בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאים מזנכימליים בלבלב לצורך ניתוח ביטוי הגנים והסמנים שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הלבלב כגון אילו רמזים באים לידי ביטוי על ידי תאים מזנכימליים וכיצד הם משפיעים על התפתחות האפיתל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה ומהירה יחסית, ושהיא מאפשרת תשואה טובה של תאים ממוינים.

התחל בהפקדת האיברים הפנימיים בצלחת תרבית המכילה HBSS והנחת המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. נתק את הכבד והכליות כדי לחשוף את הלבלב באמצעות מלקחיים עדינים כדי להסיר את הלבלב מהקיבה, התריסריון והטחול. כאשר כל לבלב נאסף, העבירו את הרקמה לצינור חרוטי המכיל חיץ עיכול טרי שהוכן והניחו את הצינור על קרח.

לאחר שכל הלבלב נקצר, העבירו את הרקמות לבלוק חימום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה ב-700 סל"ד, והפכו ידנית את הצינורות שלוש עד ארבע פעמים לאחר 15 דקות. אם עדיין קיימות חתיכות גדולות של לבלב לאחר המחצית הראשונה של העיכול, הפוך את הצינור כל חמש דקות במשך 15 הדקות האחרונות ודגר את הרקמה למשך חמש עד 10 דקות נוספות לפי הצורך. בתום העיכול מניחים את הצינורות על קרח ומוסיפים 10 מיליליטר HBSS קר לכל דגימה.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בשני מיליליטר PBS טרי. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננות 35 מיקרון לתוך צינורות איסוף פוליסטירן עגולים תחתונים של חמישה מיליליטר ושטוף את צינורות העיכול עם שני מיליליטר PBS טרי המסנן את השטיפות לתוך צינורות האיסוף המתאימים להם. לאחר מכן צנטריפוגה שוב את התאים ושואפים בזהירות את הסופרנטנטים מבלי להפריע לכדורים.

השעו מחדש את התאים במאגר מיון בהתאם לגיל בעלי החיים וסננו אותם דרך מסננות תאים חדשות של 35 מיקרון לצינורות איסוף חדשים של חמישה מיליליטר. יש לצרף 50 עד 100 נפחי מיקרוליטר של תאים לצינורות FACS חדשים לבקרות הצביעה כולל צינור לכל פלואורופור, צבע הכדאיות, החלבונים הפלואורסצנטיים ובקרה לא מוכתמת. שטפו כל צינור עם עד ארבעה מיליליטר של מאגר מיון ולאחר מכן צנטריפוגה.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים במאגר מיון טרי בהתאם לגיל בעלי החיים. לאחר מכן מכתים את התאים בצבע הכדאיות. למיון תאים לפני מיצוי RNA, מיד לפני תחילת המיון, יש לצפות שפופרת איסוף סטרילית של 1.5 מיליליטר במיליליטר אחד של מאגר מיון המכיל מעכב RNAse.

לאחר חמש דקות, מערבל את צינור האיסוף והסר את הנוזל. מערבולת את בקרת הצביעה הראשונה וטען את הצינור לתוך ציטומטר הזרימה כדי להתחיל לקבוע את פרמטרי המיון. לאחר הגדרת כל פרמטרי המיון, טען את הדגימות ומיין את התאים לצינורות איסוף של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן אוספים את התאים הממוינים על ידי צנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט עד לגלולה וחלצו את ה-RNA בהתאם לפרוטוקולי מיצוי ה-RNA הסטנדרטיים. כאן מוצגים כל מערכת העיכול המבודדת כולל הקיבה, הטחול, המעי והלבלב של עובר עוברי ביום 15.5 וגור ביום רביעי לאחר הלידה.

ניתוח ציטומטרי זרימה של תאים בודדים מרקמות לבלב עובריות, יילודים ובוגרים שבודדו כפי שהודגם זה עתה מגלה כי רקמות לבלב טרנסגניות מכל הגילאים שנותחו מכילות אוכלוסיות תאים מובהקות המסומנות על ידי YFP. לאחר המיון, ניתן לתרבית תאים מזנכימליים אלה כדי ליצור קו תאים לחמישה מעברים לפחות. שימו לב למורפולוגיה הפיברוטית של התאים המתורבתים האופייניים לתאים מזנכימליים.

התאים הממוינים מבטאים את הסמן הפאנמזנכימלי ומנטין, כפי שנותח על ידי qPCR לאחר מיצוי RNA וסינתזת cDNA. יתר על כן, ביטוי סמן פני תא לבלב מבודד מצביע על כך שכל התאים המסומנים פלואורסצנטית בלבלב YFP הטרנסגני מבטאים CD9, גליקופרוטאין על פני התא המתבטא על פי הדיווחים על ידי פיברובלסטים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף RNA כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ביטוי גנים של תאים מזנכימליים.