השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים כיצד שימוש בהתנייה קלאסית של מצמוץ עין עם השהיה (trace eyeblink classical conditioning), צורה של למידה אסוציאטיבית, יכול לסייע בזיהוי תפקוד לקוי של ההיפוקמפוס במודל של חולדות להפרעות הספקטרום של אלכוהול עוברי. גורי חולדה בניו-נטליים נחשפים למינון גבוה של אלכוהול, בריכוז של 11.9% volume volume אלכוהול, באופן המדמה שתייה מופרזת (binge), במהלך התקופה המקבילה לטרמיסטר השלישי בבני אדם ביחס לצמיחת המוח.

דפוס זה של חשיפה לאלכוהול והמינון הם גורמי מפתח ביצירת ליקויים מוחיים לאורך מעגל החיים, המדמים מקרים אנושיים של FASD's. אזור מוחי חשוב שנפגע כתוצאה מחשיפה מוקדמת לאלכוהול הוא ההיפוקמפוס. לאחר שהחולדות גדלו לבגרות, הן נבדקות לאיתור תפקוד לקוי של ההיפוקמפוס באמצעות התנייה קלאסית של ממצמץ-עין (trace eyeblink classical conditioning).

זוהי צורה של למידה אסוציאטיבית מסדר גבוה המסתמכת על תקינות ההיפוקמפוס. במהלך הימים הפוסט-נטאליים הרביעי עד התשיעי, גורי חולדה נשקלים מדי בוקר ומשקלם נרשם. נפחי ההאכלה נקבעים לאחר מכן באמצעות טבלה מודפסת מראש המבוססת על משקל הגוף.

תמיסת אלכוהול בריכוז של 11.9% נפח/נפח ניתנת לגורי חולדה לאורך שתי האכלות המופרדות בשעתיים. המינון היומי הכולל של אלכוהול הוא 5.25 גרם לקילוגרם ליום. פרדיגמת חשיפת ה-binge זו מספקת 0278 מיליליטר אלכוהול לגרם משקל גוף בכל האכלה בתמיסת חלב.

שאבו את החלב המכיל אלכוהול באמצעות מזרק סטרילי של 1 mL. לאחר מכן, דחפו החוצה תמיסה עודפת כדי להשיג את הכמות המדויקת הדרושה. טבלו את קצה צינור ה-PE-10 בשמן תירס טרי.

פעולה זו מקלה על ההחדרה. מדדו את אורך צינור ה-PE-10 מהפה של הגור ועד לבטנו. במידת הצורך, כווננו את סטופר ה-PE-50 שישמש כמדריך ויזואלי לנקודת העצירה.

הכנס בעדינות את צינור ה-PE-10 לתוך פיו של הגור. בדרך כלל תרגישו התנגדות מסוימת כאשר הקצה פוגש את הגרון. תמרנו את הצינור עד שהקצה מתכופף אל תוך פתח הוושט.

נסו למנוע מהשפופרת להחליק לאחור, שכן היא עלולה להיות חלקה בשל השמן. המשיכו במעלה הוושט, וכאשר הקצה יעבור את הספינקטר הגסטרו-אזופגיאלי, הוא ייכנס לקיבתו. עצרו בנקודה זו, ייצבו את המשאבה, והזרימו את התמיסה.

יש לבצע זאת בקצב איטי. הסר בזהירות את צינורית ה-PE-10 ובדוק אם ישנו זרימה חוזרת של תמיסה, דם, או פגיעה פיזית בגור. אם הגור במצב תקין, החזר אותו לשאר השגירה.

יש לעיין בפרוטוקול הכתוב וברשימת החומרים כדי לזהות את המכשירים הספציפיים המשמשים בהליך הניתוח של העפעף. יש לעקר את שטח הניתוח באמצעות חומר חיטוי מאושר ולהעביר את כל כלי הניתוח והציוד באוטוקלאב מראש. לאחר השראת הרדמה נאותה של החולדה באמצעות isoflurane, יש לגלח את ראשה באמצעות מכונת גילוח, כך שייחשף שטח עור מספיק עבור אתר החתך והעפעף השמאלי.

יש לעקר את עורו על ידי ביצוע שלושה שלבי קרצוף לסירוגין הכוללים 70% isopropyl alcohol ו-povidone iodine. יש לפעול לפי הנוהל הסטנדרטי לקיבוע החולדה למכשיר הסטריאוטקסי באמצעות מוטות האוזניים. יש להמשיך בניתוח כאשר החולדה מראה מישור הרדמה תקין.

השתמש בלהב הסקלפל כדי לבצע חתך קדמי-אחורי בקו האמצע. חתך זה צריך לחשוף שטח מספיק קדמית לעיניים ומעט אחורית לקו התפר של ה-lambda. השתמש בלהב הסקלפל כדי לגרד בעדינות את הפריאוסטאום (periosteum) שעל גבי הגולגולת, בזהירות כדי לא לגרום לדימום מוגבר.

נגב רקמת חיבור ודם עודפים באמצעות מקלון צמר ושטוף את האזור במי מלח סטריליים בין גירוד לגירוד. קדח חור המתחיל ישירות מאחורי התפר הקורונלי באחת מעצמות הפריאטליות. הסר דם ושאריות עצם באמצעות מקלון צמר.

השתמשו בפינצטת רסיסים (splinter forceps) כדי לתפוס בורג 0 80. השתמשו במברג שעונים כדי להדק את הבורג לחור; הדקו את הבורג במידה מספקת מבלי לפגוע ברקע הקורטקס של המוח, בדרך כלל שלושה עד ארבעה סיבובים מלאים. חזרו על אותו הליך כדי לקבע את שאר הברגים.

שני ברגים צריכים להיות מקובעים באופן דו-צדדי מאחורי התפר הקורונלי (coronal suture) וברג אחד בעצם הפריאטלית הימנית, קדמה לתפר הלמדבדה (lambda suture). אחזו בעור העליון באתר החתך של העין השמאלית בעזרת פינצטת חבישה בגודל 4 אינץ' וכוונו את פינצטת החבישה בגודל 3 אינץ' לעבר פינת העין זו. קחו מחט אחת בכיול 26 gauge ואורך 3/8 אינץ' והחדירו אותה דרך פינת העפעף.

סובב את המחט כך שהצד המשופע פונה כלפי מעלה. הכנס את המחט השנייה למרכז העפעף. השתמש בפינצטה עדינה כדי לתפוס חוט 3T והכנס אותו לאחת המחטים.

אין צורך להחדיר אותו עד הסוף. בצע את אותו התהליך עבור חוט ה-3T השני. אחז את שני המחטים ביד אחת ובמקביל אחז בראש הבמה (head stage) ביד השנייה.

בתנועה אחת רציפה, משכו את המחטים הרחק מעפעף העין תוך הנחיית שלב הראש (head stage) באותו הכיוון. בזמן החזקת שלב הראש של ה-EMG ביד אחת, השתמשו בפינצטת חבישה באורך שלושה אינץ' ביד השנייה כדי ללפף את חוט ה-10T סביב אחד או שני הברגים בצד ימין. דחפו את החוט פנימה כך שלא יבלוט מהברגים.

יש למרכז את ראש המגבר של ה-EMG לפני המעבר לשלב הבא. השתמשו בפינצטת ביגוד של ארבעה אינץ' כדי ליצור כיס קטן על ידי הפרדת העור, כלומר הפסציה השטחית, משריר הרקה (temporalis muscle). לאחר יצירת הכיס, השתמשו במספרי איריס כדי לגזור רקמת חיבור נוספת, תוך התקדמות לכיוון הזווית של העין השמאלית.

היזהרו שלא להחדיר עמוק מדי או לחתוך כלי דם. קחו אלקטרודה ביפולרית ועצבו את מוליך התיל כך שניתן יהיה להתאימו לקימור של שריר הטמפורליס (temporalis muscle). שני הפינים ימוקמו אחוריים לעין השמאלית, והקצה התחתון של האלקטרודה הביפולרית ימוקם ישירות מעל הגולגולת.

ערבבו את אבקת ה-Ortho Jet עם הרכיבים הנוזליים עד לקבלת מרקם נוזלי. מרחו את המשחה בעזרת מיקרו-שפכטול מסביב לאתר החיתוך. הקפידו שלא להפיל משחה על עיני החולדה, ושמרו אותה במקום הייעודי.

המתינו עד שה-Ortho Jet יגיע למצב חצי-יבש, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה דקה (splinter forceps) כדי להסיר עודפי אקריליק מראש הבמה של ה-EMG ומההברגות של האלקטרודה הביפולרית. גזרו את עודפי חוט ה-3T, והשאירו מספר סנטימטרים לצורך העבודה.

הסר בזהירות את בידוד ה-PTFE מכל חוט 3T באמצעות פינצטת מיקרו-דיסקציה. פעולה זו מאפשרת להם ליצור מגע עם שריר ה-orbicularis oculi. השתמש בפינצטת המיקרו-דיסקציה כדי ליצור ווים בכל אחד מקצות חוטים ה-3T.

גזרו את עודפי התיל, תוך הקפדה לא לגזור כמות רבה מדי שגורמת לתיל שנותר לסגת חזרה אל תוך העפעף. הכבלים מיוצרים במעבדה. התקע הביפולרי הלבן מחובר ראשון, וזה מאפשר את מתן גירוי ה-US של השוק.

לאחר מכן מחברים את תקע שלב הראש הכתום של ה-EMG. הוא מקליט פעילות אלקטרומיוגרפית בזמן שהחולדה ממצמצת. שני התקעים מובילים למחליף (commutator) עגול בראש הזרוע, השומר על רציפות האות בעוד החולדה נעה בחופשיות.

מבודד הגירוי מופעל ומתבצעות בדיקות חומרה סופיות. אלו כוללות התאמה של קו הבסיס של ה-EMG לרמה שניתן לראות על מסך המחשב. במפגש הראשון, עוצמת השוק נקבעת תחילה ל-4 milli amps ותוגבר ביחידות של 4 mil amp מדי שני ניסיונות.

הליך ההדרגה זה מאפשר לחולדה להתרגל לגירוי השוק. עד הניסוי השמיני, עוצמת השוק נשמרת על 1.6 milli amps לאורך מפגש זה וכל המפגשים הבאים. מחשב נפרד מפעיל אוסצילוסקוף דיגיטלי בעל ארבעה ערוצים המאפשר לנו לבצע אבחון אותות בזמן אמת.

שימו לב למצמוץ שהפיק החולדה בתיבה הראשונה. האוסצילוסקופ מצביע גם על כך שאות ה-EMG הבסיסי נקי יחסית עם רעש נמוך. מצלמות רשת מאפשרות לנו לנטר כל חולדה בנוסף.

זהו צילום מסך מתוכנת blink גרסה 4.0 המציג תקופת ניסוי (epoch) שנמשכת 1400 מילישניות. ב-280 המילישניות הראשונות, לא מוצגים גירויים כדי לקבל מדד של פעילות EMG בבסיס (baseline). הקו הצהוב מציין את קו הסף, שבו כל תגובת EMG העולה על 4 וולט מעל ערך הבסיס הממוצע לפני ה-CS תיחשב כתגובת מצמוץ.

גירוי תנאי הצליל בעוצמה של 85 decibels ניתן בנקודת הזמן של 280 millisecond. הצליל נשאר פעיל למשך 380 milliseconds, מה שמתאים לנקודת הזמן של 660 millisecond. לאחר כיבוי הצליל, קיים מרווח של 500 millisecond שבו לא מוצגים גירויים; תקופה זו נקראת תקופת העקבה (trace period), שבה החולדה חייבת לקשר בין סיום גירוי הצליל (CS) לבין תחילת גירוי השוק (US), אשר יינתן בנקודת הזמן של 1160 millisecond.

הגירוי הבלתי מותנה (US) של השוק נמשך 100 מילישניות. באופן טבעי, השוק (US) מעורר תגובת מצמוץ הגנתית המכונה התגובה הבלתי מותנה, או UR, הנמדדת בחלון זמן של 140 מילישניות. מפגש אימון אחד מורכב מ-100 ניסיונות.

קיימים 90 ניסויים שבהם ה-CS וה-US מוצמדים, ובכל ניסוי עשירי, רק ה-CS מוגש. ישנם 10 ניסויי CS בלבד בכל סשן. ניסויים אלו מאפשרים לנו לבחון האם התרחשה למידה של ההקשר בין ה-CS ל-US.

תגובות התניה, או CR's, באות לידי ביטוי כאשר ה-US של השוק אינו נוכח. מרווח הזמן בין הניסיונות (inter trial interval) הוא בממוצע 30 שניות, כך שתחילתו של כל ניסוי אינה ניתנת לחיזוי. בכל ניסוי נתון, חולדה עשויה למצמץ בכל נקודת זמן, וה-EMG שלה יוקלט על ידי התוכנה.

כל מצמוץ עיניים בודד שיחרוג מקו הסף ייחשב כתגובה באחת מארבע קטגוריות, בהתבסס על מועד התרחשותו ועל תקופת הניסוי. אם החולדה ממצמצת במהלך 80 המילישניות הראשונות לאחר תחילת ה-CS של הצליל, התגובה תיחשב כתגובת בהלה או SR. זוהי תגובה לא-אסוציאטיבית המעידה על ביצועים סנסורי-מוטוריים, אך לא על למידה של האסוציאציה בין ה-CS ל-US כשלעצמה. אם היא ממצמצת לאחר תקופת ה-SR אך לפני מתן ה-US של השוק, הרי שהיא הפיקה תגובה מותנית.

כפי שהוזכר קודם לכן, ה-CR הוא המדד העיקרי ללמידה אסוציאטיבית. לא צפוי ש-CR יתפתח בשלבים המוקדמים של האימון, אך ככל שהאימון מתקדם לאורך ניסיונות ומפגשים רבים, סוגים אלו של תגובות הופכים לשכיחים יותר, בעלי אמפליטודה גבוהה יותר, ועשויים להיות מתואמים טוב יותר בזמן. אנו מחלקים את ה-CRs לשני סוגים: CRs כוללים ו-CRs אדפטיביים.

סה"כ ה-CRs משקפים יכולת למידה כללית, בעוד ש-CRs אדפטיביים משקפים את יכולתו של בעל החיים לתזמן את המצמוץ היטב. כדרך להכין את עצמו מיד לפני תחילת השוק, תקופת ה-CR האדפטיבית היא 200 milliseconds לפני תחילת ה-US של השוק. ביונקים עם היפוקמפוס תקין, ביטוי של CRs אדפטיביים משקף מעורבות היפוקמפלית ברמה גבוהה בתזמון נכון של המצמוץ ביחס להגשת שני הגירויים.

בשל טבעו, התנייה קלאסית של מצמוץ מסוג trace קשה הרבה יותר לרכישה מאשר התנייה קלאסית של מצמוץ מסוג delay, שבה ה-CS (צליל) וה-US (שוק) חופפים בזמן. בעוד שהביטוי של ה-CRs עשוי להשתנות מנבדק לנבדק ועלול להיפגע קשות כתוצאה מפגיעות במעגלים מוחיים ספציפיים, ה-UR צפוי להופיע בכל ניסוי שבו ה-CS וה-US הוצגו בזיווג. ככזה, מדד זה משקף ביצועים סנסורי-מוטוריים, ובדומה לתגובות בהלה, אינו מעיד על למידה של הקשר בין ה-CS ל-US כשלעצמה.

בסדרת סרטוני הווידאו הבאים, תוכלו לראות את הגדרת התוכנה ואת תחילת האימון למצמוץ של העין. תוכנת המצמוץ מופעלת ושני הקבצים הרלוונטיים נטענים: קובץ חולדה המכיל נתוני נבדק, וקובץ התניית מצמוץ מסוג trace.

התוכנית מוגדרת עד לתחילת האימון. עם תחילת האימון, שימו לב שישנו טיימר בפינה הימנית התחתונה של המסך שסופר לאחור עד לניסוי הבא. להלן הקלטה חיה של מפגש אחד, ניסוי 15, שבו מופעל UR אך טרם התפתחו CRs.

להלן השמעה חוזרת בשליש מהמהירות. בסדרת הסרטונים הבאה, תראו צילומי מסך מאותו חולדה של קבוצת ביקורת ללא אינטובציה, בעוד היא מתקדמת דרך שישה מפגשי אימון. בסופו של דבר היא פולטת הן CRs כוללים והן CRs אדפטיביים.

להלן סרטון וידאו חי של מפגש שש, ניסוי 96, שבו נפלטות שתי מצמוצי עיניים, האחד כ-CR אדפטיבי והשני כ-UR. להלן השמעה חוזרת בשליש מהמהירות. בסרטון האחרון הזה, תראו וידאו חי של חולדה עם אינטובציית אלכוהול בניסוי האחרון של מפגש שש, ניסוי של CS בלבד; אפילו לאחר 600 ניסויי אימון, היא אינה פולטת CR אדפטיבי באופן עקבי. לאחר איסוף הנתונים, הם נסרקים לאיתור ניסויים פגומים, הכוללים ארטיפקטים של רעש גבוה ופעילות EMG לא שגרתית בקו הבסיס לפני ה-CS, באמצעות אלגוריתם שגיאות מובנה לזיהוי חריגים.

ניסויים תקינים שנשמרו נותחו בהמשך עבור SRs, URs, CRs כוללים ו-CRs אדפטיביים ביחס לאחוז התגובות, לאמפליטודה, ללטנציה ולמדדים קריטיים אחרים. CRs אדפטיביים ממוצעים לאורך שישה מפגשי אימון מוצגים בסט תוצאות ראשון זה. הן מדדי האחוז והן מדדי האמפליטודה היו מובהקים סטטיסטית בין הקבוצה שקיבלה אינטובציה של אלכוהול לבין שתי קבוצות הביקורת, ממפגש שני ועד מפגש שישי.

דבר זה מעיד על כך שהתדירות והעוצמה של תגובות מותנות (CRs) אדפטיביות היו פגומות בחולדות שנחשפו לאלכוהול במהלך ההתפתחות המוקדמת. תגובות לא-מותנות ממוצעות מוצגות במערכת תוצאות שנייה זו. הן מדדי התדירות והן מדדי האמפליטודה לא היו שונים באופן סטטיסטי בין אף אחת מהקבוצות.

תוצאות אלו מעידות כי חשיפה מוקדמת לאלכוהול לא פגעה ביכולתם של החולדות למצמץ בתגובה לגירוי הבלתי מותנה, אלא שהליקוי שהפגינו נבע מכישלון ביצירת קישור תקין בין ה-CS ל-US במהלך שלב הרכישה. בניסוי זה, בחנו את הקשר בין המוח להתנהגות על ידי קביעה האם חשיפה לאלכוהול במהלך ההתפתחות, הניתנת באופן המדמה שתיית בינג', משפיעה על ההיפוקמפוס כפי שבא לידי ביטוי בליקויים בהתניה קלאסית של מצמוץ עיניים מסוג trace. ואכן, התניה קלאסית של מצמוץ עיניים היא כלי שימושי להערכת ההשלכות הנוירו-התנהגותיות הקשורות לחשיפה לאלכוהול במהלך התפתחות המוח.

השיטה היא רב-גונית מאוד, שכן על ידי שינוי פרמטרי הגירוי או דרישות הלמידה האסוציאטיבית, ניתן להעריך גם את התקינות התפקודית של מערכות מוחיות שונות מחוץ להיפוקמפוס. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של המורכבות הכרוכה במתן אלכוהול לגורי חולדה בניאונטליים, בהשתלת אלקטרודות ובביצוע הליך בדיקת המצמוץ. אנו מודים לכם על הצפייה בסרטון זה.