Name: ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: למד ניתוח כמותי של סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים לתאים מציגי אנטיגן באמצעות ציטומטריית זרימה עם הדמיה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של אינטראקציות תאיות אקס ויוו בדגימות דם לא מטוהרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומן על ידי המועצה למחקר גרמני (DFG) עם מענקים לא. SFB-938-M ו- SA 393/3-4.

1. הכנת פאן-לויקוציטים
<ol><li>צייר 1 מ"ל של דם היקפיים תורם בריא (או החולה) במזרק heparinized. הקפד לקבל אישור על-ידי ועדת האתיקה אחראי על תרומת דם.</li>
	<li>לערבב 1 מ"ל של ציוד היקפי האנושי דם עם 30 מ של מאגר פירוק ACK (150 מ מ NH4קלרנית, 1 מ מ KHCO3ו- 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.0) בשפופרת 50 מ ל, תקופת דגירה של 8 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למלא את הצינורות עם PBS, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 6 דקות לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב30 מ"ל ACK פירוק המאגר.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3 עד תגובת שיקוע ברור. לבסוף, רוחצים את התאים ב- PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר, את resuspend בגדר תא ב- 2 מ של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.</li>
</ol>2. טעינת ראג'י תאים עם סאב
<ol><li>להכין שני צינורות בז 15 מ"ל עם 1.5 x 106 תאים ראג'י למחזור. ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend התאים שיורית בינוני (בערך 50 – 100 µL), להוסיף µL 1.9 (1.9 µG) סאב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוסף 5 מ של תרבות בינוני, ספין למטה התאים (300 x g למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) ואת resuspend בגדר תרבות בינוני (RPMI 1640 + 10% FCS)-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....</li>
</ol>3. אינדוקציה של המערכת החיסונית הסינפסות, צביעת פרוטוקול
<ol><li>פיפטה µL 500 של הכנת ראג'י טעון-SEB תאים לתוך צינור FACS, 500 µL ההכנה של תאים ראג'י לפרוק לתוך צינור FACS אחר. להוסיף µL 650 פאן-וחריגה של כל צינור ו ספין למטה התאים (300 גר' x 10 דקות בטמפרטורת החדר). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 150 µL של תרבות בינוני (RPMI1640 + 10% FCS). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (בדרך כלל למשך 45 דקות).</li>
	<li>בעדינות מערבולת התאים (10 s ב 1,000 סל"ד) ו להוסיף 1.5 מ של paraformaldehyde (1.5%) במהלך המערבולת כדי לתקן את התאים. לעצור את הקיבעון על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA. גלולה התאים (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר, resuspension בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS + 1% BSA לאחר המקננת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
	<li>גלולה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend תאי µL 100 של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize את התאים (96-ובכן לוח, בצורת U).</li>
	<li>לשטוף את התאים PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין עם צנטריפוגה (300 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר), resuspend בגדר תא ב- 50 µL של PBS + 1% BSA + 0.1% סאפונין המכיל נוגדנים מתויג fluorophore או תרכובות (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), ודאפי (1:3, 000)).</li>
	<li>דגירה התאים בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות לשטוף את התאים 3 פעמים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA + סאפונין 0.1%. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות בטמפרטורת החדר. Re-resuspend תאי µL 60 ל- PBS עבור הדמיה cytometry זרימה.</li>
</ol>4. התמונה רכישה באמצעות Cytometer של זרימה
הערה: הבאים התמונה רכישה בהליך ניתוח ממצאים מבוססים על הדמיה cytometry זרימה באמצעות תוכנה כגון imagestream (IS100), אינספייר ורעיונות. עם זאת, cytometers זרימה אחרים תוכנת ניתוח יכול לשמש גם.
<ol><li>פתח ניתוח תוכנה על המחשב מחובר cytometer זרימה, לחץ על אתחל פלואידיקה של התפריט מכשיר הדמיה. להחיל את החרוזים ביציאה הנכונה כאשר תתבקש לעשות זאת.</li>
	<li>לטעון את התבנית שתוגדר כברירת מחדל מתוך תפריט קובץ ולחץ על הפעל/התקנה. לבחור חרוזים מתוך התפריט הנפתח ' תצוגה '.</li>
	<li>התאם את אלומת האור הבהיר-שדה על-ידי לחיצה על הגדר עוצמת אם הערך שצוין הוא מתחת ל-200.</li>
	<li>הפעל את הכיול של שיגרת הבדיקה בכרטיסיה סיוע על-ידי לחיצה על התחל כל.</li>
	<li>לחץ על סומק/נעל/לטעון ולהחיל את הדגימות בנמל השמאלי כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר טעינת התאים cytometer זרימה, לפתוח את המסווג תא ולהתאים את הערכים כדלקמן: שיא עוצמת הגבול העליון-1,022 עבור כל ערוץ, שיא עוצמת הגבול התחתון 50 בערוץ 2 (דאפי) וכל ערוץ 5 (CD3-Pe-TxR), אזור הגבול התחתון-50 ערוץ 1 (לצד פיזור) והגבול העליון ב- 1,500.</li>
	<li>לשנות את עוצמת הלייזר עירור 405 ננומטר (15 מגוואט), 488 ננומטר (200 mW), ו 647 nm (90 mW) בכרטיסיה התקנה.</li>
	<li>לעבור את התפריט הנפתח בתצוגת בין תאים, חרוזים כדי להעריך את ההתאמות כוח תא המסווג ולייזר. הערה: ודא כי כל התאים וזוגות תא נמצאו התצוגה תא כי תא גושים, פסולת, תמונות עם פיקסלים רווי נמצאים בתצוגה פסולת על-ידי שינוי המסווגים את התא ו/או כוחות לייזר עירור.</li>
	<li>להגדיר השם לדוגמה ואת כמות תמונות לרכוש (15,000 – 25,000 לדוגמאות) ו-500 עבור פקדים פיצוי הכרטיסיה התקנה לחץ על התקנה/הפעלה כדי להפעיל את הרכישה.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>העברת קבצים תמונת raw (.rif) אל המחשב ניתוח נתונים ופתחו את תוכנת ניתוח.</li>
	<li>לייצר מטריצה פיצוי ועקוב אחר ההוראות של מהרשימה הנפתחת פיצוי. שמירת המטריקס פיצויים comp_Date.ctm.</li>
	<li>פתח את קובץ תמונת raw לדוגמה (.rif) ולהחיל את comp_Date.ctm בחלון שמופיע לייצר את קובצי התמונה מדובבים (.cif), קובץ ניתוח הנתונים המוגדר כברירת מחדל (.daf).</li>
	<li>פתח את קובץ התמונה מדובבים. המרת התמונות למצב צבע ולהתאים את טבלאות בדיקת מידע כדי לקבל צבעים אופטימלית גלוי בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. להשיג את התמונה התמזגו RGB באמצעות הכרטיסיה הפרדות של הכלים מאפייני גלריית תמונות.</li>
	<li>
פתח את מנהל מסכת מהרשימה הנפתחת ניתוח. ליצור מסכות להגדיר תאי T של הסינפסה המערכת החיסונית, כדלקמן:
	<ol>
<li>בחר את המסכה T-cell: "((Threshold_Ch05, 60) מילוי." בחר את המסכה העמק: "Valley(Ch02,3)." בחר את המסכה סינפסה T-cell: "T-cell המסכה של עמק (M02, Ch02, 3)."</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פתח את מנהל תכונה מהרשימה הנפתחת ניתוח. לחשב את התכונות הבאות:
	<ol>
<li>עבור הביטוי CD3 סה ב- T תאים, בחר "Intensity_T-cells_Ch5." עבור הסכום הכולל של F-אקטין בתאי T, בחר "Intensity_T-cells_Ch6." להבעה CD3 הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch5." עבור כמות F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית, בחר "Intensity_T-תא synapse_Ch6."</li>
		<li>כדי לחשב את השטח T-cell, בחר "Area_T-התאים." כדי לחשב את השטח סינפסה המערכת החיסונית T-cell, בחר "Area_T-תא סינפסה."</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את F-אקטין והעשרה CD3 ב הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות המשוואה במנהל תכונה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg">
</li>
	<li>
להחיל את האסטרטגיה הבאה חסימה באמצעות היסטוגרמות ומתכנן נקודה מאזור הניתוח (עבור עוד פרטים, ראה הפניות 17, 19):
	<ol>
<li>למחוק את התאים out-of-להתמקד על ידי התוויית "RMS_M2_Ch2 מעבר" בהיסטוגרמה; הגדר את הסף בגיל 15.</li>
		<li>מגרש בבית המשפט לביטחון המדינה נגד CD3 בעוצמה בחלקה נקודה. להגדיר שער על אירועים CD3-חיוביות.</li>
		<li>העלילה על "יחס" של M02 (דאפי כתם) לעומת האזור של M02 (דאפי כתם). שער ב- T-cell ללבישה ותא זוגות בהתאם. תקן לזוגות תא נכון תוך שימוש בשטח המסכה סינפסה, כפי שתואר לעיל17,19.</li>
		<li>לקבוע את כמות F-אקטין ב- T-cell ללבישה ותאי T של T-תא/APC זוגות, האחוזים של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
<li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin%3A+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li>
<li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+and+Traction%3A+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68(2016).</li>
<li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+engine+in+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Netw%22%5BJournal%5D)">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li>
<li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li>
<li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li>
<li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiskott-Aldrich+Syndrome%3A+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר כימות של המערכת החיסונית הסינפסות. בין תאי T אנושיים (ex-vivo) נגמ שים. ראוי לציין, פן כדוריות דם אדומות-lysed-לויקוציטים שימשו כמקורות T-cell, ביצוע פעולות טיהור T-cell לוותר. הקו תא B-cell לימפומה ראג'י שימש הפונדקאית נגמ שים. זה נושא יתרונות משמעותיים, שכן הוא מאפשר השוואות בין תורמים דם של הצד T-cell של הסינפסה המערכת החיסונית. יתר על כן, עצמיים DCs זמינים בקושי ישירות מן הפריפריה דם אנושי. הייצור של תאים דנדריטים נגזר מונוציט (moDCs) אורכת מספר ימים, שהופך את היישום מחקרים קליניים מאתגר...

תאי T הרגולטורים העיקריים של מערכת החיסון מסתגלת, מופעלים באמצעות פפטידים antigenic המוצגים בהקשר של מתחמי histocompatibility הגדולות (MHC). הפעלה מלאה של תא T דורש שני אותות, האות כשירות באמצעות הקולטן תא T אנטיגן ספציפי (TCR) / CD3 מתחם, האות costimulatory באמצעות קולטנים אביזר. שני אותות שנוצרו באמצעות האינטראקציה הישירה של תאי T עם אנטיגן תאים (נגמ שים). נגמ שים בוגרים מספקים את האות מיומנות להפעלת T-cell דרך MHC-פפטיד מתחמי, הם מבטאים ליגנדים costimulatory (למשל, CD80 או CD86) כדי להבטיח את ההתקדמות של T-cell הפעלה1. פונקציה חשובה אחת של costimulation היא התארגנות מחודשת של3,42,שלד התא אקטין. בקליפת המוח F-אקטין היא סטטית יחסית ב נח בתאי T. תא T גירוי דרך מניבי אנטיגן נגמ שים מוביל שחלוף עמוקה של שלד התא אקטין. אקטין דינמיקה (קרי, אקטין מהר פלמור/depolymerization מעגלים) מאפשרים תאי T ליצור כוחות אשר משמשים להעברת חלבונים או organelles, למשל. יתר על כן, שלד התא אקטין חשוב לפיתוח אזור קשר מיוחד בין תאי T נגמ שים, שנקרא הסינפסה המערכת החיסונית. בשל חשיבות שלד התא אקטין את הסינפסה המערכת החיסונית, זה הפך חיוני לפתח שיטות כדי לכמת שלד התא אקטין של T תאים5,6,7,8 שינויים , 9.
על-ידי סיוע cytoskeletal אקטין, קולטנים משטח וחלבונים איתות מובדלים באשכולות הפעלה סופרא מולקולרית (SMACs) בתוך הסינפסה המערכת החיסונית. היציבות של הסינפסה המערכת החיסונית מובטחת על ידי קשירה של קולטני חבילות F-אקטין המגבירים את האלסטיות של שלד התא אקטין. היווצרות סינפסה החיסון הוכח להיות קריטית עבור הדור של ההיענויות החיסון מסתגלת. השפעות מזיקות של צורה פגומה סינפסה המערכת החיסונית ויוו התממשו קודם בחולים הסובלים מ תסמונת אולדריץ ויסקוט (WAS), מחלה אשר פלמור אקטין, / ת, נגרמת הפרעה היווצרות מערכת החיסון סינפסה10 . היה מטופלים עלולים לסבול אקזמה, דלקות חוזרות ונשנות חמורים, מחלות אוטואימוניות, מלנומה. למרות ממצא זה, כרגע לא ידוע אם המערכת החיסונית סינפסה היווצרות שונה בתאי T אנשים בריאים וחולים הסובלים החיסון מולדים או מחלות אוטואימוניות.
מיקרוסקופ פלורסצנטיות, כולל וידאו, TIRF, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ, שימשו לגלות את הארכיטקטורה המערכת החיסונית סינפסה11,12,13,14. הרזולוציה הגבוהה של מערכות אלה ועל האפשרות של ביצוע הדמיה לחיות תאים מאפשרת איסוף מידע מדויק, -עתיים על שלד התא של אקטין, פני שטח או תאיים חלבונים ב הסינפסה המערכת החיסונית. עם זאת, תוצאות רבות, מבוססות על ניתוח רק כמה עשרות תאי T. יתר על כן, תאי T חייבים להיטהר עבור סוגים אלה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עבור שאלות מחקר רבות, השימוש של תאים ולזרימה ולא את הרזולוציה הגבוהה ביותר-האפשר זאת, חשיבות עליונה. זה רלוונטי אם T תאים מחולים מנותחים, שכן כמות הדם שנתרמו מוגבל, ייתכן שיש צורך לעבד דוגמאות רבות במקביל.
הקמנו שיטות מיקרוסקופיים לאפשר הניתוח של שלד התא אקטין ב הסינפסה מחוסן16,15,המערכת האנושית17. שיטות אלה מבוססות על הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ18. כמו הכלאה בין זרימה מולטי ספקטריאליות cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הדמיה cytometry זרימה יש הייתרונות בניתוח מורפולוגי פרמטרים ולוקליזציה חלבון באוכלוסיות הטרוגניות התא, כגון פאן-לויקוציטים מ דם היקפיים. הצגנו מתודולוגיה המאפשרת לנו לכמת F-אקטין ב- T-תא/APC conjugates של תאים אנושיים T מדגימות דם מלא, ללא צורך זמן רב ויקרות טיהור צעדים17. הטכניקה המובאת כאן כוללת כל זרימת העבודה, מלקבל את דגימת הדם על כימות של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>בז</td><td>#352054</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>מלח פוספט חוצץ של Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>רוט</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS לשטוף Saponin</td><td></td><td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>מהירות חרוז</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>מינישייקר MS1</td><td>IKA Works</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>Enterotoxin SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Phalloidin-AF647</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>ציטומטר זרימת הדמיה</td></tr><tr><td>רעיונות</td><td>Amnis</td><td></td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה cytometry זרימה

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

הסינפסה החיסון הוא האזור של תקשורת בין תאי T, תאים אנטיגן (נגמ שים). תאי T polarize רצפטורים משטח וחלבונים לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית כדי להבטיח איגוד יציב אות exchange. מיקרוסקופ קונפוקלי, TIRF או רזולוציה סופר קלאסי שימשו ללמוד הסינפסה המערכת החיסונית. מאז שיטות אלו דורשות ייבוא תמונות ידנית, כימות גוזלת זמן, ההדמיה של מאורעות נדירים הוא מאתגר. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח מורפולוגי של עשרות אלפי תאים. הסינפסות המערכת החיסונית הם המושרה בין ראשי בתאי T אנושיים בהכנות פאן-ליקוציט Staphylococcus aureus enterotoxin ראג'י טעון-B SEB תאים כמו נגמ שים. ייבוא תמונות מתבצע באמצעות הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ, המשלבת תכונות של cytometer זרימה של מיקרוסקופ זריחה. אסטרטגיה חסימה מלאה לזוגות תא T/APC ואבחון הסינפסות החיסון הינו מסופק. כאשר זרימת עבודה זו מאפשרת הניתוח של החיסון synapses בהכנות ולזרימה פאן-ליקוציט ודורש ומכאן רק נפח קטן של דם (קרי, 1 מ"ל), ניתן להחיל אותה על דגימות מחולים. חשוב לציין, מספר דגימות מוכן, ולהשוואה ניתח במקביל.

יעד מרכזי של השיטה המתוארת כאן היא כימות של העשרה חלבונית (למשל, F-אקטין) ב הסינפסה המערכת החיסונית בין אם פונדקאית נגמ שים (ראג'י תאים) ותאי T ב ולזרימה פאן-לויקוציטים נלקחו דגימות דם אדם בנפח נמוך (1 מ"ל). צילום מסך באיור 1 נותן סקירה של האסטרטגיה המגביל קריטי של שיטה זו. זה מראה את גלריית תמונות בצד השמאל ואת האזור ניתוח מימין (איור 1). גלריית תמונות מראה את השער "במבט חדש". התמונות מתוארים הן בעיקר גרנולוציטים ו T-תא/APC שני זוגות. F-אקטין, C...

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגי האנושי, כגון כיצד תקשורת בין לויוציטים מתרחשת ברמה המולקולרית והתאירית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי תאי T אנושיים unpurified ניתן לנתח ex vivo בתקופה קצרה יחסית. הוכחת הליך זה תהיה הנינג קירשגסנר, טכנאי מהמעבדה שלנו.התחל על ידי ערבוב מיליליטר אחד של דם היקפי אנושי שנמשך טרי עם 30 מיליליטר של חיץ תזה ACK בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ממלאים את הצינור ב- PBS לשטיפת צנטריפוגה ומבזבזים את גלולה בשני מיליליטר של מדיום תרבות עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף חמש פעמים 10 כדי Staphylococcus aureus enterotoxin B או SEB טעון או נפרק תאים ראג'י ב 500 microliters של תרבות בינוני לתוך צינורות FACS בודדים, ואחריו 650 microliters של פאן-לויקוציטים.לסובב את התרבויות שיתוף, ו resuspend כדורי ב 150 microliters של מדיום תרבות טרי עבור דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מערבולת עדין את התאים במשך 10 שניות ב 100 סל"ד תוך הוספת 1.5 מיליליטר של 1.5% paraformaldehyde. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, להפסיק את קיבעון עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 1%BSA ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.תוסיפו את הכדורים ל-100 מיקרוליטרים של PBS פלוס BSA ו-0.1% סאפונין, ותוסיפו את דגימות התא לשתי בארות בודדות של צלחת U-bottom עם 96 בארות. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הצלחת מחדש את כדורי ב 50 microliters של PBS בתוספת BSA ו סאפונין המכיל את נוגדנים פלואורופור הוסיף או תרכובות עניין עבור דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים ב 150 microliters של PBS בתוספת BSA וסאפונין ולתלות את כדורי ב 60 microliters של PBS.כדי לדמיין את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את תוכנת הניתוח, בדוק את הרמה הנוזלית ולחץ על הפעלה בתפריט מכשיר. לאחר מכן, לחץ על טען וטען את הדגימות ליציאה כשתתבקש לעשות זאת. תחת הכרטיסיה תאורה, שנה את כוח הלייזר של העירור לאורכים המתאימים של הננומטר.לאחר מכן, התאימו את השערים לערוצים 4 ו-11 והתאיימו את האזור לערוץ הראשון. כדי להעריך את התאמות הכוח של gating ולייזר, העבר את תפריט תצוגה לשער המתאים והתאם את השערים וכוחות הלייזר עד שהתאים וזוגות התאים יהיו גלויים. לאחר מכן, בכרטיסיה רכישת קבצים, הגדר את השם לדוגמה ואת מספר התמונות שיש לרכוש ואת השער המתאים עבור כתמי CD3 ולחץ על רכוש כדי להתחיל ברכישה.כדי לנתח את תמונות התאים שנרכשו, פתח את תוכנת הניתוח המתאימה. בהתאם להוראות ברשימה הנפתחת פיצוי, לייצר מטריצת פיצוי ולשמור את המטריצה כמו ctm תאריך comp. לאחר מכן, פתחו קובץ תמונה גולמי לדוגמה והחלו את ctm תאריך ה-comp בחלון כדי ליצור את התמונה המפוצה ואת קבצי ניתוח הנתונים המוגדרים כברירת מחדל.לאחר פתיחת קובצי התמונה המפוצים, המירו את התמונות למצב צבע. התאם את טבלאות בדיקת המידע כדי לקבל צבעים גלויים מיטביים בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. פתחו את מנהל המסכות בתפריט 'ניתוח' והגדירו את תאי T על-ידי בחירת מסיכת סף של 60% לערוץ 5 ומילוי המסיכה ליצירת מסיכת תא T.לאחר מכן, בחרו 'מסיכת עמק' לערוץ 2 ברוחב של שלושה פיקסלים ליצירת מסכת העמק, ושלבו את מסכות התא T והעמק ליצירת מסיכת הסינפסה של תאי T. כדי לחשב את הביטוי הכולל של CD3 בתאי T, פתח את מנהל התכונות וצור את התכונה עוצמה, תא T, ערוץ חמש. כדי לחשב את הכמות הכוללת של F-actin בתאי T, צור את התכונה עוצמה, תאי T, ערוץ שש.כדי להעריך את כמות ה- CD3 בסינאפסות חיסוניות, צור את התכונה עוצמה, סינפסה של תאי T, ערוץ חמש. כדי לקבוע את כמות F-actin בסינאפזה החיסונית, ליצור את התכונה עוצמה, סינפסה תא T, ערוץ שש. לבסוף, כדי להגדיר את העשרת F-actin ו- CD3, לחשב את היחסים של F-actin או CD3 בסינאפזה החיסונית ואת הביטוי הכולל של החלבון שנבחר, בהתאמה.בגרפים אלה, סקירה של אסטרטגיית gating קריטי לכמת את העשרת החלבון בסינאפסה החיסונית בין תאים מציגי אנטיגן פונדקאית, או APCs, ותאי T ב pan-leukocytes unpurified נלקח מדגם דם אנושי בנפח נמוך מוצג. כאן מוצגות תמונות מייצגות של T-cell-APC עם רמות נמוכות של CD3 ו- F-actin בתוך הסינפסות החיסונית שלהם בהיעדר SEB, ואילו אלה T-cell-APC conjugates להפגין העשרה חזקה CD3 ו- F-actin בנוכחות SEB. בהיעדר סופראנטיג'ן, 15% מתאים T הציגו העשרה של CD3 ו- F-actin בסינאפזה החיסונית, ואילו העשרה של 29% נצפתה בנוכחות סופראנטיג'ן.ואכן, בהיעדר סופראנטיג'ן, פחות מ-20% מכלל ה-F-actin בתאים מצטבר בסינפסה החיסונית, עם יותר מ-30% שנצפו בסינאפסה בנוכחות סופרנטיגן. יש לציין, CD3 מצטבר על הסינפסה החיסונית גם בהיעדר סופראנטיגן, אם כי הצטברות זו גדלה באופן משמעותי גם על ידי תוספת של סופראנטיג'ן, המדגים את הכושר של שיטה זו לכמת הצטברות חלבון בסינתפסה החיסונית T-cell-APC. לאחר השליטה, טכניקה זו ניתן להשלים בשש עד שבע שעות אם מבוצע כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול את כל הפקדים הרלוונטיים, כולל דגימות ללא סופראנטיג'ן, גם אם נעשה שימוש ב- APCs ללא SEB. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על המבנה עדין של הסינפסה החיסונית. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התקשורת התאית לחקור את הסינפסה החיסונית בבני אדם למחקר בסיסי, ניסויים קליניים ומדעי התרגום.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לנתח את אזור החיבור T-cell-APC ואת הסינפסה החיסונית בתאי T אנושיים ex vivo. אל תשכח כי עבודה עם חומרים אנושיים ראשוניים יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות או עבודה תחת רמה biosafety שני תנאים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

qualitative-quantitative-analysis-immune-synapse-human-system-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream...

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

סרטון זה מנתח את היווצרות הסינפסה החיסונית בין תאי T בתכשירי פאן-לויקוציטים לא מטוהרים לבין Staphylococcus aureus enterotoxin B, תאי ראג'י טעוני SEB. העשרת CD3 ו- F-actin נצפית בסינפסה החיסונית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

ניתוח סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ותאי ראג'י טעונים SEB באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

מקור: Hidmark, A. S.,  et al. ניתוח של תאים חיסוניים בעצבים סיאטיים בודדים ובגנגליון שורש הגב מעכבר בודד באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. exp.{{TAG_ 27}} (2017).  }סרטון זה מדגים את השימוש בזרימה ציטומטרית לניתוח תאי חיסון בעצבים סיאטיים של עכברים ובגרעיני שורש גב (DRGs). התהליך כולל תיוג תאים חיסוניים עם נוגדנים מתויגים פלואורופור וביוטין, ייצוב וחדירה של התאים, ושימוש בסמנים פלואורסצנטיים כדי לזהות מאפיינים של פני התא והגרעין. הטכניקה מאפשרת הערכה כמותית של הטרוגניות של תאי מערכת החיסון...

ניתוח תאים חיסוניים ברקמות עצבים של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

למד ניתוח כמותי של סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים לתאים מציגי אנטיגן באמצעות ציטומטריית זרימה עם הדמיה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של אינטראקציות תאיות אקס ויוו בדגימות דם לא מטוהרות.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים