בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לעקוב אחר שינויים פתולוגיים של מלריה מוחית ניסיונית in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפתוגנזה של מלריה מוחית ניסיונית, מכיוון שהיא מאפשרת לנו לדמיין in vivo כיצד הפתולוגיה של המוח כולו מתפתחת במרחב ולאורך זמן. הטכניקה מאפשרת הערכה מפורטת של פתולוגיה מוחית, וניתן להשתמש בה כדי להעריך את היעילות של אסטרטגיות טיפול חדשות במלריה מוחית.

יבצע את מערך ה-MRI מנואל פישר, מנהל המעבדה שלנו. התחל באיסוף יתושים נקבות מהכלוב שלהן, 17 עד 22 יום לאחר ארוחת הדם. השתמש במלקחיים כדי להניח שלושה עד ארבעה יתושים על מגלשת זכוכית, בשילוב עם טיפה של מדיום RPMI קר.

לאחר מכן, הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ. מתחו בזהירות את היתוש בין הראש לגוף בעזרת מלקחיים, והשתמשו במזרק ובמחט כדי לבודד את בלוטת הרוק. לאחר מכן, אספו את בלוטות הרוק ממגלשת הזכוכית על ידי יניקתן עם פיפטת זכוכית, והעברתן לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, השתמש במקל פלסטיק קטן כדי לרסק את בלוטות הרוק המבודדות בתוך צינור הצנטריפוגה למשך שלוש דקות על מנת לבודד את הספורוזואיטים מרקמת בלוטת הרוק. צנטריפוגה למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 1,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי לטהר את הספורוזואיטים מהרקמה שנותרה. פיפטה את הסופרנטנט, המכיל את הספורוזואיטים, לצינור צנטריפוגה חדש, וספרו את הספורוזואיטים המטוהרים בהמוציטומטר נויבאואר.

ספורוזואיטים מראים תנועה טיפוסית נגד כיוון השעון. לאחר מכן, התאם את ריכוז הספורוזואיטים המטוהרים ל-10,000 למיליליטר על ידי הוספת מי מלח עם חוצץ פוספט. לבסוף, הנח עכבר C57BL/6 במסננת, והכניס את זנבו למים חמים כדי לדמיין טוב יותר את וריד הזנב.

לאחר מכן, הזריק בסך הכל 1,000 ספורוזואיטים, או 0.1 מיליליטר, לווריד הזנב כדי ליזום זיהום. התחל בהבאת העכבר לסורק תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים 9.4T, או MRI, המשתמש בתהודה עוצמת קול להעברת תדרי רדיו. לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים דקספנטנול על שתי העיניים.

הפעל את אמבט המים מבוקר הטמפרטורה ל-42 מעלות צלזיוס על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר. לאחר מכן, הנח קטטר וריד זנב לתוך וריד הזנב של העכבר. לאחר מכן, מקם את העכבר ל-MRI על ידי הנחתו על הבטן ועם גב מעוך על מיטת בעלי חיים המצוידת במנעול ראש ומוט שיניים כדי למזער את תנועת הראש.

הקפד לא ליישר את עמוד השדרה הצווארי של העכבר. חבר מערכת הזרקת חומר ניגוד מלאה ב-0.3 מילימול לק"ג Gd-DTPA לצנתר וריד הזנב. לאחר מכן, הנח את סליל ראש מקלט פני השטח של מערך שלבים 4 ערוצים על ראש העכבר.

לבסוף, הניחו משטח נשימה על גב העכבר ובדקו את הנשימה במכשיר הניטור. הפעל את הלייזר המיקומי על ידי לחיצה על F2 בלוח הבקרה, והזז את העכבר עד שנורית המיקום האופקית תהיה באמצע החלק הקטן יותר של הסליל, המכסה את ראש העכבר. כבה את הלייזר המיקומי על ידי לחיצה נוספת על F2 ולאחר מכן הזז את העכבר למצב הסופי על ידי לחיצה על F3 בלוח הבקרה.

התחל בביצוע סריקה מקומית כדי לוודא שמוח העכבר נמצא באיזוסנטר של המגנט. להעריך באופן איכותי בצקת וזוגנית באמצעות הדמיה משוקללת T2 תלת מימדית. בחרו רצף נדיר מרובה פרוסות, והתאימו את מיקום הפרוסה, וודאו שכל המוח, מהאף ועד למוח הקטן, מכוסה.

לאחר התאמת פרוסות הרוויה, התחל את הרצף והמתן 10 דקות ו-48 שניות כדי להשיג את התמונות. לאחר מכן, בצע רלקסומטריית T2 כדי להעריך כמותית בצקת וזוגנית על ידי בחירת רצף הד מרובה פרוסות ומרובה ספין. התאם את מיקום הפרוסה והתחל ברכישת הרצף, שנמשכת שמונה דקות ו-53 שניות.

כדי להעריך כמותית הן בצקת וזוגנית והן בצקת ציטוטוקסית, בצע הדמיה משוקללת דיפוזיה על ידי בחירת רצף דיפוזיה של EPI ספין-הד. התאימו את מיקום הפרוסה ואת פרוסת הרוויה. לאחר מכן התחל את הרצף והמתן שבע דקות ו-56 שניות עד לקבלת התמונות הגולמיות.

לאחר מכן, העריכו מיקרו-דימומים, באמצעות הדמיה תלת מימדית T2 משוקללת כוכב. בחר רצף FLASH מפוצה זרימה, התאם את מיקום הפרוסה והתחל את הרצף, שנמשך 15 דקות ו-40 שניות. לאחר מכן, העריכו את הסבלנות העורקית באמצעות זמן הטיסה אנגיוגרפיה על ידי בחירת רצף FLASH תלת מימדי.

התאם את מיקום הפרוסה, התחל את הרצף ולאחר מכן המתן שבע דקות ו-16 שניות עד לקבלת התמונות. לבסוף, העריכו את ההפרעה במחסום הדם-מוח. בחר הדמיה משוקללת תלת מימדית T1 עם רצף FLASH, התאם את מיקום הפרוסה והתחל את הרצף.

המתן דקה ו-14 שניות עד לקבלת תמונות ללא ניגודיות. לאחר מכן, הזרקו ניגודיות של 0.3 מילימול לק"ג וחזרו על המדידה. עלייה בהפרעה במחסום הדם-מוח ועלייה בנוזלים מצביעים על בצקת וזוגנית מוקדמת בפקעת הריח שכבר קיימת במחלה קלה, ומתחילה להתפשט לכיוון גזע המוח ככל שחומרת המחלה עולה.

במפות T2, ניתן לכמת את חומרת הבצקת הווזוגנית על ידי ציור אזורי עניין לאזורים אנטומיים ספציפיים. עבור כל אזור ניתן להשיג זמן הרפיה של T2 שגדל עם בצקת גוברת. יתר על כן, נפח המוח המעיד על בצקת מתחיל לעלות באופן משמעותי בעכברים חולים בינוניים בהשוואה לנקודת ההתחלה, ועלייה נוספת בעכברים חולים קשה.

לבסוף, פתולוגיה מיקרו-וסקולרית, כפי שמעידים מיקרו-דימומים ועלייה בניגודיות הרגישות לכלי הדם, מתרחשת לאחר הסימנים הראשונים להפרעה במחסום הדם-מוח בבצקת וזוגנית. מיקרו-המורג'ים אלה מופיעים בעיקר בפקעת הריח. אם מתקבל פרוטוקול MRI מלא, ניתן לקבל את כל התמונות כולל המיקום תוך שעה, אם הוא מבוצע כראוי.

הפרוטוקול המינימלי צריך לכלול רצף משוקלל T2 או רלקסומטרי T2, ורצף משוקלל כוכב T2 על מנת לשפוט נוכחות של בצקת וזוגנית, עומס מיקרו-המורג ופגיעה מיקרו-וסקולרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד MRI של כל המוח מדמה שינויים פתולוגיים במלריה מוחית ניסיונית, כולל שינויים כמו נפיחות במוח, שקשה לזהות ex vivo.