דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי
18 בפברואר 2017
כדי ללמוד התקדמות גידול שחלות במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, spheroids רב-תאיים היו בתרבית microdevice תחת זרימת נוזל מדומה. מודל 3D דינמיקה זו מחק את סביבת intraperitoneal עם המרכיבים התאיים מכאניים שבו גרורות סרטן השחלות מתרחשות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פלטפורמת תרבית משותפת דינמית מבוססת מיקרופלואידית כדי לחקות את הסביבה התוך-צפקית עם המרכיבים התאיים והמכניים שבהם מתרחשות גרורות סרטן השחלות. על ידי שימוש במיקרו זה לפלטפורמה זו, הוא עוזר לענות על שאלות המפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון המיקרו-סביבה של התפשטות הצפק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתרבית משותפת תלת מימדית בזרימה חופשית מבוקרת מדויקת מחקה טוב יותר את התקשורת in vivo בין תאי סרטן השחלות לתאי מתותדיה המתרחשת בחלל הצפק.
לאחר תכנון ושרטוט דפוס התעלה המיקרופלואידית והפקתו על פי פרוטוקול הטקסט, יש לסובב שכבה של SU82075 Photoresist על פרוסת הסיליקון במהירות סיבוב של 1800 סל"ד. אופים את הוופל המצופה בפוטו-רזיסט ישירות על פלטה חמה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. ואז בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי להסיר עודפי ממס.
סובב שכבה שנייה של SU82075 Photoresist על הפרוסה לעובי סופי של 250 מיקרומטר. הנח את הוופל המצופה בפוטו-רזיסט ישירות על פלטה חמה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות ולאחר מכן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני קירור איטי של הוופל לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יישר והנח את מסכת הצילום ישירות על גבי הוופל.
לאחר מכן חשוף אותו לאור UV למשך 20 שניות כדי לחצות את התבנית. על צלחת חמה אופים את הוופל המצופה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות כדי להסיר את הממס לקראת הקדמה. הסר את ה-Photoresist שאינו באורך צולב על ידי טבילת הפרוסה במפתח SU8 למשך 25 דקות.
לאחר מכן עם איזופרופנל, שטפו את הוופל והשתמשו באוויר בלחץ כדי לייבש אותו. שלב את בסיס הפולידימתילסילוקסן או PDMS וחומר הריפוי ביחס מסה של 10 לאחד והשתמש במיקסר הצנטריפוגלי מתחת לפונקציית הערבוב והגז כדי לערבב את התמיסה. יוצקים לאט את תערובת ה-PDMS על הוופל לגובה של כחמישה מילימטרים.
הסר את ה-PDMS במייבש ואקום למשך 40 דקות. לאחר מכן רפאו את ה-PDMS בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. קלף בזהירות את לוח ה-PDMS מהמאסטר וחתוך את ה-PDMS לאורך התעלות עד שהוא בגודל של מגלשת זכוכית.
לאחר מכן, בעזרת אגרוף ביופסיה של מילימטר אחד, נקב את ה-PDMS כדי ליצור את הכניסות והיציאות של המכשיר. השתמש באוויר בלחץ כדי לנקות את משטח ה-PDMS ולאחר מכן בעזרת סרט דבק, הסר את האבק ופסולת ה-PDMS. כעת הנח את לוח ה-PDMS כשצד התעלה פונה כלפי מעלה לתוך מנקה פלזמה.
לאחר מכן מקם שקופית זכוכית נקייה לתוך שואב הפלזמה לצד לוח ה-PDMS. טפל ב-PDMS ובמגלשת הזכוכית מתחת לפלזמת אוויר בתדר רדיו גבוה או ברמת RF למשך דקה אחת. לאחר מכן, לאחר הוצאת הדגימות ממנקה הפלזמה, קשרו את ה-PDMS לשקופית הזכוכית כדי ליצור קשר קוולנטי בלתי הפיך.
הנח את שבב ה-PDMS על פלטה חמה בטמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לשפר את חוזק ההדבקה ולהחזיר את ההידרופוביות של ה-PDMS לפני השימוש. כדי לצפות תעלות מיקרופלואידיות בפיברונקטין, התחל בשימוש ב-30 מיקרו-ליטר של אתנול 75% כדי לעקר את התעלות. הסר את האתנול והשתמש ב-PBS כדי לשטוף את התעלות פעמיים.
ואז שאב היטב את ה- PBS מהערוצים. הכינו 10 מיקרוגרם למיליליטר תמיסת פיברונקטין במדיום M199MCDB105 נטול סרום עם 30 מיקרוליטר מהתמיסה, מלאו לאט את התעלות והשתמשו בסרט כדי לאטום אותן. לאחר מכן דגרו את השבב בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
כדי לזרוע תאי מזותליה צפקית ראשוניים או HPMCs לתעלות המיקרופלואידיות, לאחר שטיפת תאים מתורבתים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בשני מיליליטר של מדיום תרבית FBS של 10% כדי להשעות מחדש את ה- HPMCs. בעזרת המוציטומטר, ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים ל -3.5 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר. יש לחמם את השבב המיקרופלואידי המצופה פיברונקטין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני השימוש.
לאחר מכן שאפו לחלוטין את תמיסת הפיברונקטין והזרימו לאט לאט 30 מיקרוליטר של תרחיף HPMC לכל ערוץ. השתמש בסרט כדי לאטום את התעלות ולהניח את המכשיר בחממת ה-CO2 למשך הלילה. כדי לגרום להיווצרות ספרואידים של סרטן השחלות, יש להמיס 0.5% אגרוז במים מעוקרים.
הוציאו 50 מיקרוליטר מתמיסת האגרוז לבארות של 96 צלחות באר. לאחר ספירת תאי סרטן אפיתל אנושיים שתורבתו בעבר, השעו מחדש את התאים במדיום תרבית FBS של 5% בצפיפות של 5,000 תאים למיליליטר. העבירו 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר מצופה אגרוז.
ותרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2 למשך 48 שעות. העבירו את הספרואידים הסרטניים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר שהורטבו מראש במיליליטר אחד של מדיום נטול סרום וסובבו את הספרואידים במהירות של 750 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הכנת 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת CMFDA במדיום M199MCDB105 ללא סרום.
השעו מחדש את הספרואידים הסרטניים במיליליטר אחד של התמיסה ודגרו על הספרואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן ספרו את מספר הספרואידים והשתמשו במדיום נטול סרום כדי להתאים את הריכוז ל-2,000 ספרואידים למיליליטר. לפני העמסת הספרואיד, יש להזריק לאט 100 מיקרוליטר של מדיום M199MCDB105 נטול סרום כדי לשטוף את תאי המזותליו שאינם דבוקים בתוך התעלות.
טען 30 מיקרוליטר של תרחיף ספרואיד עם תווית פלואורסצנטית לכל ערוץ. לאחר מכן הנח את השבב המיקרופלואידי לתוך חממת ה-CO2. הרכיבו פלטפורמת שפע על ידי חיבור מזרק עמוס במדיום M199MCDB105 טרי ללא סרום לצינור באורך מטר אחד.
הנח את המזרק על משאבת המזרק ואבטח את הבוכנה ואת גוף המזרק. לאחר מכן התקן את משאבת המזרק במצב אופקי באותו גובה כמו השבב המיקרופלואידי בתוך החממה. החדירו במהירות את כל הצינור במדיום על ידי לחיצה ממושכת על כפתור המהירות קדימה עד שהמדיום יעלה על גדותיו בצינור.
לאחר מכן הפעל את ההזרקה בקצב הזרימה הרצוי. חבר את הצינור לכניסת הערוץ בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן השתמש בצינור פלט קצר כדי לחבר את יציאת התעלה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאסוף את מדיום היציאה.
לבסוף, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנטי כדי להתבונן ב-HPMCs ובספרואידים סרטניים. באמצעות הפלטפורמה המיקרופלואידית המתוארת בסרטון זה, ספרואידים של סרטן השחלות עוצבו עם תאים מזותליים בתנאים הידרודינמיים. כפי שמוצג באיור זה, תאים מזותליים שגודלו במיקרו-מכשיר במשך 16 שעות יצרו בהצלחה שכבה אחת של HPMCs.
בניסוי זה, ספרואידים רב-תאיים בקוטר של כ-100 מיקרומטר הדומים בגודלם לאלה שנמצאו בחברות חולים סומנו בצבע פלואורסצנטי ירוק CMFDA. לאחר מכן הועברו הספרואידים לתעלות מיקרופלואידיות מצופות HPMC ונשארו בתרחיף ומורפולוגיה של התאים נלכדה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות במשך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.
אחד מכל 10 בהליך זה, חשוב לזכור להימנע מהכנסת בועות אוויר לתעלות המיקרופלואידיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו טיפול תרופתי, בדיקות הידבקות, בדיקות פינוי מזותליה כדי לענות על שאלות נוספות, כמו השפעת המיקרו-סביבה האינטרופריטונאלית על התקדמות הסרטן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את הסטסטזיס הצפק בבני אדם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מיקרו-מכשיר צפקי עם זרימה נוזלית להתחלת התנהגות סרטן השחלות בחלל הצפק. אל תשכח שעבודה עם גופרית אורגנית כמו אצטון, כמפתח וגליל עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באזהרות MP כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה כאשר אתה מבצע הליך זה לראשונה.
כל ההליכים הנוגעים למשרד זה צריכים להתבצע תחת כיסוי קיצוני.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמת תרבית משותפת (co-culture) דינמית מבוססת מיקרופלואידיקה, שתוכננה לדמות את הסביבה התוך-peritoneale הרלוונטית לגרורות של סרטן השחלה. המודל מאפשר לחקור את המיקרו-סביבה המעורבת בהפצה הפריטוניאלית של גידולי שחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר על סרטן השחלה
- מיקרופלואידיקה
- תרבית תאים בתלת-ממד
רקע
- סרטן השחלה גורם לעיתים קרובות לגרורות בתוך החלל הפריטוניאלי.
- הבנת מיקרו-סביבת הגידול חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- מודלים דינמיים יכולים לשחזר תנאי in vivo בצורה טובה יותר בהשוואה לתרביות סטטיות.
- מערכות מיקרופלואידיקה מאפשרות בקרה מדויקת על אינטראקציות תאיות.
מטרת המחקר
- ליצור מודל המדמה את הסביבה הפריטוניאלית לצורך חקר סרטן השחלה.
- לחקור את האינטראקציות בין תאי סרטן השחלה לבין המיקרו-סביבה הסובבת אותם.
- להשיב על שאלות מפתח בביולוגיה של הסרטן בנוגע להפצה פריטוניאלית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תכנון וייצור של תבנית ערוץ מיקרופלואידי.
- תרבית משותפת של תאי סרטן שחלה עם תאי methothedia.
- ציפוי ספין (Spin coating) של פוטורזיסט SU82075 על גבי פרוסת סיליקון.
- אפייה מבוקרת של הפרוסה המצופה בפוטורזיסט להסרת ממס עודף.
תוצאות עיקריות
- הפלטפורמה המיקרופלואידית מדמה בהצלחה את הסביבה in vivo.
- הבנה משופרת של תקשורת תאים בחלל הפריטונאום.
- הוכחת ההיתכנות של שימוש בתרביות תלת-ממדיות דינמיות למחקר סרטן.
- אספקת תובנות לגבי מנגנוני הגעת גרורות של סרטן השחלה.
מסקנות
- המודל המיקרופלואידי שפותח הוא כלי בעל ערך לחקר התקדמות סרטן השחלה.
- הוא מאפשר בחינה של אינטראקציות תאיות בסביבה מבוקרת.
- גישה זו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר נגד סרטן השחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גרורות של סרטן השחלה בחלל הפריטונאום נותרות אתגר מרכזי בפיתוח תרופות אונקולוגיות, בשל המחסור במודלים רלוונטיים פיזיולוגית הלוכדים הן את ארכיטקטורת הגידול התלת-ממדית והן את כוחות הנוזלים הדינמיים. פלטפורמה מיקרופלואידית זו נותנת מענה לפער קריטי על ידי כך שהיא מאפשרת לחקור אינטראקציות בין הגידול לסטרומה תחת מאמץ גזירה מבוקר, ומספקת ערך ניבוי משופר למכניזמים של התפשטות פריטונאלית. באמצעות אספקת מערכת תרבית משותפת (co-culture) תלת-ממדית, דינמית וניתנת לשחזור, המודל תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתגליות טיפוליות לסרטן השחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של התנהגות ספרואידים של סרטן השחלה במיקרו-סביבה דמוית פריטוניום כדי לתקף מטרות טיפוליות המעורבות במטסטזה.
- ערך תפעולי: תומך בתקיפות פונקציונלית של מטרות באמצעות מידול של תקשורת בין-תאית בין ספרואידים של סרטן לשכבות מונו-שכבה מזותליאליות תחת זרימה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות מדידות כמותיות של נדידה והיצמדות של ספרואידים תחת מאמץ גזירה לצורך סריקת תרכובות בתנאים הרלוונטיים למטסטזיס.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמת תלת-ממד דינמית וסטנדרטית לפיתוח בדיקות, עם תאימות לדימוי בזמן אמת ואפשרות לטעינת ספרואידים ניתנת להרחבה.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש בגדלי ספרואידים הרלוונטיים למטופלים (~100 μm) ובתאי מזותליום פריטונאליים כדי להגביר את הנאמנות התרגומית (translational fidelity) של מודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית על ידי תמיכה במבחנים המשכיים כגון טיפול תרופתי ומדידות פינוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הפלטפורמה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), במיוחד עבור תוכניות למחקר סרטן השחלות המתמקדות בגרורות, שבהן לנאמנות לסביבה המיקרוסביבתית יש השפעה על רמת הביטחון בתוצאות החיזוי.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מידול השפעת הדינמיקה של הנוזל הפריטונאלי על התנהגות הספרואידים ואינטראקציות מזותליאליות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון נדידה והיצמדות של ספרואידים תחת זרימה, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת במעקב מבוסס פלואורסצנציה ובניתוח מורפומטרי של התנהגות ספרואידים בזמן אמת תחת תנאים מבוקרים.
- מחקר תרגומי: משתמשת בממדי ספרואידים ובסוגי תאים פריטונאליים רלוונטיים מבחינה קלינית כדי לשפר את הרלוונטיות למטסטזות בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכנן כמערכת מיקרופלואידית מודולרית הניתנת להתאמה לסוגי סרטן מרובים ולתרביות קו-סטרומליות מעבר לסרטן השחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בתוצאות החיזוי באמצעות לכידת רמזים ביומכניים וביוכימיים החסרים בתרביות סטטיות בדו-ממד (2D) או תלת-ממד (3D).
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לציפוי תעלות, טעינת ספרואידים ובקרת זרימה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת יותר של תגובות לתרופות התלויות במיקרוסביבה.
- השפעה על פורטפוליו הפיתוח: תומך בתיעודוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפול המכוונים למטסטזיס באמצעות מידול פרה-קליני רלוונטי פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- ייצור המכשיר דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידי, פוטוליתוגרפיה והדבקת PDMS.
- נדרשות יכולות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות כדי לעקוב אחר ספרואידים מסומנים ואינטראקציות תאיות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת הקפדה קפדנית על פרוטוקולים של ציפוי תעלות, זריעת תאים וקצב זרימה.
- התאמה לסוגי גידולים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של גודל הספרואיד, מקור תאי הסטרומה ופרמטרי מאמץ גזירה.
- מגבלות מעשיות כוללות את מורכבות הרכבת המכשיר ואת הצורך בטיפול אספטי במהלך תרבית רב-יומית תחת זרימה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Microfluidic Device Master Design
2:32
Polydimethylsiloxane Chip Fabrication
4:26
Seeding the Microfluidic Chip with Primary Peritoneal Mesothelial Cells
6:08
Ovarian Cancer Spheroid Formation and Co-culture
8:09
Perfusion Platform Assembly and Co-culture
9:16
Results: Ovarian Cancer Spheroid Behavior in a 3D Peritoneal Microfluidic Device
10:09
Conclusion
