מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש
2 במרץ 2017
השיטה המוצגת כאן מתארת בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר תאים דמויי הפטוציטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מטריצות למינין רקומביננטיות בתנאים מוגדרים. שיטה זו מאפשרת למשתמש לייצר הפטוציטים אנושיים פונקציונליים בהתאמה אישית כדי לחקור את הביולוגיה של הכבד בצלחת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאופייה המוגדר מאפשר ייצור המוני של הפטוציטים עם רמה גבוהה של שחזור ניסיוני. כדי להתחיל בניסוי יש להפשיר 100 מיקרוגרם למיליליטר מלאי של למינין-521 רקומביננטי, או LN-521, בארבע מעלות צלזיוס.יש לדלל את ה-LN-521 המופשר ב-1xDBPS קר כקרח עם סידן מגנזיום כדי ליצור תמיסה של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד מתוך תמיסת LN-521 של חמישה מיקרוגרם למיליליטר כדי לצפות באר אחת של צלחת שש בארות, ונדנד את הצלחת כדי לפזר אותה באופן שווה בבאר. לאחר מכן, דגרו את הצלחות בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למשך שעתיים לפחות לשימוש דחוף. קח את הצלחת המצופה מהחממה למכסה המנוע של תרבית הרקמות. שאפו בזהירות את תמיסת הציפוי LN-521 מבלי לפגוע במשטח המצופה. לאחר מכן הוסף מיד מיליליטר אחד של mTeSR מחומם מראש
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה ליצירת תאים דמויי הפטוציטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מטריצות למינין רקומביננטיות. הוא מספק מערכת ניתנת להרחבה ומוכנה לתקני GMP להפקת הפטוציטים תפקודיים למחקר כבד.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- דיפרנציאציה של תאים
- ביולוגיה של תאי גזע
- מחקר כבד
רקע
- תאים דמויי הפטוציטים אנושיים הם חיוניים לחקר הביולוגיה של הכבד.
- תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים להתמיין לסוגים שונים של תאים.
- מטריצות למינין רקומביננטיות תומכות בהיצמדות ובצמיחה של תאים.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את השחזוריות במחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה יעילה כלכלית לייצור תאים דמויי הפטוציטים.
- אפשרות לייצור המוני של הפטוציטים תפקודיים.
- סיוע למחקר בביולוגיה של הכבד ובמידול מחלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפשרה ודילול של laminin-521 רקומביננטי.
- ציפוי של פלטות לתרבית תאים בתמיסת laminin.
- אינקובציה של הפלטות לקידום היצמדות תאים.
- הוספת mTeSR שחומם מראש לתרבית התאים.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של תאים דמויי הפטוציטים אנושיים.
- שחזוריות גבוהה של ייצור התאים.
- אישור של מאפיינים תפקודיים של תאים דמויי הפטוציטים.
- מערכת ניתנת להרחבה המתאימה ליישומי מחקר שונים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה להפקת הפטוציטים.
- היא תומכת במחקר כבד בסיסי ויישומי כאחד.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש במערכת זו לבדיקת תרופות ולמידול מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות דיפרנציאציה מוגדרות מפחיתות את השונות בין סדרות בייצור של תאים דמויי הפטוציטים, ובכך משפרות את השחזור עבור מודלים פרה-קליניים של הכבד. תהליכים ניתנים להרחבה (scalable) ותואמי GMP תומכים באספקה עקבית לבדיקות של חילוף חומרים של תרופות ורעילות. דבר זה נותן מענה לבקע מרכזי במעבר של הפטוציטים המופקים מתאי גזע ליישומים תעשייתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקר של מסלולים כבדיים באמצעות מודלי תאים ניתנים להרחבה ובעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מטריצות למינאן מוגדרות מצמצמות שונות, ובכך משפרות את עקביות הבדיקה בין ניסויים שונים.
- ערך ניבוי: שחזוריות גבוהה תומכת במחקרים מהימנים של מעורבות מטרה ומנגנון פעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור תאים דמויי הפטוציטים בעלי תפקוד מטבולי יציב לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תנאים מוגדרים ללא סרום מאפשרים סטנדרטיזציה בין מעבדות ואתרי ייצור.
- יכולת הרחבה: תואם לקווי hPSC למחקר ובדרגת GMP לאספקת תאים ניתנת להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: התאים מציגים פנוטיפ ותפקוד דמויי הפטוציטים ראשוניים, דבר המשפר את הנאמנות של מודל המחלה.
- ערך תפעולי: מערכת מוגדרת מפחיתה שונות בין סדרות ייצור, ובכך תומכת במחקרים המאפשרים הגשת IND.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין התמיינות תאי גזע לבין תיקוף פרה-קליני של טיפולים המכוונים לכבד.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלני על ידי אספקת מקור בר-הרחבה של הפטוציטים פונקציונליים ליישומים המשכיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות בביולוגיה של הכבד באמצעות דיפרנציאציה מוגדרת וניתנת לשחזור.
- סריקה: מאפשר ייצור סטנדרטי של תאים דמויי הפטוציטים להערכה עקבית של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדדים פונקציונליים כמותיים (למשל, albumin, urea) לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מספק רצף מדיפרנציאציה ועד למודלים פרה-קליניים של מחלות כבד ותגובה לתרופות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה מוגדרת וניתנת להרחבה התומכת בשימוש חוזר בפרויקטים ובאתרים שונים, ובכך מפחיתה את נטל האופטימיזציה החוזרת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון תחזיתי בתפקוד ההפטוציטים מפחית עמימות מכניסטית במבחנים הקשורים לכבד.
- ערך תפעולי: רכיבים מוגדרים ותהליך ללא סרום משפרים את השחזוריות ואת היכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת השונות הביולוגית בנתונים פרה-קליניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים המכוונים לכבד באמצעות מערכות מודל אמינות.
שיקולי יישום
- מומחיות בתרביות תאי גזע ובפרוטוקולי התמיינות.
- גישה למטריצות למינין רקומביננטיות ולמדיום התמיינות מוגדר.
- סטנדרטיזציה של נהלי הציפוי והדגירה בין הצוותים.
- שיקולי התאמה עבור שוורות hPSC שונות ופורמטים של הגדלת קנה מידה (scale-up).
- מגבלות כוללות את הבשלות התפקודית בהשוואה להפטוציטים ראשוניים, כפי שצוין במקור.
