מדידת דוגמנות התכווצות ייבוש אנושי שכבה קרנית
1 במרץ 2017
מאמר זה מתאר שיטה לכימות התנהגות הייבוש הדינמית תכונות מכאניות של שכבה קרנית על ידי מדידה נפתרה מרחבית ב-מטוס התקות ייבוש של דגימות רקמה עגולות דבקות מצע אלסטומר. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד עד כמה שונה טיפולים כימיים לשנות תכונות מכאניות ייבוש ורקמות.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לכמת את הנוקשות המכנית הדינמית ואת הצטברות מאמצי הייבוש בדגימות ex vivo של שכבת הקרנית (stratum corneum) אנושית, לאחר טיפולים כימיים שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביומכניקה ומדעי הקוסמטיקה, כגון כיצד ההרכב של ה-stratum corneum או טיפול ברקמת העור באמצעות מוצרי טיפוח אישיים עשויים להשפיע על תכונותיה המכניות ועל התנהגות הייבוש הדינמית שלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה חלופה מהירה יותר לשיטות הערכה מכניות אחרות, דורשת כמות קטנה משמעותית של רקמת עור ומספקת ייבוש רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית על ידי מניעת התאיידות מהצד התחתון של הדגימה.
להכנת זכוכית כיסוי מצופה באלסטומר, הכינו תחילה מעבה Sylgard 184 עם מוצקי הבסיס ביחס של 55 ל-1 בין הבסיס למעבה, עד לקבלת תמיסה הומוגנית. יש להכין כמות כוללת של שישה גרמים. לאחר מכן, בצעו ניתור אוויר (de-gas) לתמיסה.
לאחר מכן, השתמש בתמיסה כדי לצפות את הזכוכיתים על מכשיר spin coater. בעזרת פיפט בעל קוטר רחב, טפטף 1 mL מהתערובת למרכז הזכוכית. לאחר מכן, בצע spin coating לזכוכית במהירות של 2,000 rpm למשך 60 שניות.
הכינו חמישה או שישה לוחות כיסוי מצופים באופן זה. כדי להקשيح את לוחות הכיסוי, השאירו אותם בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 12 שעות. למחרת, מדדו את עובי שכבות האלסטומר.
השתמשו בלהב תער כדי להרים קצה אחד של סרט האלסטומר מהלוחית (coverslip). לאחר מכן, השתמשו בטוש בלתי נמחה כדי לסמן את הצד העליון של סרט האלסטומר ואת הלוחית המטופלת שמתחתיו. כעת, באמצעות מיקרוסקופ הפוך, מדדו את גובה ה-Z בין מידורי המוקד של הסימונים כדי למדוד את עובי הסרטים.
יש לעקוב אחר הפרוטוקולים הסטנדרטיים להכנת רקמת ה-SC. להכנת הדגימות, יש לקחת פאנצ'ים בקוטר שש מילימטרים מה-SC. על הדגימות, יש לסמן בעזרת טוש בלתי נמחה נקודה במרכז הפנים החיצוניות. לאחר מכן, יש להניח חרוזי סימון פלואורסצנטיים על פני השטח של ה-SC על ידי ציפה של הדגימות ב-15 milliliters של מים, המכילים כ-90 microliters של תרכיז חרוזים.
בצעו ערבוב עדין למשך 30 דקות והתאימו את ריכוז החרוזיקים לפי הצורך. לאחר הטיפול, טבלו כל דגימה במים כדי להצמידה לאלסטומר. מקמו זכוכית כיסוי מצופה בזווית רדודה, של 15 עד 30 מעלות, מתחת ל-SC, כאשר האלסטומר פונה לצד התחתון של ה-SC. לאחר מכן, הרימו את זכוכית הכיסוי מהמים כאשר ה-SC מודבק מעליה, ובכךבצעו למינציה חלקה של דגימת ה-SC ללא קמטים או בועות אוויר כלואות.
בשלב הבא, ייבשו את הדגימות המורכבות בתנאי סביבה למשך כשעה. לאחר הייבוש, העבירו את הדגימות לתא אטום הרמטית המכיל כלי עם מים. המתינו 24 שעות כדי שהדגימות יגיעו לשיווי משקל עם הלחות.
ביום למחרת, רכבו דגימה לתא פרפוזיה עבור סשן הדמיה ממושך. הניחו את תא הפרפוזיה מעל התשתית ואטמו את קצוות תא הפרפוזיה לאלסטומר באמצעות גריז ואקום. לאחר מכן, רשמו תמונות של אור פלורסצנטי ואור חודר עם שדה ראייה רחב מספיק כדי ללכוד את דגימת ה-SC המלאה.
במהלך 16 השעות הבאות, צלם תמונה בכל 10 דקות. בתוך מapay פטור כימי, מלא מכסה פלסטיק קטן ב-1 mL של silane. העבר את המכסה אל תוך מכל סגור המכיל כיסוי זכוכית (coverslip) אחד עם ריפוד elastomer, ללא מגע ישיר.
השאירו אותם לדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש שעות. בזמן ההמתנה, הכינו 20 מיליליטר של תמיסת חרוצים בהתאם לפרוטוקול הכתוב ולאחר מכן שפכו אותה לתוך צלחת של 10 סנטימטרים. לאחר חמש שעות, הניחו באיטיות את התשתיות שעברו סילנציה, כאשר צד האלאסטומר פונה כלפי מטה, לתוך תמיסת החרוצים.
העמסו שתי תשתיות לכל צלחת והניחו לתשתיות להגיב עם החרו지를 במשך 45 דקות. לאחר מכן, הסירו את התשתיות באמצעות פינצטה ושטפו אותן במים מזוקקים כדי להסיר את החרוזים שאינם קשורים. לאחר מכן ייבשו אותן תחת זרם עדין של אוויר דחוס ואחסנו אותן בקופסה אטומה ואטומה לאור.
בעזרת הטכניקה שתוארה קודם לכן, העבירו את דגימות ה-SC אל מצע מטופל בתוך אמבט מים. מיד לאחר קיבוע ה-SC, טפטפו עליו טיפה של 5 µL של תמיסת חרוזי סימון פלואורסצנטיים ללא דילול. לאחר מכן, הניחו ל-SC להתייבש במשך 60 דקות.
כעת, מדדו את עובי ה-SC באמצעות מיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית 40x בתא פרפוזיה. מדדו את עובי ה-SC לאורך זמן, תוך שימוש באביזר מיקוד מרחוק כדי לתעד את ההפרש בגובה Z בין שתי שכבות החרוצים. שכבה אחת נמצאת בממשק שבין ה-SC לתשתית והשנייה נמצאת מעל ה-SC. באמצעות הטכניקות המתוארות, הוכנה דגימה של SC וכוסתה בחרוצים פלואורסצנטיים.
לאחר 16 שעות של ייבוש, בלחות יחסיות של 25%, נמדדו ההעתקים. בשל הסימטריה המעגלית של הדגימות, העתקים אלו עברו מיצע אזימוטלי. לאורך תהליך הייבוש, ההעתקים האזימוטליים נותרים קטנים.
עם זאת, פרופילי ההעתקה הרדיאלית עלו באופן מונוטוני מהמרכז אל הקצה והגדילו את עוצמתם עד להגעה לשיווי משקל. פרופילים שנרשמו במרווחי זמן של 30 דקות מראים את התפתחות ההעתקות במישור לאורך זמן. עובי ה-SC הממוצע פחת במהלך הייבוש, בעיקר במהלך השעתיים הראשונות.
לאחר מכן, נותחה דינמיקת הייבוש על ידי התאמת פרופילי ההעתקה למודל התכווצות אלסטי ליניארי באמצעות גישת ריבועו המינימלי של השגיאות. מהמודל הופקו מאמץ הייבוש ההתכווצתי ומודול האלסטיות. שני הפרמטרים עלו במהירות במהלך השעתיים הראשונות של הייבוש.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להדביק את הדגימות על התשתית באופן מלא. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון צביעת ליפידים, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד טיפולים קוסמטיים מסוימים משנים את הרכב הליפידים ברקמה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לכימות הקשיחות המכנית הדינמית והתנהגות הייבוש של שכבת הקרנית של העור האנושי (stratum corneum). באמצעות מדידת הסטות ייבוש במישור של דגימות רקמה על מצע אלסטומר, הטכניקה מעריכה כיצד טיפולים כימיים משפיעים על תכונות הרקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביומכניקה
- מדע קוסמטי
רקע
- הבנת התכונות המכניות של השכבה הקרנית (stratum corneum) היא חיונית ליישומים של טיפול בעור.
- שיטות נוכחיות עשויות לדרוש יותר רקמה או זמן מהרצוי.
- התנהגות התייבשות דינמית עשויה להשפיע על יעילותם של מוצרי טיפוח אישיים.
מטרת המחקר
- לכימות מאמצי ייבוש וקשיחות מכנית בדגימות עור ex vivo.
- להערכת ההשפעה של טיפולים כימיים שונים על תכונות העור.
- לספק חלופה מהירה לשיטות קיימות להערכה מכנית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת לוחות כיסוי מצופים באלסטומר באמצעות Sylgard 184.
- מדידה של הסטות ייבוש ברזולוציה מרחבית.
- הערכת תכונות מכניות לאחר הטיפול.
- מניעת התאיידות מהצד התחתון של הדגימה לשמירה על רלוונטיות פיזיולוגית.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה מהירה של תכונות מכניות של העור.
- טיפולים כימיים שונים משנים באופן משמעותי את התנהגות הייבוש.
- נדרשת כמות רקמה קטנה יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- טכניקה זו משפרת את ההבנה של הביומכניקה של העור.
- היא מספקת תובנות לגבי ההשפעות של מוצרי קוסמטיקה על העור.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את פורמולציית המוצר ואת יעילותו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ורלוונטית פיזיולוגית של התכונות המכניות של ה-stratum corneum בתנאי ייבוש, ובכך תומכת בהערכה בשלבים מוקדמים של פורמולציות לקוסמטיקה וטיפוח אישי. באמצעות כימות שינויים דינמיים במתח הייבוש ובמודול האלסטיות, היא מספקת תובנות ניבויות לגבי תפקוד מחסום העור ועמידות הרקמה, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בקווי פיתוח מוצרים. גישה זו, המתאפיינת בתפוקה גבוהה ובדרישה לרקמה מועטה, משפרת את יעילות הסריקה ומפחיתה את ההסתמכות על בדיקות מכניות מסורתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן כיצד טיפולים קוסמטיים משנים את התכונות הביומכניות של ה-stratum corneum, ובכך תומך בבדיקת היפותזות מכניסטיות.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה מהירה של השפעות פורמולציות על קשיחות הרקמה ומתח ייבוש תוך צריכה מינימלית של דגימות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פרופילים כמותיים של עקירה ברזולוציה מרחבית, המתואמים לשינויים בתכונות המכניות במהלך הייבוש.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות והמדידה באמצעות דקיקות מעגליות המודבקות לאלסטומר, ובכך משפר את השחזוריות בין קבוצות הטיפול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין שינויים בהתנהגות הייבוש המושרים על ידי הפורמולציה לבין שלמות מחסום העור, ובכך תומך ברלוונטיות תרגומית לתוצאות בריאות העור.
- ערך תפעולי: מספק קריאה רציפה של האבולוציה המכנית לאורך מחזורי ייבוש של 16 שעות, מה שמאפשר הערכת יעילות ברזולוציית זמן.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים שבהם מוערכת השפעת הפורמולציה על הביומכניקה של העור לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה, ובכך היא מהווה גשר בין סינון מולקולרי להערכה תפקודית של הרקמה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי האופן שבו מוצרי טיפוח אישיים משפיעים על המכניקה של ה-stratum corneum ועל הצטברות מאמצים המושרים על ידי ייבוש.
- סריקה: מספקת מבני רקמה-אלסטומר סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה, המתאימים להשוואה בין מספר תנאים בסריקות של פורמולציות.
- אנליטיקה: מחלצת את מאמץ הייבוש ואת המודול האלסטי מפרופילי העתקה מותאמים, מה שמאפשר השוואה כמותית של השפעות הטיפול לאורך זמן.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת בין דינמיקת ייבוש מכנית לבין תפקוד מחסום העור, ובכך מספקת מידע על הרלוונטיות הפרה-קלינית של התערבויות קוסמטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת חומרים פעילים קוסמטיים מגוונים, לחוחים ומנקי עור תחת תנאי ייבוש מבוקרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בהשפעות הפורמולציה על העמידות המכנית של הרקמה והתנהגות ייבוש הקשורה למחסום.
- ערך תפעולי: תפוקה גבוהה, צריכת רקמה נמוכה ומניעת ארטיפקטים של אידוי משפרים את אמינות הבדיקה ואת יכולת ההרחבה שלה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הפחתת סיכונים מוקדמת של מועמדים לפורמולציה על ידי זיהוי אלו המגבירים את העקה המכנית המושרית על ידי ייבוש.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של רכיבים קוסמטיים בהתבסס על תאימות ביו-מכנית ל-stratum corneum.
שיקולי יישום
- מומחיות במידול ביומכני ובניתוח תמונות למעקב אחר העתקה והתאמת מודלים.
- גישה למכשירי spin coater, תאי פרפוזיה ובקרה סביבתית לייבוש בבקרה של לחות.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ניקוב רקמות, סימון חרוצים (beads) וציפוי אלסטומר בין משתמשים שונים.
- שיקולי התאמה עבור עובי רקמות שונה או גמישות תשתית (substrate compliance) בעת הרחבת השימוש מעבר לשכבת ה-stratum corneum האנושית.
- מגבלה מעשית: השיטה מניחה התנהגות אלסטית ליניארית וסימטריה מעגלית, שייתכן ולא יתקיימו במצבי רקמה פתולוגיים או משונוים באופן חמור.
