל תמלאו אותו לחלוטין. הסירו את לבישת הכיסוי מלוח האגר, וגזרו אותו לצורה שתתאים לבאר של אטם ג'ל ה-PDMS.השאירו מרווח של שני עד ארבעה מילימטרים בין האגר לדופן האטם. לאחר מכן, מלאו את התא לחלוטין ב-PFD מאוזן באוויר. כדי לדמות שורשים ראשוניים גרביטרופיים, משתמשים בממברנה תאיתית כמחסום פיזי על פני השטח של לוח האגר.לוח האגר חייב להיות רך יותר, עם 0.8% agar במקום 1.5% agar. גזרו חתיכה מהממברנה במימדים הדומים בקירוב לאלו של בלוק האגר. לאחר מכן, סטריליזרו אותה באמצעות 80% ethanol והניחו לה להתייבש באוויר.לאחר הייבוש, השרו את הממברנה במצע גידול נוזלי ולאחר מכן העבירו אותה למשטח האגר. להתחלה, הניחו בזהירות עד שלושה נבטים על האגר. מיקום הנבטים הוא קריטי.הקטלידונים וההיפוקוטיל חייבים להיות תלויים מעל קצה האגר, צפים ב-PFD. יש להשאיר מרווח בין השתיליים כדי לאפשר גדילה. ניתן לכופף את השתיליים במידה והם גדולים מדי מכדי להיכנס לתא.לאחר מכן, סגרו את התא באמצעות כיסוי זכוכית (coverslip) בעובי התואם לעדשה שנבחרה. לחצו בעדינות לאורך הקצה כדי ליצור מגע עם פסי הזכוכית. השתמשו בلامית זכוכית נוספת כדי ללחוץ בעדינות על כיסוי הזכוכית, כך שיושבת באופן אחיד על שני פסי הזכוכית.לאחר מכן, קבעו את כיסוי הזכוכית באמצעות סרט מיקרופור כירורגי שנגזר לאורכו לחצי. כעת, המתינו כחצי שעה עד שהדגימה תתייצב לפני הצילום. כדי להכין את נבטי ה-arabidopsis thaliana לתאים, סטרלו תחילה את הזרעים ב-70% ethanol.לאחר מכן, יש לזרוע אותם על מצע מועשר. בצעו סטריפיקציה לזרעים שנזרעו למשך יומיים או ארבעה ימים בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבירו את הזרעים שנזרעו לטמפרטורה של 22 °C, וגדלו אותם בעמידה במצב אנכי תחת מחזור תאורה יומי של 16 שעות.לצורך הדמיית השורשים הצדדיים, גדלו את הצמחים למשך שבעה עד 10 ימים ולאחר מכן העבירו אותם לתאי הדמיה. שורשים צדדיים הגדלו בקצבים פיזיולוגיים בתאי ההדמיה תועדו מדי חצי שעה. להשוואה, גודלו שורשים צדדיים גם בצלחות פטרי סטנדרטיות באותו מצע גידול.קצב הצמיחה של שורשים בודדים השתנה רבות בשני המערכים, אך הטווח היה דומה תחת שני התנאים. באופן כללי, קצב הצמיחה עלה עם הגדלת האורך. קצב הצמיחה של צמחים בתאי דימות או בצלחות היה זהה במהלך 27 השעות הראשונות של הצמיחה.שתי הקבוצות התחילו עם אותו אורך ממוצע של שורשים צדדיים. שורשים צדדיים המבטאים שילוב של סמן לממברנה הפלזמית וסמן למיקרוטובוליים צולמו במרווחי זמן של שעה אחת בתאי ההדמיה. השורשים היו יציבים מאוד במיקומם, מה שאפשר מספר שעות של הדמיה קונפוקלית.מדדים ויזואליים של שגשוג נצפו לאורך כל הניסוי. בתאים המריסטמטיים, ניתן היה לזהות פסי קדם-פרופאזה, כישורי מיטוזה ופרגמופלסטים. במהלך שלושה ימים, צמיחת השורשים הצדדיים בתאי הדמיя לא הייתה שונה באופן מובהק מזו שבצלוחיות פטרי במהלך 48 השעות הראשונות, אך לאחר 72 שעות חל ירידה בקצב הצמיחה הממוצע.עם זאת, חלק משמעותי מהשורשים בתאים עדיין גדלו בקצבים דומים לאלו של שורשים על צלחות לאורך 72 שעות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להכין שתי תרחישים ב-15 דקות אם הכל przebהל בצורה חלקה. ניתן להשתמש במערכת דימוי זו כדי לחקור את ההשפעה של טיפולים פרמקולוגיים, אם כי לצורך ניסויי שטיפה (washout) נדרשות שיטות מורכבות יותר, כגון מערכות פרפוזיה.לאחר פיתוחה, סיפקה טכניקה זו אמצעי זול ופשוט למעקב אחר אירועים תאיים העומדים בבסיס המורפוגנזה של צמחים, ובמיוחד לבחינת תפקידם של קצוות התאים ושל דרישות מרחביות השותפות לאורגנוגנזה בשורשים הצדדיים של *Arabidopsis thaliana*.

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

מיקרוסקופיה confocal משמשת לתערובות תמונה שקטה וזורמים קולואיד פולימר, הנלמדים כמערכות מודל להשעיות אטרקטיביות. אלגוריתמי ניתוח תמונה משמשים לחישוב מדדים מבניים ודינמיים לחלקיקי colloidal המודדים שינויים עקב כליאה גיאומטרית.

ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

פרוטוקול זה מציג שיטת הכנת דגימת צמחים למיקרוסקופיה של גיליון אור. ההתקנה מאופיינת בהרכבה אנכית של הצמח על פני ג'ל ומאפשרת לו לצמוח בתנאי אור מבוקרים. זה מאפשר תצפית ארוכת טווח על התפתחות איברי הצמח בתנאים סטנדרטיים.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

למדו שיטת הדמיה קונפוקלית פשוטה לטווח ארוך לפיתוח שורשים והיפוקוטיל בצמחים. השיטה מאפשרת מעקב אחר אירועים תאיים ומורפוגנזה ב-Arabidopsis thaliana ברזולוציה תת-תאית.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

גלה סרטונים נוספים