Name: ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: למד שיטת מורפומטריקה מתקדמת לניתוח Baculum בעכבר באמצעות microCT וסימון נקודות חצי-לנדמרק. גישה זו מאפשרת מדידה מדויקת של עצמות מורכבות ללא נקודות ציון ברורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טים דיילי ואנדרו סמית נתן הרבה דיונים חישובית שימושי במהלך הימים הראשונים; טים דיילי כתב התוכנית rotate_translate_cylindrical הכרחי פרוטוקול 5. משאבים חישובית נמסרו על ידי אשכול מחשוב עתיר ביצועים באוניברסיטת דרום קליפורניה. עבודה זו נתמכה על ידי GM098536 # מענק NIH (MDD).

כל הנהלים ואנשי אושרו על ידי אוניברסיטת מכון דרום קליפורניה טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 11,394. 1. Baculum Dissection והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר זכר בוגר מינית באמצעות פחמן דו חמצני חשיפת יתר, על פי פרוטוקולים שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול המוסדית בעלי החיים והשימוש הרלוונטי (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החיה במצב שכיבה, ו מתארך הפין על ידי הפעלת לחץ בעזרת אגודלים לרוחב פתח preputial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפין הוא ממושך, להאריך את הרקמה דרך העורלה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים, לחתוך את הפרוקסימלי גוף הפין אל העטרה שבו baculum מתגורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפין הגזור לצינור מיליליטר 1.7 ולהוסיף 200 μL מי ברז. ודא כי הפין הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הרקמות במים ב ~ 50 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים. </li><li&gt; לאחר דגירה כראוי, יש להסיר את הרקמה שמסביב מן baculum, באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעדינות להשפריץ 70% אתנול להתנדף הנותרים רקמות ולנקות את העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את baculum גזור לתוך צינור microcentrifuge חדש עם הכובע פתוח. השאר מכסה פתוח O / N להתייבש עצם. </li></ol> 2. סריקת microCT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעל סריקה גלילי microCT לתוך לבנים של קצף פרחים ליצור גליל קצף פרחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את גליל קצף הפרחים לחתוך פרוסות ~ 2-5 ס&quot;מ עובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push היבש bacula לתוך קצף הפרחים, סביב בפריפריה של פרוסה בודדת כדי למזער הפרעה במהלך סריקה. האורינטציה המדויקת של עצמות חובה לציין המאפשר זיהוי נכון של דגימות בודדות בפרוטוקול 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום פרוסה עם העצמות מוטבעות לתוך מחזיק microCT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת סריקות microCT. במקרה של העכבר bacula 14 </sup&gt; השתמשנו סורק uCT50 (AG רפואי Scanco, ברוטיסלן, שוויץ) במרכז הדמיה מולקולרית USC תחת ההגדרות הבאות: 90 KVP, 155 מיקרו-אמפר, 0.5 מ&quot;מ מסנן אל, 750 תחזיות לכל 180 (360 כיסוי), זמן החשיפה של 500 ms, וגודל voxel של 15.5 מ&quot;מ. </li></ol> 3. עיבוד microCT: המרת .DCM סטאק לקובץ .xyz יחיד הערה: כל סריקת microCT מייצרת ערימה של .DCM, או &quot;DICOM&quot;, קבצים מייצגים פרוסות תמונה נלקח דרך האובייקט. כל בגיאומטריה חישובית במורד דורשת קבצי .xyz שטוחים, אשר היא פשוט קובץ טקסט המכיל ארבעה עמודים - x, y, ו Z קואורדינטות של כל פיקסל, ואת עוצמת פיקסל, החל -5000 (שחור) עד 5000 (לבן). סף פיקסל מעל 3,000 בדרך כלל עובד גם סף להגדרת עצמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן פייתון (www.python.org) ואת המודולים &quot;פייתון&quot; פקודות, DICOM, PYLAB, SYS, ו numpy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 01_pr פתח &quot;ocess_dicom.py &quot;{Figshare} עם כל עורך טקסט. על פי סעיף משתנים, נתיב השינוי, ספי פיקסל, ושמות הספרייה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל &quot;פיתון 01_process_dicom.py&quot;. התקדמות תודפס למסך. בתוך כל תיקייה בשם בשלב 3.2, קובץ חדש מובא בשם; למשל, directory_name.PT3000.xyz, שבו PT3000 מציין את סף פיקסל שצוין בשלב 3.2. </li></ol> 4. עיבוד microCT: פילוח-אאוט פרט דגימת .xyz קבצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן R (https://www.r-project.org/) עם RGL הספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתחו את הקובץ &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {Figshare} עם כל עורך טקסט. על פי הסעיף משתנה, לשנות את שם הנתיב להצביע על קובץ .xyz נוצר בפרוטוקול 3 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך R, הפעל את הפקודה &quot;המקור (&quot; 02_segment_dicoms.r &#39;) &quot;(ללא מרכאות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלושת ממדי התמונה של הקובץ .xyz נוצר בפרוטוקול 3 מופיע, הזן את number של דגימות בקובץ .xyz הכולל. עליו מדבקה ובחר את נקודות מכל הדגימה באמצעות פונקציות גלילה וזום. הערה: ברקע, קבצי .xyz נפרדים ייעשו עבור כל דגימה. אלו מופיעות ספרייה בשם, למשל, XYZ_FILES_PT3000, שבו PT3000 מציין את סף פיקסל בשימוש. </li></ol> 5. &quot;יישור&quot; הדגימה .xyz קבצים לקואורדינטות נפוצות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את סקריפט פייתון &quot;03_transform.py&quot; {Figshare}, המחייב את mattdean_modules.py מודול נוסף {Figshare}, וכן שני יישומים עומד עצמית: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) ו &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm) המשמשים התסריט הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי הסעיף משתנה, לזהות את שמות נתיב המלאים mattdean_modules.py, rotate_path ו qconvex_dir. בנוסף, לזהות את הנתיב המלא אל הספרייה המכילה את .xy הפרטקבצי z שנוצרו בשלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 03_transform.py לרוץ, אשר יוצר קובץ חדש לכל דגימה עם הסיומת .TRANSFORMED.xyz. </li></ol> 6. דגימה &quot;חיתוך&quot; מיושרת .xyz קבצים לזהות-ציונית חצי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב ולהפעיל את סקריפט פייתון &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {Figshare}. במקטע משתנה, לזהות שמות מלאי נתיב לספרייה המכילה את קבצי .TRANSFORMED.xyz. סקריפט זה מזהה 802-ציוני למחצה, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת הגודל והצורה של המבנה. </li></ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2992207">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.italian-journal-of-mammalogy.it/article/view/6292">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li>
<li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered%2C+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li>
<li>Mitteroecker, P., Gunz, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11692-009-9055-x">Advances in geometric morphometrics.</a> Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).</li>
<li>Bookstein, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landmark+methods+for+forms+without+landmarks%3A+morphometrics+of+group+differences+in+outline+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Im.+Anal%22%5BJournal%5D)">Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape.</a> Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGunz%2C+P+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).</li>
<li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1162/biot.2009.4.1.84">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li>
<li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li>
<li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li>
<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול לעיל הם 1) לנתח את bacula, 2) איסוף תמונות microCT, 3) המרת פלט microCT לקובץ שטוח של XYZ קואורדינטות, 4) פילוח מתוך כל ענן הנקודה של דגימה, 5) הפיכה כל דגימה סטנדרטי מערכת קואורדינטות, ו -6) הגדרה-ציוני למחצה. כל הצעדים הללו היא לשנות בקלות כדי להתאים חפצים שונים. שיטות אלה ניתן ליישם עשויים חפץ שהוא בעצם &quot;מוט בצורה&quot;, או לפחות לא מעוקל מדי. אובייקטים כי עקום בחזרה על עצמם להיו...

תחום morphometrics כולל מגוון של שיטות לכמת את הגודל והצורה של הטופס ביולוגי, צעד מהותי בחקירה מדעית 1, 2, 3, 4, 5, 6. באופן מסורתי, הניתוח הסטטיסטי של גודל וצורה מתחיל על ידי זיהוי נקודות ציון על מבנה ביולוגי, ולאחר מכן מדידת מרחקים ליניארי, זוויות יחסיות, אשר יכול להיות מנותחת מסגרת רבה-משתנית. לנדמרק המבוסס הגיאומטרית Morphometrics הוא גישה אשר שומרת את המיקום המרחבי של ציוני דרך, שימור מידע גיאומטרי של איסוף נתונים באמצעות ניתוח להדמיה 5. ניתוח סדום כללי (GPA) יכול להיות מיושם כדי להסיר וריאצית מיקום, סולם, וסיבוב של ציונים דרך לייצר יישור בין דגימות מinimizes ההבדלים בריבוע שלהם - מה שנותר הוא שוני בצורה 7. מושג חשוב של כל ניתוח morphometric הוא הומולוגיה, או את הרעיון כי אחד מהימן יכול לזהות את האתרים המייצגים תכונות משמעות ביולוגית ודיסקרטיות המתאימים בין דגימות או מבנים. לדוגמא, יש גולגלות אדם תהליכים הומולוגיים, foramina, תפרים, ותעלות שיכולים לאפשר morphometric מנתח. למרבה הצער, את זיהוי של ציוני דרך מקבילים קשה על פני רבי מבנים ביולוגיים, במיוחד אלה עם משטחים חלקים או עקומות 8, 9, 10. אנחנו מתקרבים בעיה זו מתחת שימוש בגיאומטריה חישובית. זרימת העבודה הכללית היא ליצור סריקה תלת ממדים של האובייקט שניתן לייצג כענן של נקודות, ולאחר מכן לסובב ולהפוך כי ענן נקודה כך שכל זהpecimens מכוון על מערכת קואורדינטות משותפת. אז אנחנו מתמטיים להגדיר-ציונים חצי מאזורים ספציפיים של האובייקט. חצי ציוני דרך דיסקרטית דגש על אזורים כאלה הן ביולוגיים שרירותיות 11. ניצוח GPA ניתוחים סטטיסטיים רצף יכול לייצר חפצים לא רצויים 8, 12 משום ציונים דרך להציב באופן שרירותי לא יכול להיות ביולוגי הומולוגי. לכן, אנו נאפשר-ציונים חצי אלה מתמטיים &quot;להחליק&quot;. הליך זה מצמצם את הפרש הפוטנציאלים בין מבנים. כפי שטען במקום אחר האלגוריתם זז משמש כאן ראוי לכמת אזורי אנטומיים דומים חסרי זיהה בקלות מקבילה ציוני דרך 3, 6, 8, 10, 11, 12. שיטות אלה יש li שלהםmitations 13, אבל צריך להיות בעל יכולת הסתגלות לאובייקטים של גודל וצורה שונים. כאן, אנו מדגימים כיצד שיטה זו יושמה במחקר שנערך לאחרונה של baculum העכבר 14, עצם הפין כי כבר צבר ואבד מספר פעמים עצמאיות במהלך האבולוציה של יונקי 15. אנחנו דנים לנתיחה והכנת עצם ספציפי, baculum (פרוטוקול 1), הדור של תמונות microCT (פרוטוקול 2), ואת המרה של תמונות אלה לתבנית המאפשרת לכל בגיאומטריה חישובית במורד הזרם (פרוטוקולים 3 ו -4). אחרי השלבים הבאים, כל דגימה מיוצגת על ידי ~ 100K XYZ קואורדינטות. לאחר מכן, אנו עוברים דרך סדרה של טרנספורמציות כי ביעילות ליישר את כל הדגימות לתוך אורינטציה משותפת (הפרוטוקול 5), ואז להגדיר-ציוני חצי דגימות מיושרות (פרוטוקול 6). פרוטוקולים 1-4 צריכים להיות דומים ללא קשר של האובייקט להיות מנותח. 5 פרוטוקול ופרוטוקול 6 הם SPEcifically מיועד baculum, אך תקוותנו היא כי באמצעות פירוט הפעולות הבאים, חוקרים יכולים לדמיין שינויים זה יהיה רלוונטי עבור מושא העניין שלהם. לדוגמה, שינויים בשיטות אלה יושמו ללמוד עצמות לווייתנים האגן ועצמות הצלע 16.

<table><tbody><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>רוב הגדלים צריכים לעבוד</td></tr><tr><td>ניתוח מלקחיים, קצה עדין, מעוקל</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CAS 64-17-5</td><td>יש לדלל ל -70% לנתיחות</td></tr><tr><td>קצף פרחוני</td><td>סיטונאי</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>סורק uCT50&nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, שוויץ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח dissection, סריקה microct ו morphometric של baculum

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

morphometrics המודרנית מספקת שיטות רבות עצמה כדי לכמת וריאצית גודל וצורה. דרישה בסיסית רשימת קואורדינטות מגדירות ציוניות; אולם קואורדינטות כזה חייב לייצג מבנים הומולוגיים פני דגימות. בעוד אובייקטים ביולוגיים רבים מורכבים של ציוני דרך זיהו בקלות כדי לספק את ההנחה של הומולוגיה, רבים חסרים מבנים כאלה. פתרון אפשרי אחד הוא מתמטי-ציונים חצי מקום על אובייקט המייצג באותו האזור מורפולוגיים ברחבי דגימות. כאן, אנו ממחישים צינור שפותח לאחרונה להגדיר למחצה ציוני דרך מתמטית מן baculum העכבר (עצם הפין). השיטות שלנו צריכות לחול על מגוון רחב של חפצים.

קואורדינטות xyz של האתרים ההסטוריים חצי יוצר הפרוטוקול 6 ניתן לייבא ישירות לתוך כל ניתוח morphometrics הגיאומטרי מבוסס ציון 17. הצינור חישובית מעל יושם ללמוד עכבר bacula 14, כמו גם אגן לווייתן עצמות צלעות 16. פרטים נוספים על ההגדרה חישובית של אתרים היסטוריים חצי מוצגים כאן, בניסיון לסייע לחוקרים לחזות צעדים שהיו יכולים להיות שונה כדי להכיל אובייקט של מושא העניין שלהם. Baculum מ...

מבנים ביולוגיים רבים חסרים ציוני דרך להגדרה בקלות, מה שהופך אותו קשה ליישם שיטות morphometric המודרנית. כאן אנו מדגימים שיטות ללמוד את baculum העכבר (עצם הפין), כולל לנתיחה וסריקת microCT, ואחריו שיטות חישוביות להגדיר-ציוני למחצה המשמשים לכמת גודל וצורת וריאציה.

ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

המטרה הכללית של נתיחה זו ושל הניתוח המורפומטרי היא להדגים את היעילות של המתודולוגיה המורפומטרית שלנו למחקר של מבנים בעלי צורות מורכבות, כגון עצם הפין של העכבר. הרעיון למחקר זה עלה כאשר הבנו ששיטות קיימות למדידת שונות של ה-baculum, כגון מדידת ממדי אורך ורוחב, איבדו את כל המידע על קימור ומורכבות הצורה, ולכן פיתחנו שיטה זו כדי לכמת שונות בגודל ובצורה של כל עצם או מבנה רלוונטי בשלושה ממדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מיישמת מורפומטריה מודרנית על מבנים ללא נקודות סימון (landmarks).פעולה זו צפויה לקדם את התחום על ידי אספקת מדידות הניתנות לחזור ומשופרות של מבנים מורכבים. מקמו עכבר זכר בוגר מינית, שהורג בשיטת ההמתה (euthanized), במצב שכיבה על הגב (supine), והוציאו את הפין על ידי הפעלת לחץ עם האגודל לצד פתח הפרפוציה (preputial opening). לאחר שהפין מופיע, האריכו את הרקמה דרך הפרפוציה רחוק ככל האפשר.בשלב הבא, בעזרת מספריים, גזרו את גוף הפין פרוקסימלית לבלוטת הפין במקום בו נמצא ה-baculum, ובכך הפרידו את הפין. לאחר מכן, השקיעו את הפין באופן מלא בערך 200 µL של מי ברז בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה. כדי לרכך את הרקמה, דגרו אותה בטמפרטורה של כ-50 °C למשך שלושה עד חמישה ימים.ריכוך הרקמה מפחית את הסיכון לשבירת העצם במהלך השליפה. לאחר הדגירה, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה ובפינצטה כדי להסיר את רוב הרקמה הסובבת את ה-baculum. לאחר הדיסקציה הגסה, הזרם בעדינות 70% ethanol כדי להסיר את שאריות הרקמה ולנקות את העצם.לאחר מכן, העבירו את הבקולום (baculum) המנותח למבחנה חדשה למיקרוצנטריפוגה, והניחו לעצם להתייבש בטמפרטורה של החדר כאשר המכסה פתוח. ראשית, הכינו את החומר שבו תונח העצם. לחצו מחזיק גלילי לסריקת CT לתוך בלוק של ספוג פרחים.לאחר מכן, הוציאו את גליל הספוג שהתקבל וחתכו פרוסות ספוג בעובי של בין שניים לחמישה סנטימטרים. כעת, דחפו 10 עד 15 עצמות גב (bacula) מיובשות לתוך ספוג הפרחים מסביב להיקף של פרוסה בודדת כדי לצמצם הפרעות במהלך הסריקה. רשמו את הכיוון המדויק של העצם לצורך זיהוי עתידי.בשלב הבא, מקמו בזהירות את העצמות שבתוך הספוג במחזיק ה-micro CT והכניסו את המחזיק לסורק micro CT 50. הגדירו את סורק ה-micro CT 50 באופן הבא: השתמשו ב-90 kilovolt pascals, גודל ווקסל של 155 angstroms, מסנן אלומיניום של 5 milliliter, 750 הקרנות ל-180 degrees, וזמן חשיפה של 500 millisecond.לאחר מכן, יש לבצע סריקה של הדגימה. עצמי הבקולום (Baculum) הופרדו, הוכנו ונסרקו באמצעות הפרוטוקול המתואר. ניתן להכניס עצמות רבות לסריקת CT אחת.לאחר מכן, התמונות עובדו באמצעות גאומטריה חישובית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. תהליך דימוי זה אמור להיות ישים למחקר של מגוון רחב של עצמות ונושאים מעניינים אחרים. הניתוח מספק מידע מפורט על נקודות הציון המאפיינות את האובייקט והוא אוטומטי במידה רבה.תהליך זה דרש כ-10 התאמות ידניות בלבד בעת ניתוח של 369 bacula. העניין המרתק הוא שניתן להחיל את השיטות שלנו על מגוון רחב של מבנים מורכבים. שיטות אלו אפשרו לנו לכמת את הגודל והצורה של ה-baculum בשלושה ממדים.

dissection-microct-scanning-and-morphometric-analyses-of-the-baculum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור מודל שבר הקשורות אוסטאופורוזיס בחוליות עירום עכברוש יכול להיות הערכה longitudinally ויוו באמצעות semiautomated microcomputed מבוססי טומוגרפיה כמותיים וניתוח מבני.

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

כתב יד זה מציג שיטות לניתוח morphometric, שינויים סלולריים בתוך בעצם הלסת של מכרסמים.

Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

מיקרוגלייה הם תאים חיסוניים המוח כי סקר ולהגיב המוח שינו פיסיולוגיה באמצעות שינויים מורפולוגיות אשר עשויים להעריך באופן כמותי. זה מתאר פרוטוקול ImageJ מבוסס פרוטוקול ניתוח כדי לייצג מיקרוגלייה מורפולוגיה רציפה לנתונים על פי מדדים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה.

לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

פרוטוקול זה מתאר שיטה קנונית להבנת הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב- vivo. שיטה זו משתמשת במודל עכבר מהונדס וכמה טכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד.

ניתוח פנוטיפ שלד של מודל עכבר מחיקה מותנית Stat3

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

כאן, אנו מתארים לעומק שיטה, המבוססת על טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, לפלח ולמדוד מודלים תלת-ממדיים של עצמות קרניומקסילופציאליות בעכברים, להערכה טובה יותר של התפתחות עצם קרניומקסילופציאלית בעכברים ממה שמתאפשר בשיטות הנוכחיות.

ניתוח מומים קרניומקסילופציאליים בעכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת תלת מימדית

אנו מציעים פרוטוקול להערכת התחדשות עצם ברמות היררכיות שונות. גישה רב-מודלית זו מאפשרת ניתוח מבני בקני מידה שונים לאורך זמן, תוך התמודדות יעילה עם אתגרים בהכנת הדגימה. הוא גם מספק תהליך עבודה אמין להערכת יעילות הביוחומרים בקידום התחדשות העצם.

גישה רב-מודלית להערכת התחדשות עצם וביצועי פיגומים

למד שיטת מורפומטריקה מתקדמת לניתוח Baculum בעכבר באמצעות microCT וסימון נקודות חצי-לנדמרק. גישה זו מאפשרת מדידה מדויקת של עצמות מורכבות ללא נקודות ציון ברורות.

ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum

גלה סרטונים נוספים